Infectious factors and a process of apoptosis in the mucosa of the gastrointestinal tract

Wprowadzenie
Apoptoza jest naturalną, fizjologiczną, zaprogramowaną śmiercią komórki, niezbędną do prawidłowego funkcjonowania organizmu i utrzymania homeo-stazy wewnątrzkomórkowej. W błonie śluzowej żołądka fizjologiczna śmierć i odnowa komórek zachodzi co 3-5 dni, w tym 2-3% komórek błony śluzowej żołądka fizjologicznie podlega procesowi apoptozy. Z kolei w zakażeniu Helicobacter pylori
częstość występowania komórek apoptotycznych w błonie śluzowej żołądka zwiększa się z 2-3 do 16% (średnio 8%).

Patomechanizm receptorowy apoptozy w błonie śluzowej przewodu pokarmowego
Proces apoptozy w błonie śluzowej przewodu pokarmowego przebiega za pośrednictwem dwóch niezależnych szlaków patogenetycznych. Jednym z nich jest szlak zewnątrzkomórkowy, zwany inaczej receptorowym, w przebiegu którego dochodzi do aktywacji mającego proapoptotyczne właściwości receptora Fas, nazwanego także receptorem CD95 czy też receptorem apoproteiny 1 (Apo-1), oraz działającego antyapoptotycznie receptora naskórkowego czynnika wzrostowego (epidermal growth factor receptor - EGFR).
Po przyłączeniu liganda (FasL) do receptora Fas dochodzi do jego przegrupowania, oligomeryzacji, a następnie wzbudzenia białek adaptorowych i utworzenia kompleksu wzbudzającego sygnały apoptotyczne (death inducing signal complex - DISC), w skład którego wchodzi receptor Fas i jego ligand ,,domena śmierci”, związana z receptorem Fas (FADD), oraz prokaspaza 8 [1]. Receptor CD95 poprzez tzw. domenę śmierci łączy się z pasującą domeną FADD, co powoduje wzbudzenie i oligomeryzację kaspazy 8. Wskutek powyższych przemian kaspaza 8 katalizuje aktywację efektorowych kaspaz, takich jak kaspaza 3 oraz kaspaza 7, będących wykonawczym elementem szlaku patogenetycznego apoptozy [2].
Kolejnym receptorem szlaku zewnątrzkomórkowego procesu apoptozy, który działa hamująco na procesy apoptozy, a pobudzająco na procesy proliferacji, jest EGFR. Receptor ten jest zbudowany z domeny zewnątrzkomórkowej, łączącej się poprzez domenę przez-błonową z domeną wewnątrzkomórkową, mającą aktywność kinazy tyrozynowej. Domena zewnątrzkomórkowa zawiera cztery podregiony, w tym domenę III odpowiedzialną za przyłączenie liganda [3].
Aktywacja EGFR prowadzi do jego homodimeryzacji, a następnie heterodimeryzacji, co z kolei powoduje auto-fosforylację jego pięciu reszt tyrozynowych (Tyr 1173, Tyr 1148, Tyr 1086, Tyr 1068, Tyr 992). Rezultatem powyższych procesów jest aktywacja kinazy tyrozynowej, prowadząca do wzbudzenia wielu szlaków patogenetycznych, w których biorą udział ras/raf/kinaza białkowa 1, aktywowana przez miogen, fosfolipaza C, kinaza 3-fosfatydyloinozytolu (PI3K), co z kolei aktywuje procesy proliferacji, a hamuje procesy apoptozy [4].

Patomechanizm mitochondrialny apoptozy w błonie śluzowej przewodu pokarmowego
Kolejnym szlakiem patogenetycznym procesu apoptozy jest szlak wewnątrzkomórkowy, zwany także mitochondrialnym, w przebiegu którego dochodzi do aktywacji zarówno białek pobudzających (Bax, Bak, Bok, Bad, Bim) i białek hamujących (Bcl-2, Bcl-xl) należących do rodziny Bcl-2.
W rodzinie białek pobudzających wyróżnia się dwie podgrupy:
1) białka zawierające dwa lub trzy regiony domeny (BH), zalicza się tu białka Bax, Bak, Bok, tj. BH1, BH2, BH3 i niezawierające regionu domeny BH4,
2) białka, takie jak Bad, Bim, w skład których wchodzi tylko jeden region BH3 domeny (BH) [5].
