Hormonal replacement therapy in posmenopausal women and neutrophils selected functions - TNF-α preactivation

Wstęp
Neutrofile w organizmie ludzkim pełnią niezwykle istotną rolę we wczesnej odpowiedzi, skierowanej przeciwko organizmom patogennym ze środowiska zewnętrznego, zjawiając się jako pierwsze komórki w miejscu toczącego się procesu zapalnego [1]. Cechuje je krótki czas życia, duża aktywność biologiczna i duża zdolność do migracji. Codziennie ok. 100 mln neutrofili opuszcza krążenie, ulegając apoptozie, a na ich miejsce trafiają nowe komórki [1].
Neutrofile wykazują zdolność do chemotaksji, adherencji, fagocytozy i destrukcji sfagocytowanych mikroorganizmów przy pomocy mechanizmów tlenowych i pozatlenowych oraz do degranulacji i uwalniania ziarnistości wewnątrzkomórkowych i produktów metabolizmu tlenowego komórki. Mogą także produkować cytokiny zapalne [1]. Są jednym z najważniejszych źródeł reaktywnych form tlenu w organizmie [1].
Funkcje neutrofili, takie jak migracja, fagocytoza, degranulacja, wytwarzanie reaktywnych form tlenu podlegają regulacji pod wpływem różnych mediatorów [1]. Jednym z takich mediatorów jest TNF-α. TNF-α – czynnik martwicy guzów (ang. tumor necrosis factor) jest białkiem o masie 17 000 daltonów, w skład którego wchodzi 157 aminokwasów. Nazwa tej cytokiny wywodzi się z badań, prowadzonych przez Carswella [2], który wykrył jej obecność w osoczu zwierząt po podaniu endotoksyny. Uważano początkowo, że jest to czynnik wywołujący martwicę nowotworów, wytwarzany przez komórki jednojądrzaste pod wpływem mediatorów zapalenia lub mitogenów [3]. Z dalszych osiągnięć badawczych dotyczących TNF-α należy wspomnieć o ustaleniu sekwencji aminokwasów wchodzących w jego skład oraz zmapowaniu jego genu w 6. parze chromosomów [4].
TNF-α pełni w organizmie ludzkim rolę mediatora wielu procesów zarówno fizjologicznych, jak i patologicznych. Cytokina ta spełnia bardzo ważną rolę w reakcjach procesu zapalnego. Jest jednym z najsilniejszych modyfikatorów funkcji neutrofili [1, 5]. Ma zdolność indukcji aktywności cytostatycznej i cytotoksycznej neutrofili w stosunku do komórek nowotworowych [6].
Stwierdzono, że pod bezpośrednim wpływem TNF-α dochodzi do zwiększonej ekspresji receptorów integrynowych neutrofila, nasilenia fagocytozy oraz do niewielkiego wzmocnienia wybuchu oddechowego [7].
Termin priming został wprowadzony w 1984 r. przez Guthrie i wsp. [8] do określenia zjawiska wzrostu generacji wolnych rodników przez stymulowane neutrofile po uprzedniej ich preinkubacji z lipolisacharydami. Ten sam termin został zastosowany w odniesieniu do wzmożonej odpowiedzi neutrofili na stymulatory, obserwowanej po preaktywacji czynnikiem pochodzącym z aktywowanych komórek jednojądrzastych [9]. Czynnik ten został wyizolowany i zidentyfikowany jako TNF-α [3]. Późniejsze badania potwierdziły zdolność TNF-α do preaktywacji neutrofili, tzw. primingu. W wyniku preaktywacji neutrofili przy użyciu tej cytokiny, w odróżnieniu od działania bezpośredniego, dochodziło do wzmożonej ich odpowiedzi na następny bodziec.
