Interactions between neutrophils and chondrocytes seeded on scaffolds in an environment supplemented with synovial fluid exposed to the influence of variable atmospheric pressure

Wstęp

Metody leczenia z wykorzystaniem biorusztowań zasiedlanych komórkami własnymi pacjenta (implanty) będą w przyszłości jednym z głównych kierunków rozwoju medycyny. Zastosowanie produktów inżynierii tkankowej oraz medycyny regeneracyjnej daje pacjentom szansę m.in. na skrócenie okresu leczenia i rehabilitacji oraz zmniejsza ryzyko powikłań. Inżynieria tkankowa nie jest jednak pozbawiona ograniczeń, ponieważ układ odpornościowy zawsze reaguje na nowo wprowadzone do organizmu implanty [1]. Na aktywację powyższego układu przez implanty wpływ może mieć wiele czynników. Powszechnie akceptowany jest pogląd, że to komórki neutrofilów odpowiadają w dużym stopniu za tę reakcję [1–5].
Szczegółowy mechanizm tej odpowiedzi nie jest jeszcze w pełni poznany. Jedna z teorii sugeruje, że same implanty mogą być zanieczyszczone i zawierać bakterie [2]. Inna teoria mówi, iż materiał, z którego wykonane są implanty, oddziałuje na komórki, np. neutrofile izolowane z tkanki, w obrębie której dokonano wcześniej im­plantacji implantu teflonowego, wykazują słabszą aktywność przeciwbakteryjną [3]. Neutrofile te, w po­równaniu z neutrofilami izolowanymi z krwi, charakteryzuje znaczna redukcja produkcji wolnych rodników tlenowych (WRT), zawartości mieloperoksydazy (MPO), -glukuronidazy, lizosomów oraz możliwości produkcji białek. Przyczyną tego zjawiska jest nadmierna aktywacja komórek infiltrujących implanty [3].
W badaniach nad powierzchniami polistyrenowymi opłaszczonymi fibronektyną, witronektyną lub laminą, wykazano, że komórki neutrofilów stymulowane TNF-α uruchamiają natychmiast masową produkcję nadtlenku wodoru – zjawisko to jest podobne do wywoływanego poprzez stymulację PMA lub bakterie [4]. Henson i wsp. sugerują [5], że degranulacja i produkcja WRT przez neutrofile w wyniku kontaktu z niektórymi implantami jest efektem braku możliwości wchłonięcia przez nie dużych cząstek. Zjawisko to zostało potocznie nazwane „sfrustrowaną fagocytozą” [5].
Istotny wpływ na oddziaływania pomiędzy neutrofilami a rusztowaniem implantu może mieć obecność w środowisku fizjologicznych mediów. Żywotność neutrofilów na biorusztowaniach powleczonych czynnikami występującymi naturalnie w organizmie (płodowa surowica bydlęca; fetal bovine serum – FBS), po 6 godzinach adhezji do biorusztowania wynosi ok. 98%, natomiast w przypadku neutrofilów przylegających do samego biorusztowania, np. w takich rusztowaniach, jak ePTFR oraz Dacron, wynosi odpowiednio 41% i 56% [1]. Śmierć neutrofilów na skutek kontaktu z biorusztowaniem wg Nadzam i wsp. [1] nie ma charakteru typowej apoptozy czy nekrozy i jest związana z nadmierną produkcją WRT. Potwierdzają to wcześniejsze badania Tsan [6], w których wykazano, że śmierć aktywowanych neutrofilów nie wynika z niespecyficznej toksyczności, lecz jest zależna od produkcji nadtlenku wodoru. Katalaza, enzym detoksykujący nadtlenek wodoru, zmniejsza bowiem śmiertelność neutrofilów, natomiast inhibitory MPO, szlaku aktywacji tego właśnie nadtlenku, takiego efektu nie powodują [6]. Takkei i wsp. [7] wręcz sugerują, że śmierć neutrofilów, będąca rezultatem aktywacji przez obcy materiał, jest efektem unikalnych, nieopisanych jeszcze reakcji komórki i należy ją traktować jako nowy rodzaj śmierci, określany mianem „synxenatosis” [7].
Celem prowadzonych eksperymentów było zbadanie relacji pomiędzy neutrofilami, chondrocytami oraz biorusztowaniem w warunkach in vitro, możliwie maksymalnie zbliżonych do warunków panujących in vivo. W badaniach wstępnych określono już rolę fizjologicznych stężeń SF na proces aktywacji neutrofilów [8].
W badaniach prezentowanych poniżej zbadano inter­akcje neutrofilów z chondrocytami, zawieszonymi na biorusztowaniach, nie tylko w obecności płynów fizjologicznych (FBS), lecz również występujących w warunkach patologicznych, np. w płynie stawowym izolowanym od pacjentów z RZS. Według wiedzy autorów niniejszej pracy nie przeprowadzono dotychczas podobnych badań. Wyniki sugerują, że śmierć neutrofilów na skutek kontaktu z biorusztowaniem, w warunkach maksymalnie zbliżonych do panujących w jamie stawu pacjentów z RZS, ma charakter typowej nekrozy.

