Human endogenous retroviruses sequences expression in patients with progressive systemic sclerosis and different clinical forms of psoriasis

Adres do korespondencji: mgr inż. Jakub Namysł, Katedra i Klinika Dermatologii, Akademia Medyczna, ul. Przybyszewskiego 49,
60-355 Poznań


Wprowadzenie
Trwające od wielu lat badania, mające na celu odczytanie ludzkiego genomu pozwoliły w ostatnim czasie z dużą dokładnością oszacować udział w nim tzw. elementów ruchomych (ang. transposable elements). Okazało się, że stanowią one niemal połowę genomu (ok. 45%), z czego ogromna większość to retroelementy (42,2%). Pozostała część przypada na transpozony (2,8%). Podczas gdy DNA-transpozony amplifikują bez pośrednictwa RNA, dla retroelementów matrycę stanowią fragmenty RNA, wymagające odwrotnej transkrypcji, zanim ulegną integracji z genomem [1–4].
Klasyfikacja retroelementów opiera się na istnieniu bądź braku w ich strukturze tzw. sekwencji LTR (ang. long terminal repeats). Retroelementy nieposiadające sekwencji LTR (ok. 34% genomu) zwykle występują w genomie w olbrzymiej liczbie powtórzeń. W zależności od długości sekwencji, podzielono je na tzw. krótkie i długie elementy rozproszone bądź porozrzucane (ang. short and long interspersed elements/repeats; SINE, LINE). Długość sekwencji SINE waha się na ogół w granicach 80–630 bp, podczas gdy LINE osiągają przeciętnie 6–8 kbp. Pierwsze z nich nie posiadają zdolności kodowania białek, więc ich amplifikacja jest zależna od obecności LINE [5]. Wśród retroelementów wyposażonych w sekwencje LTR (>8% genomu) przeważają ludzkie endogenne retrowirusy (ang. human endogenous retroviruses; HERV), których długość osiąga 9–10 kbp i jest na ogół znacznie mniejsza od długości sekwencji wirusów patogennych [3, 5]. Obecność sekwencji LTR, dzięki właściwościom promotorowym polegającym na wiązaniu odpowiednich białek komórkowych, umożliwia inicjację transkrypcji i zapewnia jej regulację. W regulacji transkrypcji biorą m.in. udział tzw. wzmacniacze (ang. enhancer), które włączone w strukturę sekwencji LTR zapewniają tkankową specyficzność ekspresji, zachowując aktywność tylko w określonych rodzajach komórek, tkanek czy też włączając się w konkretnej fazie cyklu komórkowego [6].

W haploidalnym genomie ludzkim sekwencje HERV występują najczęściej w kilkudziesięciu powtórzeniach, choć ich liczba waha się w granicach od jednej do kilku tysięcy kopii. Sekwencje te są dziedziczone zgodnie z prawami Mendla. Prawdopodobnie stanowią one pozostałości prehistorycznych infekcji wirusami egzogennymi, które na skutek nagromadzenia różnego rodzaju mutacji stały się replikacyjnie nieczynne, dzięki trwającym 60 mln lat procesom rekombinacyjnym. Pomimo uszkodzeń struktury, często rozległych delecji czy też istnienia rozmaitych wtrętów, cechą charakterystyczną HERV jest obecność 3 genów kodujących białka niezbędne w cyklu życiowym wirusa: gag i env – kodujących białka konieczne do syntezy prawidłowego wirionu oraz pol – konieczne do przeprowadzenia odwrotnej transkrypcji [4, 7–8]. Opisaną wyżej, typową strukturę ludzkiego wirusa endogennego przedstawia schemat na ryc. 1.
Jakkolwiek większość retrowirusów nie wywołuje zmian patogennych, od lat w wielu jednostkach chorobowych opisuje się ich aktywność transkrypcyjną. Jak się wydaje, problem dotyczy głównie nowotworów, co potwierdzano wielokrotnie zarówno w badaniach in vivo, jak i w oparciu o hodowle komórek rakowych in vitro [9–18].
Od lat trwają dyskusje dotyczące udziału sekwencji ludzkich endogennych retrowirusów w mechanizmach prowadzących do rozwoju schorzeń o podłożu autoimmunizacyjnym. Większość prac dotyczy tocznia rumieniowatego układowego (ang. systemic lupus erythematosus – SLE), jednak liczne doniesienia wskazują na pośrednie dowody udziału HERV w patogenezie także innych chorób z tej grupy, takich jak stwardnienie rozsiane, cukrzyca typu I, łysienie plackowate, zespół Sjögrena czy twardzina układowa i in. Coraz częściej do tej grupy zalicza się również łuszczycę z jej odmianami [6, 8, 19–22].
