Immunohistochemical assessment of markers used for detection of lymph node micrometastases in patients with colorectal carcinoma

Wstęp

Obecność przerzutów w regionalnych węzłach chłonnych jest jednym z najważniejszych negatywnych czynników prognostycznych u chorych leczonych z powodu raka jelita grubego [1–7].
Wyróżnia się 2 rodzaje przerzutów komórek nowotworowych: mikroprzerzuty (<2 mm) i makroprzerzuty (>2 mm) [7]. Według International Union Against Cancer (IUAC) komórki nowotworowe, które mogą nie być dostrzeżone przez patologa oceniającego preparaty z węzłów chłonnych, barwionych rutynowo H+E, powinno nazywać się izolowanymi komórkami nowotworowymi (ITC).
Badania immunohistochemiczne poprawiły możliwości wykrycia w węzłach chłonnych mikroprzerzutów, a nawet pojedynczych komórek nowotworowych.
Uwaga wielu badaczy jest skupiona na węzłach wartownikach, które są analizowane pod kątem obecności przerzutowych komórek nowotworowych [8–10]. W niektórych doniesieniach zwraca się jednak uwagę, że ograniczenie analizy do węzłów wartowników nie może zastąpić sprawdzenia przez patologa wszystkich uzyskanych węzłów chłonnych [11]. Sugeruje się, że za pomocą badań immunohistochemicznych można wykryć jedną komórkę nowotworową pośród nawet 100 tys. limfocytów [7].


Materiał i metody

Osoby badane
Analizie retrospektywnej poddano wszystkie bloczki parafinowe węzłów chłonnych pochodzących od 50 chorych z rakiem okrężnicy lub odbytnicy, leczonych w Centrum Onkologii w Bydgoszczy w latach 2003–2006. Pacjenci z rakiem odbytnicy zostali poddani wstępnej radioterapii. W żadnym z preparatów węzłów chłonnych w rutynowym barwieniu H+E nie stwierdzono przerzutów raka. Do sprawdzenia wiarygodności zastosowanych barwień, guzy badanej grupy pacjentów zostały poddane analizie immunohistochemicznej. Średnia wieku pacjentów wyniosła 59 lat (44–69 lat); średnia liczba uzyskanych węzłów to 11 (7–15). Łącznie uzyskano 570 węzłów, które stanowiły przedmiot badań.

Immunohistochemia
Z każdego bloczka parafinowego węzła chłonnego cięto z dwóch głębokości po 2 skrawki grubości 5 µm. Były one nakładane na szkiełka podstawowe adhezyjne po 2 na każdym. Następnie podlegały standardowej procedurze umieszczenia w termostacie komorowym w temperaturze 60°C przez 2 godz. Potem były odparafinowywane w ksylenie i uwadniane w alkoholach o malejącym stężeniu. Aktywność endogennej peroksydazy hamowano 1-procentowym roztworem nadtlenku wodoru przez 10 min. Badania wykonano za pomocą metody EnVision z wykorzystaniem monoklonalnych przeciwciał firmy Dako: CK AE1/AE3 (M3515, 1:100), CK 20 (M7019, 1:200), CEA (M7072, 1:200), EMA (M0613, 1:500). Inkubacja z przeciwciałami trwała 30 min. W przypadku CK AE1/AE3, CK 20, CEA determinanty antygenowe odkrywano enzymatycznie 0,1% roztworem pepsyny przez 10 min. Natomiast przeciwciało EMA nie wymagało odsłaniania determinant. Do wizualizacji użyto odczynnika EnVision+HRP (Dako, K4001) – 30 min. Chromogenem była diaminobenzydyna (Dako, K3468). Jądra komórkowe zostały podbarwione hematoksyliną. Na koniec preparaty odwodniono w szeregu alkoholi o wzrastającym stężeniu i prześwietlono w ksylenie.