Opisano zwiększenie wybuchu tlenowego po inkubacji neutrofili z TNF-α i fMLP [7]. Inne badania potwierdzały, że TNF-α sam nie aktywował wytwarzania reaktywnych form tlenu i nie nasilał agregacji i degranulacji, ale preinkubacja neutrofili z TNF-α nasilała znacznie odpowiedź komórek na stymulatory (np. fMLP). Stwierdzono, że efekt preaktywacji zależał od stężenia TNF-a, czasu preinkubacji i temperatury otoczenia [10]. Wiles [11] opisał znaczne zwiększenie poziomu wybuchu tlenowego indukowanego fMLP, C5a, opsonizowanym zymosanem po preinkubacji neutrofili z TNF-α. Neutrofile preinkubowane z TNF-α, w porównaniu do GM-CSF, G-CSF i IL-8 wykazywały największy poziom wybuchu oddechowego po stymulacji fMLP. Jednocześnie preaktywacja przez TNF-α najbardziej zwiększała intensywność wiązania fMLP ze swoistym receptorem na neutrofilu [12].
TNF-α łączy się na powierzchni komórki z receptorami TNF-R (p55, CD120a i p75, CD120b). Badania Zemana i wsp. [1] dostarczają wielu informacji o roli wyżej wymienionych receptorów. Mechanizm transdukcji sygnału na tej drodze receptorowej jest słabo poznany. Przypuszczalnie dochodzi do wzrostu aktywności oksydazy NAD (P) H oraz poprzez jądrowe czynniki transkrypcyjne NF-KB do zmiany transkrypcji genów szeregu biologicznie ważnych mediatorów wtórnych, m.in. IL-1, 6, 8 oraz czynników: PAF, NGF, TGF-β, LTB4, GM-CSF, G-CSF. Dochodzi także do wzrostu ekspresji receptorów powierzchniowych, takich jak integryny CD11/CD14 [13, 14].
Cel pracy
Ocena wpływu złożonej ciągłej hormonalnej terapii zastępczej u kobiet po menopauzie na preaktywację (priming) TNF-α neutrofili krwi obwodowej.
Metodyka
Badaną grupę stanowiło 46 kobiet w okresie pomenopauzalnym, będących pacjentkami Poradni Kliniki Ginekologii i Chorób Menopauzy ICZMP w Łodzi. Średni wiek w badanej grupie wynosił 54,0±5,1 lat, średni wiek wystąpienia menopauzy 49,1±3,5 lat, a średni czas od wystąpienia menopauzy 5,0±4,1 lat.
Kryteriami wykluczającymi były istnienie przeciwwskazań do hormonalnej terapii zastępczej, ostre lub przewlekłe choroby zapalne, cukrzyca, stosowanie leków o właściwościach antyoksydacyjnych i HTZ w okresie ostatnich 6 mies.
Na wykonywanie badań uzyskano zgodę Komisji Etyki Badań Naukowych przy Akademii Medycznej w Łodzi.
Pacjentki zakwalifikowano do hormonalnej terapii zastępczej. Zastosowano HTZ doustną zawierającą 17beta-estradiol i octan norethisteronu.
Efekt antyoksydacyjny HTZ określano, porównując generację reaktywnych form tlenu przez neutrofile krwi obwodowej pacjentek, ocenianą na podstawie pomiaru chemiluminescencji (CL) w czasie tzw. wybuchu tlenowego tych komórek przed rozpoczęciem hormonalnej terapii zastępczej oraz po 3 i po 6 mies. stosowania tej terapii. Do wywołania wybuchu tlenowego neutrofili zastosowano następujące stymulatory: formylo-metionylo-leucylofenyloalaninę (fMLP), octan mirystynianu forbolu (PMA) i zymosan firmy Sigma-Aldrich. Jako wzmacniacza chemiluminescencji bezpośredniej użyto luminolu (Sigma-Aldrich). Do preaktywacji (primingu) neutrofili używano rekombinowanego ludzkiego TNF-α (5x10⁷ U/mg) (Sigma-Aldrich). Płyn PBS (fizjologiczny roztwór NaCl zbuforowany fosforanami) pochodził z firmy Biomed.