Obecnie uważa się, że jednym z czynników determinujących procesy towarzyszące twardzinie układowej (ang. progressive systemic sclerosis – PSS) jest autoimmunologiczna odpowiedź na bliżej nieokreślony antygen. Podstawowym mechanizmem patogennym twardziny jest postępujące włóknienie tkanki łącznej w skórze i narządach wewnętrznych, wywołane nadmiernym wytwarzaniem kolagenu [23].
Łuszczyca natomiast jest zapalną dermatozą o przewlekłym charakterze, której etiopatogeneza nie została jeszcze wyjaśniona. Trwające badania nad czynnikami genetycznymi odgrywającymi istotną rolę w łuszczycy sugerują ich powiązanie z układem HLA, co prawdopodobnie wskazuje na autoimmunizacyjną naturę schorzenia [24, 25].
Cel pracy
Celem pracy była identyfikacja podlegających ekspresji sekwencji retrowirusów endogennych u chorych z twardziną układową, łuszczycą zwykłą i stawową oraz w grupie kontrolnej zdrowych osób, a także ilościowe określenie poziomu ekspresji analizowanych sekwencji HERV i porównanie go w poszczególnych grupach badawczych.
Materiał i metody
Badaną grupę stanowili pacjenci z rozpoznaną twardziną układową (20 osób), łuszczycą zwykłą (Psoriasis vulgaris – PV, 10 osób) oraz łuszczycą stawową (Psoriasis arthropatica – PA, 10 osób). Grupę kontrolną stanowiło 10 zdrowych ochotników (dawców, OZ).

W badaniach wykorzystano krew obwodową, pobieraną jałowo do probówko-strzykawek zawierających
EDTA (Monovette, Sarstedt). Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (ang. peripheral blood mononuclear cells, PBMC) pozyskiwano poprzez wirowanie w gradiencie gęstości Fikolu (Ficoll-Histopaque 1,007 g/cm³, Sigma Diagnostics, Inc. St. Louis, USA).
Całkowite komórkowe RNA izolowano z PBMC zgodnie z metodą opisaną przez Chomczyńskiego i wsp. Wszystkie preparaty poddawano trawieniu DNA-ząI (Promega Co. Madison, USA) w celu uniknięcia zanieczyszczeń DNA genomowym, a następnie poddawano odwrotnej transkrypcji (ang. reverse transcription – RT), wykorzystując zestaw dostępny komercyjnie
(Enhanced Avian HS RT-PCR Kit, Sigma Co. St. Louis, USA). Uzyskane po odwrotnej transkrypcji preparaty cDNA amplifikowano w czasie rzeczywistym przy użyciu techniki ilościowej analizy ekspresji w czasie rzeczywistym – Real Time Quantitative PCR. Do badań użyto systemu Light Cycler (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Niemcy) oraz zestawu QuantiTectTM SYBR^® Green PCR Kit (Qiagen). Analizie poddano wybrane fragmenty sekwencji gag oraz env o długości 100–105 bp. Primery, którymi posłużono się w doświadczeniach, wraz z sekwencjami bazowymi oraz numerami dostępowymi światowych baz danych GeneBank i Ensembl, z których pochodzą, przedstawiono w tab. 1.

Reakcję amplifikacji prowadzono w mieszaninie zawierającej 1 ml cDNA uzyskanego po RT dodanym do 9 ml gotowego QuantiTect^TM SYBR^® Green PCR Master Mix (Qiagen), zawierającego polimerazę DNA HotStartTaq, bufor reakcyjny, mieszaninę dNTP, barwnik fluorescencyjny SYBR Green I, 2,5 mMol MgCl₂ oraz odpowiednie primery (IDT).
Ilościowego określenia liczby kopii badanych transkryptów dokonano na podstawie krzywej standardowej sporządzonej dla prób syntetycznego DNA o znanych stężeniach. Uzyskane wyniki wyrażono w liczbie kopii w przeliczeniu na milion kopii transkryptu genu GAPDH (dehydrogenaza gliceraldehydo-3-fosforanowa), jako genu podstawowego metabolizmu komórkowego (ang.
housekeeping gene).
Wyniki i wnioski
Wyniki pokazujące poziom ekspresji badanych sekwencji ludzkich retrowirusów endogennych wyrażone względną liczbą kopii ich transkryptów przedstawiają tab. 2.–4. Zawarto w nich również średnie dla poszczególnych grup badawczych, wykorzystane przy konstruowaniu wykresów (ryc. 2.) i uwzględnione we wnioskach.
w Uzyskane wyniki pozwalają stwierdzić obecność transkryptów env HERV W i gag HERV K10 u chorych na twardzinę układową oraz łuszczycę zwykłą i stawową.
w Obecność transkryptów gag HERV E wykazano u chorych z twardziną i łuszczycą stawową, nie stwierdzono ich u osób z łuszczycą zwykłą.
w Po raz pierwszy zaobserwowano podwyższenie poziomu ekspresji sekwencji gag HERV E w limfocytach krwi obwodowej pacjentów z PSS i PA w porównaniu z grupą kontrolną osób zdrowych.
