Influence of replacement hormonal therapy on neutrophils priming by TNF-α

TNF-α pełni w organizmie ludzkim rolę mediatora wielu procesów zarówno fizjologicznych, jak i patologicznych. Cytokina ta spełnia bardzo ważną rolę w reakcjach procesu zapalnego. Jest białkiem o masie 17 000 daltonów, w skład którego wchodzi 157 aminokwasów. Nazwa tej cytokiny wywodzi się z badań prowadzonych przez Carswella [1], który wykrył jej obecność w osoczu zwierząt po podaniu endotoksyny.
Jest jednym z najsilniejszych modyfikatorów funkcji neutrofili [2, 3]. Ma zdolność indukcji aktywności cytostatycznej i cytotoksycznej neutrofili w stosunku do komórek nowotworowych [4]. Neutrofile wykazują zdolność do chemotaksji, adherencji, fagocytozy i destrukcji sfagocytowanych mikroorganizmów przy pomocy mechanizmów tlenowych i pozatlenowych oraz do degranulacji i uwalniania ziarnistości wewnątrzkomórkowych i produktów metabolizmu tlenowego komórki. Mogą także produkować cytokiny zapalne [2]. Są jednym z najważniejszych źródeł reaktywnych form tlenu w organizmie [2].
Funkcje neutrofili, takie jak migracja, fagocytoza, degranulacja, wytwarzanie reaktywnych form tlenu podlegają regulacji pod wpływem różnych mediatorów [2].
Stwierdzono, że pod bezpośrednim wpływem TNF-α dochodzi do zwiększonej ekspresji receptorów integrynowych neutrofila, nasilenia fagocytozy oraz do niewielkiego wzmocnienia wybuchu oddechowego [5].

Termin priming został wprowadzony w 1984 r. przez Guthrie i wsp. [6] do określenia zjawiska wzrostu generacji wolnych rodników przez stymulowane neutrofile po uprzedniej ich preinkubacji z lipolisacharydami. Ten sam termin został zastosowany w odniesieniu do wzmożonej odpowiedzi neutrofili na stymulatory, obserwowanej po preaktywacji czynnikiem pochodzącym z aktywowanych komórek jednojądrzastych [7]. Czynnik ten został wyizolowany i zidentyfikowany jako TNF-α [8]. Późniejsze badania potwierdziły zdolność TNF-α do preaktywacji neutrofili tzw. primingu. W wyniku preaktywacji neutrofili przy użyciu tej cytokiny, w odróżnieniu od działania bezpośredniego, dochodziło do wzmożonej ich odpowiedzi na następny bodziec.
Opisano zwiększenie wybuchu tlenowego po inkubacji neutrofili z TNF-α i fMLP [5]. Inne badania potwierdzały, że TNF-α sam nie aktywował wytwarzania reaktywnych form tlenu i nie nasilał agregacji i degranulacji, ale preinkubacja neutrofili z TNF-α nasilała znacznie odpowiedź komórek na stymulatory (np. fMLP). Stwierdzono, że efekt preaktywacji zależał od stężenia TNF-a, czasu preinkubacji i temperatury otoczenia [9]. Wiles [10] opisał znaczne zwiększenie poziomu wybuchu tlenowego indukowanego fMLP, C5a, opsonizowanym zymosanem po preinkubacji neutrofili z TNF-α. Neutrofile preinkubowane z TNF-a, w porównaniu do GM-CSF, G-CSF i IL-8 wykazywały największy poziom wybuchu oddechowego po stymulacji fMLP. Jednocześnie preaktywacja przez TNF-α najbardziej zwiększała intensywność wiązania fMLP ze swoistym receptorem na neutrofilu [11].
TNF-α łączy się na powierzchni komórki z receptorami TNF-R (p55, CD120a i p75, CD120b). Mechanizm transdukcji sygnału na tej drodze receptorowej jest słabo poznany. Przypuszczalnie dochodzi do wzrostu aktywności oksydazy NAD (P) H oraz poprzez jądrowe czynniki transkrypcyjne NF-KB do zmiany transkrypcji genów szeregu biologicznie ważnych mediatorów wtórnych, m.in. IL-1, 6, 8 oraz czynników: PAF, NGF, TGF-β, LTB4, GM-CSF, G-CSF [12, 13].
W badaniach własnych udowodniono zmniejszanie nasilenia zjawiska primingu w czasie stosowania hormonalnej terapii zastępczej [14].
Cel pracy
Porównanie wpływu doustnej i przezskórnej hormonalnej terapii zastępczej u kobiet w okresie pomenopauzalnym na priming neutrofili TNF-α.
Metodyka
Badaną grupę stanowiło 89 pomenopauzalnych pacjentek Poradni Kliniki Ginekologii i Chorób Menopauzy ICZMP w Łodzi.
Kryteriami wykluczającymi były istnienie przeciwwskazań do hormonalnej terapii zastępczej, cukrzyca, ostre lub przewlekłe choroby zapalne, HTZ w okresie ostatnich 6 mies., stosowanie leków o właściwościach antyoksydacyjnych.