Pomiaru chemiluminescencji dokonywano przy użyciu aparatu LUMINOMETR 1251 (Pharmacia LKB). Badania przeprowadzano w stałej temperaturze 37^oC±0,1. Luminometr w ciągu 30 min dokonywał 15 pomiarów. Każdą serię pomiarów wykonywano na 4 próbkach krwi, powtarzając ją 2-krotnie. Na podstawie wyników pomiarów obliczano parametry chemiluminescencji: a) pole powierzchni pod krzywą emisji w funkcji czasu, liczoną w ciągu 30 min, wyrażające całkowitą ilość energii wyemitowaną przez komórki w czasie pomiaru), b) maksimum krzywej emisji. Oceniano chemiluminescencję spontaniczną (BS) i stymulowaną fMLP, PMA i zymosanem neutrofili. Próbki, w których oceniano wybuch tlenowy neutrofili spoczynkowych zawierały: 20 ml krwi pełnej, 20 ml luminolu, 20 ml PBS (BS), lub 20 ml fMLP (2x10^-6 M/ml), lub 20 ml PMA (2x10^-8 M/ml) lub 30 (l zymosanu (10 mg/ml), PBS do łącznej objętości 1 000 ml. Próbki, w których oceniano wybuch tlenowy neutrofili preaktywowanych były inkubowane przez 30 min z TNF-a (10 ng/ml) przed dodaniem stymulatorów.

Do oceny istotności zmian wartości parametrów chemiluminescencji w czasie stosowania HTZ zastosowano metody analizy wariancji dla zmiennych zależnych.
Wyniki
Stosunek pól pod krzywymi CL i stosunek pików CL neutrofili preaktywowanych, będące miarą preaktywacji (primingu) również uległy zmniejszeniu po 3 mies. stosowania HTZ w sposób statystycznie istotny dla wszystkich stymulatorów (p<0,0005).
Priming neutrofili niestymulowanych i stymulowanych fMLP, PMA i zymosanem, oceniany na podstawie stosunku całkowitych energii CL neutrofili preaktywowanych i spoczynkowych, zmniejszył się średnio po 3. stosowania HTZ odpowiednio o 13, 30,4, 30,9 i 27,9%, a po 6 mies. średnio o 16, 28,9, 29,9 i 27,4% (p<0,0005).
Dyskusja
Analizując parametry chemiluminescencji zarówno neutrofili spoczynkowych, jak i preaktywowanych możliwa stała się ocena wpływu HTZ na priming neutrofili TNF-α. Wykazano, że już 3-miesięczne stosowanie hormonoterapii zastępczej powoduje zmniejszenie zjawiska primingu neutrofili. Stwierdzona zależność nie znajduje odniesień w piśmiennictwie.
W dostępnej literaturze można znaleźć jedynie prace poświęcone badaniu poziomów TNF-α u kobiet po menopauzie, jak i wpływowi hormonalnej terapii zastępczej na te poziomy.
Brooks-Asplund i wsp. stwierdzili 2-krotny wzrost stężeń TNF-a po zastosowaniu zarówno terapii estrogenowej, jak i estrogenowo-gestagenowej [15].
Podobnie w badaniach Porter i wsp. w grupie 27 kobiet pomenopauzalnych, stosujących HRT estrogenowo-gestagenową, poziomy TNF-α były wyższe niż w grupie kobiet niestosujących tej terapii [16].
Zupełnie przeciwstawne wyniki uzyskali Bernard-Poenaru i wsp., którzy w swoich badaniach odnotowali statystycznie istotny spadek wydzielania TNF-a przez komórki krwi obwodowej po 6 mies. stosowania HTZ [17].
Zmniejszenie produkcji wybranych cytokin pod wpływem 17β-estradiolu, w tym również TNF-α, uzyskano także w badaniach in vitro prowadzonych na hodowlach monocytów [18].
Wspomniane wyżej prace dostarczają sprzecznych wyników odnośnie wytwarzania TNF-α u kobiet w okresie pomenopauzalnym stosujących HRT w porównaniu do kobiet bez tej terapii. O wiele bardziej wartościowe wydają się być badania mające na celu ocenę skutków działania tej cytokiny na wybrane komórki.