W badaniach dotyczących delecji i mutagenezy genu kodującego a-helikalny segment domeny BH3 wykazano, że jest to najważniejsza domena warunkująca proapoptotyczne działanie białek pobudzających proces apoptozy. Na skutek translokacji białek proapoptotycznych w obrębie błon mitochondrium, uwolniony z przestrzeni międzybłonowej cytochrom C łączy się z apoptotycznym czynnikiem 1 aktywującym proteazy (APAF-1), co z kolei powoduje przyłączenie nukleotydów dATP i ATP oraz następową oligomeryzację kompleksu cytochrom C-czynnik APAF-1. Cytochrom C wraz z czynnikiem APAF-1 oraz kaspazą 9 wchodzą w skład apoptosomu, którego aktywacja powoduje wzbudzenie efektorowych kaspaz apoptozy, tj. kaspazy 3 oraz kaspazy 7 [6]. Substratami kaspaz są białka strukturalne, enzymy przemian metabolicznych komórki oraz białka uczestniczące w cyklu komórkowym [7].

Czynniki infekcyjne a proces apoptozy
Znanych jest wiele bakterii patogennych indukujących bądź też hamujących proces apoptozy w organiz-mie gospodarza. Proces apoptozy wzbudzają enteropatogenne bakterie, takie jak Salmonella typhimurium [8], Shigella [9] i Yersinia [10].
Inwazyjny szczep S. typhimurium indukuje proces apoptozy makrofagów. Patomechanizm apoptozy wzbudzany przez tę bakterię nie został wyjaśniony, postuluje się udział wielu przekaźników, takich jak wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia, fosfolipaza A2, leukotrieny, kinaza białkowa, których produkcja wzrasta w zakażeniu inwazyjnym szczepem S. typhimurium [8].
Shigella wzbudza także proces apoptozy makrofagów, przebiegający przy udziale enzymu konwertującego, którego aktywacja powoduje z kolei zwiększenie produkcji IL-1b inicjującej wzbudzenie wielu cytokin prozapalnych, takich jak IL-1, IL-6, IL-8 oraz czynnika martwicy nowotworów a (tumour necrosis factor a - TNF-α) [9].
Kolejną bakterią o proapoptotycznym działaniu jest Streptococcus pyogenes, który powoduje uszkodzenie mitochondrium i uwolnienie cytochromu C przy udziale białka mitochondrialnego Bax. W wyniku wyżej opisanych procesów dochodzi do aktywacji kaspazy 3 oraz kaspazy 9, będących enzymami wykonawczymi procesu apoptozy [11].
Bakterie Pseudomonas aeruginosa [12] i Campylobacter jejuni [13] aktywują procesy apoptozy poprzez oddziaływanie na strukturę porów zewnętrznej błony mitochondrium.
Escherichia coli z kolei hamuje proces apoptozy na drodze aktywacji kinazy tyrozynowej, a inhibicji fosfatydyloinozytolokinazy 3, stymulacji kinazy białkowej C oraz aktywacji jądrowego czynnika kB (NF-kB) [14].
Kolejną bakterią hamującą proces apoptozy jest Chlamydia psittaci, która - infekując komórki - prowadzi do translokacji białka mitochondrialnego Bax, ale w procesie tym nie dochodzi do aktywacji układu kaspaz. Antyapoptotyczne działanie C. psittaci wynika z blokowania przez tę bakterię uwalniania z mitochondrium cytochromu C i następowej aktywacji układu kaspaz [15].
Bakterie Chlamydia trachomatis i Rickettsia rickettsii nie mają zdolności indukowania procesu apoptozy, co umożliwia tym patogenom wewnątrzkomórkowy wzrost i przetrwanie. Rickettsia rickettsii powoduje zwiększenie produkcji w komórkach organizmu gospodarza NF-kB, który z kolei zapobiega procesowi apoptozy indukowanemu przez TNF-α, promieniowanie jonizujące oraz chemioterapeutyki [16].
Bakteria H. pylori indukuje proces apoptozy w błonie śluzowej przewodu pokarmowego za pośrednictwem szlaku receptorowego i białek mitochondrialnych Bcl-2.

Patomechanizm apoptozy w błonie śluzowej przewodu pokarmowego w zakażeniu Helicobacter pylori
Wyniki badań in vitro wykazały, że proces apoptozy błony śluzowej żołądka w zakażeniu H. pylori indukowany jest przez czynniki wydzielane bezpośrednio przez tę bakterię, takie jak białko Cag A [17], ureaza [15], lipopolisacharyd (LPS) [18], cytotoksyna Vac A [19], monochloramina, a także tlenek azotu [20].