Wyniki
Za pomocą metody immunohistochemicznej wykazano obecność mikroprzerzutów w 3 węzłach chłonnych pobranych od 2 pacjentów z rakiem odbytnicy, poddanych wstępnej radioterapii. Mikroprzerzuty stwierdzono na skrawkach pochodzących tylko z jednej głębokości węzła. W rutynowym barwieniu H+E nie zostały one dostrzeżone przez patologa. Przerzutowe komórki nowotworowe w trzech ww. węzłach chłonnych wykazały pozytywne barwienie przeciwciałem CK AE1/AE3 (ryc. 1. i 2.), natomiast negatywne na obecność CK 20, CEA, EMA. Autorzy niniejszej pracy określili te przypadki jako grupę pacjentów z mikroprzerzutami. Spośród 50 pacjentów u 2 (4%) wykazano pozytywne barwienie koktajlem cytokeratyn CK AE1/AE3. Stwierdzono je w 3 (0,53%) z 570 węzłów chłonnych. Pozostali pacjenci zostali określeni jako grupa bez mikroprzerzutów do regionalnych węzłów chłonnych.

Dyskusja
Barwienia immunohistochemiczne były wykorzystywane do identyfikacji mikroprzerzutów w różnych nowotworach złośliwych [12–15]. W tym celu używano wielu przeciwciał monoklonalnych i poliklonalnych. Autorzy niniejszej pracy w badaniach posłużyli się 4 przeciwciałami monoklonalnymi: CK AE1/AE3, CEA, CK20, EMA. Pierwsze i ostatnie przeciwciało są użytecznymi narzędziami do identyfikacji szerokiego przekroju nowotworów nabłonkowych. Natomiast CEA i CK20 są szczególnie przydatne do klasyfikowania raków pochodzących głównie z przewodu pokarmowego. Pozytywne barwienie z ich wykorzystaniem obserwowano we wszystkich guzach pochodzących od 50 pacjentów z rakiem okrężnicy lub odbytnicy po radioterapii przedoperacyjnej. Mikroprzerzuty zidentyfikowane w węzłach chłonnych wykazały pozytywną reakcję wyłącznie z anty-CK AE1/AE3. Określenie najbardziej czułych markerów służących do wykrywania mikroprzerzutów może stanowić fundament do właściwego planowania postoperacyjnej terapii pacjentów, u których stwierdzono ich obecność. Dotychczasowe badania nie określają jednak jasno wpływu ich wykrycia na planowanie chemioterapii adjuwantowej i przeżycie pacjentów. Część badaczy nie wykazała różnicy w przeżyciu między pacjentami z mikroprzerzutami a tymi bez ich obecności [16, 17]. Inni demonstrowali znaczną przewagę przeżycia pacjentów bez stwierdzonych mikroprzerzutów [3, 18]. Sprecyzowanie roli mikroprzerzutów, izolowanych komórek nowotworowych wymaga dalszych badań, szczególnie na poziomie molekularnym, w różnych typach nowotworów.

Podsumowanie
W opisanych powyżej badaniach:
1. Wykazano obecność mikroprzerzutów, co potwierdza znaczenie metod immunohistochemicznych w ich oszacowaniu.
2. Spośród ocenianych markerów najbardziej czuły dla wykrywania mikroprzerzutów okazał się koktajl cytokeratyn CK AE1/AE3.
3. Stwierdzono obecność mikroprzerzutu w skrawkach pochodzących z jednej z dwóch głębokości węzła, co wskazuje na konieczność seryjnego cięcia węzłów.