Zmniejszony priming neutrofili TNF-α po zastosowaniu hormonalnej terapii zastępczej jest z jednej strony zjawiskiem korzystnym, ponieważ zmniejsza generację reaktywnych form tlenu przez te komórki, które to związki wykazują dobrze znane cytotoksyczne, mutagenne i rakotwórcze właściwości w starzejącym się organizmie.
Z drugiej strony, zmniejszenie primingu neutrofili może powodować upośledzenie reakcji odpornościowych organizmu, a także zahamowanie apoptozy nieprawidłowych, zmutowanych komórek.
Piśmiennictwo
1. Zeman K. The role for tumour necrosis factor-a in the induction of human polypolymorphonuclear neutrophil chemiluminescence. Immunol Lett 1996; 53: 45-50.
2. Carswell EA, Old LJ, Kassel RL, et al. An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumors. Proc Natl Acad Sci USA 1975; 72: 3666-70.
3. Aggarwal BB, Kohr WJ, Haas PE. Human tumour necrosis factor production, purification and characterisation. J Biol Chem 1985; 260: 2345-54.
4. Spies T, Morton CC, Nedospasov. Genes for the tumor necrosis factor a and b are linked to human major histocompatybility complex. Proc Natl Acad Sci USA, 1986; 83: 8699-8708.
5. Smith JA. Neutrophils, host defense, and inflammation: a double-edged sword. J Leukocyte Biol 1994; 56: 672-91.
6. Frei B. Reactive oxygen species and antioxidant vitamins: Mechanism of action. Mer J Med 1994; 97: Supl 3A: S5.
7. Perusia B, Kobayashi M, Rossi ME, et al. Immune interferon enhances functional properties of human granulocytes: role of Fc receptors and effect of lymphotoxin, tumor necrosis factor and granulocyte-macrophage stimulating factor. J Immunol 1987; 138: 765-74.
8. Guthrie LA, McPhail LC, Henson PM, et al. Priming of neutrophils for enhanced release of oxygen metabolites by bacterial lipopolysaccharide: evidence for increased activity of the superoxide-producing enzyme. J Exp Med 1984; 160: 1656-71.
9. Cross AS, Lowell GH, Palmblad JC, et al. Mechanism of priming of human neutrophils by a soluble lymphoblastic cell factor. J Immunol 1985; 135: 2074-9.
10. Ogle JD, Noel JG, Sramkoski RM. Adhesive effect of certain cytokines and other perturbants on human neutrophils. Inflammation 1992; 16: 603-12.
11. Wiles ME, Dykens JA, Wright CD. Human neutrophil (PMN) oxygen radical production and cytoskeleton. Life Sci 1995; 57: 1533-46.
12. Elbim C, Bailly S, Chollet-Martin E, et al. Differential priming effects of proinflammatory cytokines on human neutrophil oxidative burst in response to bacterial N-formyl peptides. Infect. Immun 1994; 62: 2195-201.
13. Buttke TM, Sandstrom PA. Oxidative stress as a mediator of apoptosis. Immunol Today 1994; vol. 15, No 1: 7-10.
14. Tchórzewski H. Zapalenie – początek czy koniec choroby? Alergia Astma Immunologia 1996; 1: 29-34.
15. Brooks-Asplund EM, Tupper CE, Daun JM, et al. Hormonal modulation of interleukin-6, tumor necrosis factor and associated receptor secretion in postmenopausal women. Cytokine 2002; 19 (4): 193-200.
16. Porter VR, Greendale GA, Schocken M, et al. Immune effects of hormone replacement therapy in post-menopausal women. Exp Gerontol 2001; 36 (2): 311-26.
17. Bernard-Poenaru O, Roux C, Blanque R, et al. Bone-resorbing cytokines from peripheral blood mononuclear cells after hormone replacement therapy: a longitudinal study. Osteoporos Int 2001; 12 (9): 769-76.
18. Rogers A, Eastell R. The effect of 17beta-estradiol on production of cytokines in cultures of peripheral blood. Bone 2001; 29 (1): 30-4.
Adres do korespondencji
Klinika Ginekologii i Chorób Menopauzy
Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki
ul. Rzgowska 281/289
93-338 Łódź
tel. +48 42 271 15 07
e-mail: kgcm@interia.pl