Na wykonywanie badań uzyskano zgodę Komisji Etyki Badań Naukowych przy Akademii Medycznej w Łodzi.
Pacjentki zakwalifikowano do hormonalnej terapii zastępczej. U 46 pacjentek zastosowano HTZ doustną zawierającą 17-beta-estradiol i octan norethisteronu. U 43 kobiet włączono terapię przezskórną, składającą się mikronizowanego estradiolu i octanu norethisteronu.

Efekt antyoksydacyjny HTZ określano, porównując generację reaktywnych form tlenu przez neutrofile krwi obwodowej pacjentek ocenianą na podstawie pomiaru chemiluminescencji (CL) w czasie tzw. wybuchu tlenowego tych komórek przed rozpoczęciem hormonalnej terapii zastępczej oraz po 3 i po 6 mies. stosowania tej terapii. Do wywołania wybuchu tlenowego neutrofili zastosowano następujące stymulatory: formylo-metionylo-leucylofenyloalanina (fMLP), octan mirystynianu forbolu (PMA) i zymosan firmy Sigma-Aldrich. Jako wzmacniacza chemiluminescencji bezpośredniej użyto luminolu (Sigma-Aldrich). Do preaktywacji (primingu) neutrofili używano rekombinowanego ludzkiego TNF-α (5x10⁷ U/mg) (Sigma-Aldrich). Płyn PBS (fizjologiczny roztwór NaCl zbuforowany fosforanami) pochodził z firmy Biomed.
Pomiaru chemiluminescencji dokonywano przy użyciu aparatu LUMINOMETR 1251 (Pharmacia LKB). Badania przeprowadzano w stałej temp. 37^oC±0,1. Luminometr w ciągu 30 min dokonywał 15 pomiarów. Każdą serię pomiarów wykonywano na 4 próbkach krwi powtarzając ją 2-krotnie. Na podstawie wyników pomiarów obliczano parametry chemiluminescencji: a) pole powierzchni pod krzywą emisji w funkcji czasu liczoną w ciągu 30 min, wyrażające całkowitą ilość energii wyemitowaną przez komórki w czasie pomiaru, b) maksimum krzywej emisji. Oceniano chemiluminescencję spontaniczną (BS) i stymulowaną fMLP, PMA i zymosanem neutrofili. Próbki, w których oceniano wybuch tlenowy neutrofili spoczynkowych zawierały – 20 ml krwi pełnej, – 20 µl luminolu, – 20 µl PBS (BS), lub 20 µl fMLP (2x10^–6 M/ml), lub 20 µl PMA (2x10^–8 M/ml) lub 30 µl zymosanu (10 mg/ml), – PBS do łącznej objętości 1 000 µl. Próbki w których oceniano wybuch tlenowy neutrofili preaktywowanych były inkubowane przez 30 min z TNF-α (10 ng/ml) przed dodaniem stymulatorów.
Do oceny istotności zmian wartości parametrów chemiluminescencji w czasie stosowania HTZ zastosowano metody analizy wariancji dla zmiennych zależnych.
Wyniki
Porównując preaktywację TNF-α w grupach stosujących różne rodzaje terapii, interakcje pomiędzy czasem stosowania HTZ a drogą jej podania wystąpiły tylko w przypadku CL spontanicznej (tab. I). Analizując stosunki pól wykazano, że prektywacja w przypadku drogi przezskórnej HTZ malała w czasie, a przy zastosowaniu drogi doustnej nieznacznie wzrastała.
Przy analizie stosunków wartości maksymalnych stwierdzono, że preaktywacja po zastosowaniu drogi przezskórnej malała w pierwszych 3 mies. stosowania HTZ szybciej niż w grupie z terapią doustną, a w następnych 3 mies. wzrastała wolniej. Z drugiej strony wartości preaktywacji były niższe u kobiet stosujących terapię doustną.
Dyskusja
Porównując preaktywację neutrofili u pacjentek stosujących terapię doustną i terapię przezskórną stwierdzono tylko pewne nieznaczne różnice, m.in. interakcje, które nie upoważniają do ustalenia ogólniejszych trendów i zależności. Preaktywacja neutrofili TNF-α nie zależy zatem od drogi podania hormonoterapii zastępczej.
W dostępnym piśmiennictwie nie znaleziono odniesień do powyższej zależności. Jedynie McManus i wsp. prowadzili porównawcze badania hormonalnej terapii doustnej i przezskórnej, oceniając wpływ różnych dróg podania HRT na metabolizm reaktywnych form tlenu (ROI) [15]. Nie oceniali oni jednak zjawisk związanych z generacją ROI, takich jak priming, ale wtórne efekty tych cząsteczek (peroksydację lipidów).