Białko Cag A o masie cząsteczkowej 120-140 kDa kodowane jest przez gen cagA, który wchodzi w skład grupy genów określanych mianem ,,wyspy patogenności”. „Wyspa patogenności” cagA odpowiada za aktywację NF-kB, który z kolei jest czynnikiem regulującym aktywność genów uczestniczących w procesach zapalnych, proliferacji komórek i apoptozy [21]. Antyapoptotyczne działanie NF-kB wiąże się z aktywacją przez ten czynnik transkrypcyjny ekspresji genów kodujących komórkowe inhibitory apoptozy c-IAP1 oraz c-IAP2. Proapoptotyczne działanie NF-kB jest związane z kolei z indukcją procesu apoptozy w komórkach poddanych działaniu nadtlenku wodoru [22].
Wszystkie szczepy H. pylori wydzielają ureazę, której zasadniczą rolą, poza rozkładem mocznika, jest uwalnianie wielu proapoptotycznych cytokin, takich jak IL-6, IL-8 oraz TNF-α.
Lipopolisacharyd bakterii H. pylori jest mitogenem aktywującym monocyty, wpływającym na uwalnianie reaktywnego tlenu oraz stymulującym produkcję wielu działających proapoptotycznie interleukin, takich jak IL-1b, TNF, IL-6 oraz IL-8 [23].
Cytotoksyna Vac A (białko o masie cząsteczkowej 95 kDa) prowadzi do aktywacji białka mitochondrialnego Bax, co z kolei skutkuje uwolnieniem z mitochondrium cytochromu C i wzbudzeniem procesu apoptozy.
Potthoff i wsp. metodą Western-blot dowiedli, że inkubacja komórek nabłonka błony śluzowej żołądka z bakterią H. pylori powoduje 4-krotne w porównaniu z grupą kontrolną zwiększenie aktywacji kaspazy 9, 2-krotne zwiększenie aktywacji kaspazy 8 i kaspazy 6, a aż 6-krotne zwiększenie aktywacji kaspazy 3. Nie obserwowali wpływu H. pylori na aktywność kaspazy 1 oraz kaspazy 7 [24].
Uwalniany w trakcie procesu zapalnego błony śluzowej żołądka tlenek azotu wykazuje działanie zarówno proapoptotyczne, jak i antyapoptotyczne. Proapoptotyczny wpływ poprzez stymulację procesu apoptozy ma miejsce w komórkach nabłonka i makrofagach. Antyapoptotyczne działanie tlenku azotu wynika z inaktywacji enzymów wzbudzających proces apoptozy, takich jak enzym konwertujący IL-1b, białka proteazy cysteinowej, kaspaz oraz tkankowej transglutaminazy [25].
Chociaż większość badaczy podkreśla znaczenie bakterii H. pylori w indukcji procesu apoptozy w komórkach nabłonka błony śluzowej żołądka, to do pełnego zrozumienia patogennego wpływu tej bakterii w tym procesie ważne są także jej interakcje z komórkami układu immunologicznego gospodarza. Badacze Kim i wsp. postulują, że proces apoptozy neutrofili w zakażeniu bakterią H. pylori odbywa się poprzez zewnętrzny szlak patomechanizmu apoptozy, tj. przy udziale receptora Fas i jego liganda FasL [26].
Menaker i wsp. wskazują, że indukcja apoptozy makrofagów w zakażeniu H. pylori moduluje odpowiedź immunologiczną ze strony gospodarza i prowadzi do rozwoju przewlekłego procesu zapalnego. Podkreślają oni także, że indukcja procesu apoptozy makrofagów przez H. pylori odbywa się poprzez aktywację kaspazy 8, wzrost przepuszczalności błony mitochondrialnej i uwolnienie cytochromu C [27].
Gobert i wsp. dowodzą z kolei, że proces apoptozy makrofagów w wyniku infekcji H. pylori wiąże się z produkcją tlenku azotu w przebiegu zakażenia. Związek ten aktywuje arginazę II, enzym występujący w makrofagach, i powoduje przemianę L-argininy w L-ornitynę, która pod wpływem dekarboksylazy ornityny powoduje powstanie amin biogennych. Aminy biogenne (putrescyna, spermina i spermidyna) mają zdolność regulacji procesów migracji komórek, proliferacji i apoptozy [25]. Putrescyna ulega przemianom do spermidyny i sperminy, a podczas metabolizmu tych dwóch amin biogennych odpowiednio przez oksydazę sperminy i oksydazę spermidyny dochodzi do powstania nadtlenku wodoru aktywującego proces apoptozy poprzez depolaryzację błony mitochondrium, uwolnienie cytochromu C i aktywację kaspazy 3.