- Także po raz pierwszy zaobserwowano podwyższenie poziomu ekspresji sekwencji env HERV W oraz gag HERV K10 w limfocytach krwi obwodowej pacjentów wszystkich grup. Ekspresja tych sekwencji u osób zdrowych była wyraźnie niższa.
- W grupie chorych na łuszczycę zwykłą zaobserwowano najwyższy w porównaniu z pozostałymi grupami poziom transkryptów env HERV W oraz gag HERV K10, przy jednoczesnym braku w tej grupie ekspresji sekwencji gag HERV E.
- Największe różnice średnich poziomów ekspresji stwierdzono - przypadku sekwencji gag HERV E – wyniki w poszczególnych grupach badawczych różniły się rzędem wielkości. W przypadku dwóch pozostałych sekwencji średnie wyniki, mimo wyraźnych różnic, mieściły się w jednym rzędzie
wielkości.
- U osób zdrowych poziom ekspresji wszystkich wymienionych sekwencji był znacznie niższy.
Omówienie
Regiony promotorowe genów retrowirusów endogennych, podobnie do analogicznych sekwencji wirusów egzogennych, zawierają miejsca wiążące dla wielu rozmaitych czynników transkrypcyjnych, biorących udział w ekspresji genów odpowiedzialnych za reakcje zapalne. Fakt ten może sugerować uznanie ekspresji HERV raczej za odpowiedź na toczący się proces chorobowy, a nie na jego przyczynę [8]. Z drugiej jednak strony liczne zespoły badawcze od lat dostarczają dowodów na współistnienie (współdziałanie?) transkryptów różnych HERV z innymi czynnikami biorącymi udział w rozmaitych mechanizmach chorobowych. W grupie chorób autoimmunizacyjnych doniesienia te dotyczą głównie SLE, stwardnienia rozsianego, cukrzycy typu I, łysienia plackowatego czy zespołu Sjögrena. Znacznie mniej publikacji porusza temat twardziny układowej czy łuszczycy [6, 8, 19–22].
Przedstawione w pracy wyniki mogą sugerować związek badanych sekwencji HERV z etiopatogenezą twardziny układowej i łuszczycy. Konieczne są jednakże dalsze badania, a w szczególności znaczne rozszerzenie liczebności badanych grup. Wskazane wydaje się także zwiększenie liczby sekwencji wytypowanych do analizy w badanych grupach, co prawdopodobnie pozwoli na wykazanie większej liczby kontrastów w profilu ekspresji ludzkich endogennych sekwencji retrowirusowych w kręgu chorób tkanki łącznej, których przyczyny upatrujemy w zjawiskach związanych z autoagresją. Włączenie do badań analizy ekspresji genów kodujących wybrane cytokiny, których udział w patogenezie omawianych schorzeń jest postulowany czy wręcz potwierdzony, pozwoliłoby na dokładniejsze rozumienie problemów autoimmunizacji i znacznie bardziej uprawnione wnioskowanie w tej trudnej materii.
Ekspresję sekwencji retrowirusów endogennych potwierdza się prawdopodobnie równie często w zdrowych, jak i zmienionych chorobowo tkankach. Pojawianie się transkryptów HERV zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i w wielu różnych patologiach znacznie utrudnia wnioskowanie na temat ich potencjalnej roli w mechanizmach chorobowych. Fakt symbiotycznej egzystencji HERV w genomach wszystkich ssaków i wciąż niewyjaśnionej ich funkcji narzuca spojrzenie na rolę endowirusów z dużo szerszej perspektywy. Oprócz podobieństwa do wirusów zakaźnych – strukturalnego, a niekiedy i funkcjonalnego – należy pamiętać o ich zdolności przetrwania. Mimo wielu milionów lat ewolucji, ciągłej rekombinacji i narażenia na mutacje, HERV pozostają w utajeniu, licznie wbudowane w genomy. Mimo że ciągle nie potrafimy jednoznacznie zdefiniować ich funkcji, nie mamy odwagi stwierdzić, że są zbędne.
Piśmiennictwo
1. Deininger PL, Batzer MA: Mammalian ratroelements. Genome Res 2002; 12: 1455-65.
2. van de Lagemaat LN, Landry JR, Mager DL, et al.: Transposable elements in mammals promoteregulatory variation and diversification of genes with specialized functions. Trends Genet 2003; 19: 530-6.