Piśmiennictwo

1. O’Dwyer ST, Haboubi NY, Johnson JS, Gardy R. Detection of lymph node metastases in colorectal carcinoma. Colorectal Dis 2001;
3: 288-94.
2. Denq H, Shu XJ, Zhen HY, et al. Prognostic significance of lymph node micrometastases in colorectal cancer. Ai Zheng 2003; 22: 762-6.
3. Bukholm IR, Bondi J, Wiik P, et al. Presence of isolated tumour cells in mesenteric lymph nodes predicts poor prognosis in patients with stage II colon cancer. Eur J Surg Oncol 2003; 29: 862-6.
4. Okuyama T, Oya M, Ishikawa H. Budding as a risk factor for lymph node metastasis in pT1 or pT2 well-differentiated colorectal adenocarcinoma. Dis Colon Rectum 2002; 45: 628-34.
5. Wood TF, Nora DT, Morton DL, et al. One hundred consecutive cases of sentinel lymph node mapping in early colorectal carcinoma:
detection of missed micrometastases. J Gastrointest Surg 2002;
6: 322-30.
6. Choi HJ, Choi YY, Hong SH. Incidence and prognostic implications of isolated tumor cells in lymph nodes from patients with Dukes B colorectal carcinoma. Dis Colon Rectum 2002; 45: 750-6.
7. Natarajan S, Xu F, Gilchrist K, Weber SM. Cytokeratin is a superior marker for detection of micrometastatic biliary tract carcinoma.
J Surg Res 2005; 125: 9-15.
8. Murawa D, Filas V, Breborowicz J, et al. Evaluation of the sentinel node biopsy in colorectal carcinoma including the results of immunohistochemical examination. Acta Chir Belg 2007; 107: 45-8.
9. Bembenek A, Schneider U, Gretschel S, et al. Detection of lymph node micrometastases and isolated tumor cells in sentinel and nonsentinel lymph nodes of colon cancer patients. World J Surg 2005; 29: 1172-5.
10. Forte A, Leonetti G, Bosco M, et al. The clinical significance of lymph node micrometastases and of concept of sentinel lymph node.
G Chir 2006; 27: 277-80.
11. Liberale G, Lasser P, Sabourin JC, et al. Sentinel lymph nodes of colorectal carcinoma: reappraisal of 123 cases. Gastroenterol Clin Biol 2007; 31: 281-5.
12. Starska K, Łukomski M, Józefowicz-Korczyńska M, Lewy-Trenda I. Cytokeratin antigen expression in lymph nodes – prognostic significance of clinical features of the primary tumor and lymph nodes in the presence of micrometastases in laryngeal carcinoma. Przegl Lek 2006; 63: 748-51.
13. Cserni G. Axillary sentinel lymph node micrometastases with extracapsular extension: a distinct pattern of breast cancer metastasis? J Clin Pathol 2007 Apr 27 [Epub ahead of print].
14. Matsuyama J, Doki Y, Yasuda T, et al. The effect of neoadjuvant chemotherapy on lymph node micrometastases in squamous cell carcinomas of the thoracic esophagus. Surgery 2007; 141: 570-80.
15. Niikura H, Okamoto S, Yoshinaga K, Nagase S, Takano T, Ito K, Yaegashi N. Detection of micrometastases in the sentinel lymph nodes of patients with endometrial cancer. Gynecol Oncol 2007; 105: 683-6.
16. Ozmen V, Cabioglu N. Sentinel lymph node biopsy for breast cancer: current controversies. Breast J 2006; 12 (5 Suppl 2): S134-42.
17. García-Sáenz JA, Sáenz MC, González L, et al. Significance of the
immunohistochemical detection of lymph node micrometastases in stage II colorectal carcinoma. Clin Transl Oncol 2006; 8: 676-80.
18. Shimoyama M, Yamazaki T, Suda T, Hatakeyama K. Prognostic
significance of lateral lymph node micrometastases in lower rectal cancer. Dis Col Rectum 2003; 46: 333-9.

Adres do korespondencji
mgr Hanna Andrusewicz
lek. Ewa Śrutek
Zakład Patologii Nowotworów
Centrum Onkologii im. F. Łukaszczyka
ul. Romanowskiej 2
85-796 Bydgoszcz
tel. +48 52 374 33 37
e-mail: ewa.zpn@wp.pl