Infekcja H. pylori wiąże się z przewlekłym naciekiem błony śluzowej antrum przez różnego typu komórki zapalne, w tym limfocyty T produkujące cytokiny odpowiedzi immunologicznej Th1 (IL-2, IL-4, INF-g), regulujące immunologiczno-zapalną odpowiedź gospodarza na zakażenie H. pylori. Indukcja procesu apoptozy przez tę bakterię w puli komórek prezentujących antygen oraz w limfocytach T jest ważnym mechanizmem, za pośrednictwem którego dochodzi do zmiany odpowiedzi immunologicznej gospodarza z Th2 do Th1 [28]. Pod wpływem zakażenia H. pylori dochodzi do aktywacji prezentującej antygen komórki dendrytycznej i zwiększenia produkcji IL-8 aktywującej neutrofile oraz wielu cytokin prozapalnych, takich jak IL-1, IL-6, IL-12, będących składową odpowiedzi Th1 [29]. Helicobacter pylori nasila odpowiedź immunologiczną gospodarza poprzez stymulację procesu apoptozy, a zahamowanie procesu proliferacji limfocytów T na drodze wzrostu ekspresji w tych komórkach receptora Fas i jego liganda FasL [30].
Proces apoptozy błony śluzowej żołądka odgrywa ważną rolę w utrzymaniu jej integralności. Równowaga między procesami proliferacji i apoptozy błony śluzowej żołądka warunkuje jej homeostazę. Nieprawidłowa regulacja procesu apoptozy może wpływać na rozwój wielu chorób, takich jak przewlekłe zapalenie błony śluzowej żołądka, choroba wrzodowa czy choroba nowotworowa. Indukcja procesu apoptozy w błonie śluzowej żołądka przez bakterię H. pylori skutkuje powstaniem przewlekłego zapalenia błony śluzowej żołądka i choroby wrzodowej. Inhibicja procesu apoptozy i indukcja procesu proliferacji ma z kolei związek z rozwojem procesu nowotworowego.

Piśmiennictwo
1. Stoicov C, Cai X, Li H, et al. Major histocompatibility complex class II inhibits Fas antigen-mediated gastric mucosal cell apoptosis through actin-dependent inhibition of receptor aggregation. Infect Immun 2005; 73: 6311-29.
2. Sharp DA, Lawrence DA, Ashkenazi A. Selective knockdown of the long variant of cellular FLICE inhibitory protein augments death receptor-mediated caspase-8 activation and apoptosis. J Biol Chem 2005; 280: 19401-9.
3. Voldborg BR, Damstrup L, Spang-Thomsen M, Poulsen HS,
Poulsen HS. Epidermal growth factor receptor (EGFR) and EGFR mutations, function and possible role in clinical trials. Ann Oncol 1997; 8: 1197-206.
4. Yarden Y, Sliwkowski MX. Untangling the ErbB signalling network. Nat Rev Mol Cell Biol 2001; 2: 127-37.
5. Gross A, McDonnell JM, Korsmeyer SJ. BCL-2 family members and the mitochondria in apoptosis. Genes Dev 1999; 13: 1899-911.
6. Wang X. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes Dev 2001; 15: 2922-33.
7. Shibayama K, Doi Y, Shibata N, et al. Apoptotic signaling pathway activated by Helicobacter pylori infection and increase of apoptosis-inducing activity under serum-starved conditions. Infect Immun 2001; 69: 3181-9.
8. Monack DM, Raupach B, Hromockyj AE, Falkow S. Salmonella typhimurium invasion induces apoptosis in infected macrophages. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 9833-8.
9. Zychlinsky A, Sansonetti PJ. Apoptosis as a proinflammatory event: what can we learn from bacteria-induced cell death? Trends Microbiol 1997; 5: 201-4.
10. Monack DM, Mecsas J, Ghori N, Falkow S. Yersinia signals macrophages to undergo apoptosis and YopJ is necessary for this cell death. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: 10385-90.
11. Nakagawa I, Nakata M, Kawabata S, Hamada S. Cytochrome
c-mediated caspase-9 activation triggers apoptosis in Streptococcus pyogenes-infected epithelial cells. Cell Microbiol 2001; 3: 395-405.