3. Bannert N, Kurth R: Retroelements and the human genome: New perspectives on an old relation. Proc Natl Acad Sci 2004; 101: 14572-9.
4. Kubiatowski T, Gąsowska-Giszczak U, Grabek-Gawłowicz M i wsp.: Endogenne sekwencje retrowirusowe obecne w genomie człowieka. Post Hig Med Dośw 1998; 52 (3): 223-35.
5. Medstrand P, van de Lagemaat LN, Mager DL: Retroelements distributions in the human genome: variations associated with age and proximity to genes. Genome Res 2002; 12: 1483-95.
6. Urnowitz HB, Murphy WH: Human endogenous retroviruses: nature, occurence, and clinical implications in human desease. Clin Microb Rev 1996; 9 (1): 72-99.
7. Ryan FP: Human endogenous retrowiruses in health and disease: a symbiotic perspective. J R Soc Med 2004; 97: 560-5.
8. Portis JL: Perspectives on the role of endogenous human retrowiruses in autoimmune diseases. Virology 2002; 296: 1-5.
9. Andersson A, Svensson A, Rolny C, et al.: Expression of human endogenous retrovirus ERV3 (HERV-R) mRNA in normal and neoplastic tissues. Int J Oncol 1998; 12: 309-13.
10. Herbst H, Kuhler-Obbarius C, Lauke H, et al.: Human endogenous retrovirus (HERV)-K transcripts in gonadoblastoma-derived germ cell tumours. Virchows Arch 1999; 434: 11-5.
11. Sauter M, Schommer S, Kremmer E, et al.: Human endogenous retrovirus K10: expression of gag protein and detection of antibodies in patients with seminomas. J Virol 1995; 69: 414-21.
12. Löwer R, Löwer J, Tondera-Koch C, et al.: A general method for identification of transcribed retrovirus sequences (R-U5 PCR) reveals the expression of the human endogenous retrovirus loci HERV-H and HERV-K in teratocarcinoma cells. Virology 1993; 192: 501-11.
13. Depil S, Roche C, Dussart P, et al.: Expression of human endogenous retrovirus, HERV-K, in the blood cells of leukemia patients. Leukemia 2002; 16: 254-9.
14. Yi J-M, Kim H-M, Kim H-S: Molecular cloning and phylogenetic analysis of new human endogenous retrovirus HERV-W family in cancer cells. Curr Microbiol 2002; 44: 216-20.
15. Kempf W, Kadin ME, Dvorak AM, et al.: Endogenous retroviral elements, but not exogenous retroviruses, are detected in CD30-positive lymphoproliferative disorders of the skin. Carcinogenesis 2003; 24 (2): 301-6.
16. Yi J-M, Kim H-M, Kim H-S: Expression of the human endogenous retrovirus HERV-W family in various human tissues and cancer cells. J Gen Virol 2004; 85: 1203-10.
17. Depil S, Roche C, Dussart P, et al.: Expression of a human endogenous retrovirus, HERV-K, in the blood cells of leukemia patients. Leukemia 2002; 16: 254-9.
18. Wang-Johanning F, Frost AR, Johanning GL, et al.: Expression of human endogenous retrovirus K envelope transcripts in human breast cancer. Clin Cancer Res 2001; 7: 1553-60.
19. Marguerat S, Wang WY, Todd JA, et al.: Association of human endogenous retrovirus K-18 polymorphisms with type 1 diabetes. Diabetes 2004; 53: 852-4.
20. Magistrelli C, Samoilova E, Agarwal RK, et al.: Polymorphic genotypes of the HRES-1 human endogenous retrovirus locus correlate with systemis lupus erythematosus autoreactivity. Immunogenetics 1999; 49: 829-34.
21. Christensen T, Dissing Sřrensen P, RiemannH, et al.: Molecular characterization of HERV-H variants associated with multiple sclerosis. Acta Neurol Scand 2000; 101: 229-38.
22. Herrmann M, Neidhart M, Gay S, et al.: Retrovirus-associated rheumatic syndromes. Curr Opin Rheum 1998; 10: 347-54.
23. Johnson RW, Tew MB, Arnett FC: The genetics of systemic sclerosis. Curr Rheumatol Rep 2002; 4: 99-107.
24. Bos JD, De Rie MA: The pathogenesis of psoriasis: immunological facts and speculations. Immunol Today 1999; 20: 40-6.
25. Mallon E, Young D, Bunce M, et al.: HLA-Cw*0602 and
HIV-associated psoriasis. Br J Dermatol 1998; 139: 527-33.