Dostępne badania nad TNF-α dotyczą natomiast tylko jednego rodzaju terapii, doustnej bądź przezskórnej. Brooks-Asplund i wsp. stwierdzili 2-krotny wzrost stężeń TNF-α po zastosowaniu zarówno terapii estrogenowej, jak i estrogenowo-gestagenowej [16].
Podobnie w badaniach Porter i wsp. w grupie 27 kobiet pomenopauzalnych stosujących HRT estrogenowo-gestagenową poziomy TNF-α były wyższe niż w grupie kobiet niestosujących tej terapii [17].
Zupełnie przeciwstawne wyniki uzyskali Bernard-Poenaru i wsp., którzy w swoich badaniach odnotowali statystycznie istotny spadek wydzielania TNF-a przez komórki krwi obwodowej po 6 mies. HTZ [18].
Zmniejszenie produkcji wybranych cytokin pod wpływem 17-beta-estradiolu, w tym również TNF-α, uzyskano także w badaniach in vitro prowadzonych na hodowlach monocytów [19].
Piśmiennictwo
1. Carswell EA, Old LJ, Kassel RL, et al. An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumors. Proc Natl Acad Sci USA 1975; 72: 3666-3670.
2. Zeman K. The role for tumour necrosis factor-a in the induction of human polypolymorphonuclear neutrophil chemiluminescence. Immunol Lett 1996; 53: 45-50.
3. Smith JA. Neutrophils, host defense, and inflammation: a double-edged sword. J Leukocyte Biol 1994; 56: 672-91.
4. Spies T, Morton CC, Nedospasov. Genes for the tumor necrosis factor a and b are linked to human major histocompatybility complex. Proc Natl Acad Sci USA 1986; 83: 8699-708.
5. Perusia B, Kobayashi M, Rossi ME, et al. Immune interferon enhances functional properties of human granulocytes: role of Fc receptors and effect of lymphotoxin, tumor necrosis factor and granulocyte-macrophage stimulating factor. J Immunol 1987; 138: 765-74.
6. Guthrie LA, McPhail LC, Henson PM, et al. Priming of neutrophils for enhanced release of oxygen metabolites by bacterial lipopolysaccharide: evidence for increased activity of the superoxide-producing enzyme. J Exp Med 1984; 160: 1656-71.
7. Cross AS, Lowell GH, Palmblad JC, et al. Mechanism of priming of human neutrophils by a soluble lymphoblastic cell factor. J Immunol 1985; 135: 2074-9.
8. Aggarwal BB, Kohr WJ, Haas PE. Human tumour necrosis factor production, purification and characterisation. J Biol Chem 1985; 260: 2345-54.
9. Ogle JD, Noel JG, Sramkoski RM. Adhesive effect of certain cytokines and other perturbants on human neutrophils. Inflammation 1992; 16: 603-12.
10. Wiles ME, Dykens JA, Wright CD. Human neutrophil (PMN) oxygen radical production and cytoskeleton. Life Sci 1995; 57: 1533-46.
11. Elbim C, Bailly S, Chollet-Martin E, et al. Differential priming effects of proinflammatory cytokines on human neutrophil oxidative burst in response to bacterial N-formyl peptides. Infect Immun 1994; 62: 2195-201.
12. Buttke TM, Sandstrom PA. Oxidative stress as a mediator of apoptosis. Immunol Today 1994; vol. 15, No 1: 7-10.
13. Tchórzewski H. Zapalenie – początek czy koniec choroby? Alergia Astma Immunologia 1996; 1: 29-34.
14. Stetkiewicz T, Połać I, Stachowiak G i wsp. Hormonalna terapia zastępcza u kobiet po menopauzie a wybrane funkcje neutrofili – preaktywacja TNF-α. Przegl Men 2004; 5: 63-66.
15. Mc Manus J, Mc Eneny J, Thompson W, Young IS. The effect of hormone replacement therapy on the oxidation of low density. Atherosclerosis. 1997; 135 (1): 73-81.
16. Brooks-Asplund EM, Tupper CE, Daun JM, et al. Hormonal modulation of interleukin-6, tumor necrosis factor and associated receptor secretion in postmenopausal women. Cytokine 2002; 19 (4): 193-200.
17. Porter VR, Greendale GA, Schocken M, et al. Immune effects of hormone replacement therapy in post-menopausal women. Exp Gerontol 2001; 36 (2): 311-26.
18. Bernard-Poenaru O, Roux C, Blanque R, et al. Bone-resorbing cytokines from peripheral blood mononuclear cells after hormone replacement therapy: a longitudinal study. Osteoporos Int 2001; 12 (9): 769-76.
19. Rogers A, Eastell R. The effect of 17beta-estradiol on production of cytokines in cultures of peripheral blood. Bone 2001; 29 (1): 30-4.



Adres do korespondencji
dr n. med. Tomasz Stetkiewicz
Klinika Ginekologii i Chorób Menopauzy
Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki
ul. Rzgowska 281/289
93-338 Łódź
tel. +48 42 271 15 07
e-mail: kgcm@interia.pl