12. Buommino E, Morelli F, Metafora S, et al. Porin from Pseudomonas aeruginosa induces apoptosis in an epithelial cell line derived from rat seminal vesicles. Infect Immun 1999; 67: 4794-800.
13. Zhu J, Meinersmann RJ, Hiett KL, Evans DL. Apoptotic effect of outer-membrane proteins from Campylobacter jejuni on chicken lymphocytes. Curr Microbiol 1999; 38: 244-9.
14. Crane JK, Majumdar S, Pickhardt DF. Host cell death due to enteropathogenic Escherichia coli has features of apoptosis. Infect Immun 1999; 67: 2575-84.
15. Fan X, Gunasena H, Cheng Z, et al. Helicobacter pylori urease binds to class II MHC on gastric epithelial cells and induces their apoptosis. J Immunol 2000; 165: 1918-24.
16. Clifton DR, Goss RA, Sahni SK, et al. NF-kappa B-dependent inhibition of apoptosis is essential for host cellsurvival during Rickettsia rickettsii infection. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: 4646-51.
17. Le’Negrate G, Ricci V, Hofman V, et al. Epithelial intestinal cell apoptosis induced by Helicobacter pylori depends on expression of the cag pathogenicity island phenotype. Infect Immun 2001; 69: 5001-9.
18. Kawahara T, Teshima S, Kuwano Y, et al. Helicobacter pylori lipopolysacharide induces apoptosis of cultured guinea pig gastric mucosal cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2001; 281: G726-34.
19. Yamasaki E, Wada A, Kumatori A, et al. Helicobacter pylori vacuolating cytotoxin induces activation of the proapoptotic proteins Bax and Bak, leading to cytochrome c release and cell death, independent of vacuolation. J Biol Chem 2006; 281: 11250-9.
20. Xia HH, Talley NJ. Apoptosis in gastric epithelium induced by Helicobacter pylori infection: implications in gastric carcinogenesis. Am J Gastroenterol 2001; 96: 16-26.
21. Beauerle PA, Baltimore D. NF-kappaB: ten years after. Cell 1996; 87: 13-20.
22. Dumont A, Hehner SP, Hofmann TG, et al. Hydrogen peroxideinduced apoptosis is CD95-independent, requires the release of mitochondria-derived reactive oxygen species and the activation of NF-kappa B. Oncogene 1999; 18: 747-57.
23. Bliss CM Jr, Golenbock DT, Keates S. Helicobacter pylori lipopolysacharide binds to CD14 and stimulates release of interleukin-8, epithelial neutrophil-activating peptide 78, and monocyte chemotactic protein 1 by human monocytes. Infect Immun 1998; 66: 5357-63.
24. Potthoff A, Ledig S, Martin J, et al. Significance of the caspase family in Helicobacter pylori induced gastric epithelial apoptosis. Helicobacter 2002; 7: 367-77.
25. Gobert AP, Cheng Y, Wang JY, et al. Helicobacter pylori induces macrophage apoptosis by activation of arginase II. J Immunol 2002; 168: 4692-700.
26. Kim JM, Kim JS, Jung HC, Song IS, Kim CY. Apoptosis of human gastric epithelial cells via caspase-3 activation in response to Helicobacter pylori infection: possible involvement of neutrophils through tumor necrosis factor alpha and soluble Fas ligands. Scand J Gastroenterol 2000; 35: 40-8.
27. Menaker RJ, Ceponis PJM, Jones NL. Helicobacter pylori induces apoptosis of macrophages in association with alterations in the mitochondrial pathway. Infect Immun 2004; 72: 2889-98.
28. Mohammadi M, Czinn S, Redline R, Nedrud J. Helicobacter-specific cell-mediated immune responses display a predominant Th1 phenotype and promote a delayed-type hypersensitivity response in the stomachs of mice. J Immunol 1996; 156: 4729-38.
29. Kranzer K, Söllner L, Aigner M, et al. Impact of Helicobacter pylori virulence factors and compounds on activation and maturation of human dendritic cells. Infect Immun 2005; 73: 4180-9.
30. Koyama S. Apoptotic depletion of infiltrating mucosal lymphocytes associated with Fas ligand expression by Helicobacter pylori - infected gastric mucosal epithelium: human glandular stomach as a site of immune privilege. Dig Dis Sci 2000; 45: 773-80.