Materiał i metody

Odczynniki

Luminol (5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dion) oraz lucigeninę (dwuazotan 10,10”-dimetylo-9,9”-dis-akry­dynowy) dostarczyła firma Serva. Gradisol G otrzymano z firmy Kutnowskie Zakłady Farmaceutyczne, a PBS (zbuforowany roztwór 0,9-procentowy NaCl z CaCl2 i MgCl2) z firmy BIO-MED w Lublinie, RPMI 1640 z L-glutaminą otrzymano z Wytwórni Surowic i Szczepionek w Lublinie, Ester forbolu (PMA-phorbol-12-myristate 13 acetate), DMEM/F12 z L-glutaminą i trypsynę/EDTA, Triton X-100, dysmutazę ponadtlenkową (SOD), katalazę oraz deoksyglukozę (DOG) z firmy Sigma Co. (St. Louis, USA). Antybiotyki – penicylina i streptomycyna – pochodziły z Polfy Tarchomin, kolagenazę otrzymano z firmy Serva, natomiast surowicę cielęcą (FBS) z firmy Bio-Whittaker.

Pobieranie płynu stawowego

Płyn stawowy pobrano od 23 pacjentów chorych na RZS, leczonych w Instytucie Reumatologii w Warszawie. Płyn był pobierany i natychmiast wirowany w temperaturze 2–­­8°C przez 30 min, przy obrotach 10 000/min. Płyn po odwirowaniu był rozpipetowany na porcje 1 ml i w probówkach Eppendorfa przechowywany w temperaturze –20°C.

Izolacja neutrofilów z płynu stawowego pacjentów chorych na reumatoidalne zapalenie stawów

Płyn stawowy, z którego izolowano neutrofile, otrzymano od 7 pacjentów obu płci chorych na RZS, w wieku 34–65 lat, leczonych w Instytucie Reumatologii w Warszawie. Liczba komórek w pobieranym płynie wahała się od 1 × 10–7 do 1 × 10–8/ml. Neutrofile stanowiły 80–98% wszystkich komórek. Świeżo izolowany płyn stawowy był mieszany z RPMI 1640 (w proporcji 1 : 5) i wirowany. Komórki były przemywane solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (phosphate buffored saline – PBS), a następnie wirowane w Gradisolu G; ich żywotność wahała się od 80% do 90%.

Izolacja neutrofilów z obwodowej krwi żylnej

Krew obwodową pobierano u ochotników (mężczyźni w wieku 25–56 lat) w Instytucie Reumatologii. Do izolacji komórek z krwi obwodowej wykorzystano technikę wirowania w gradiencie gęstości przy zastosowaniu Gradisolu G z równoczesnym wstrząsem hipotonicznym, w celu wyeliminowania erytrocytów. Otrzymane komórki (98% neutrofilów) zawieszano w PBS i przetrzymywano w temperaturze 4°C. Żywotność neutrofilów, określoną metodą barwienia błękitem trypanu, oceniono na 96%.

Hodowle chondrocytów

Skrawki ludzkiej chrząstki, pobierane post mortem od osób niechorujących na RZS, zawieszano w mieszaninie antybiotyków (penicylina 200 j./ml, streptomycyna 200 µg/ml), trawiono następnie kolagenazą (o stężeniu 0,2%) przez całą noc, po czym filtrowano przez gazę młyńską i finalnie zawieszano w pożywce hodowlanej (DMEM/F12 plus 5-proc. FBS plus antybiotyki i L-glutamina [200 mM]). W tej pożywce zawieszano 1 mln komórek na skrawek biorusztowania z kwasu poliglikolowego (Scaffold PGA Transome typ 02-001 i 02-001A, otrzymane z firmy MedBioOrgan, Polska) o wymiarach 5 × 2,5 × 1 mm.

Hodowle neutrofilów i chondrocytów na biorusztowaniach

Komórki chondrocytów zawieszano na biorusztowaniach i hodowano w inkubatorze, w warunkach kontrolowanej wilgotności przy 5-procentowej zawartości CO2, w temperaturze 37°C. Hodowle prowadzono w standardowych plastikowych butelkach (Nunc) bądź bezpośrednio w 1-milimetrowych plastikowych fiolkach, w których następnie mierzono poziom CL, w luminometrze, w określonych przedziałach czasowych. Aby dokonać pomiarów biochemicznych, pobierano próbki płynu znad hodowli (pomiar zewnątrzkomórkowych stężeń określonych związków) lub traktowano hodowle 1-procentowym Tritonem X-100 (pomiar ogólnego poziomu tych związków). Hodowle chondrocytów prowadzono, inkubując 1 × 10–6 komórek na skrawek biorusztowania. Neutrofile zawieszano na analogicznych skrawkach w stężeniu 10 × 10–6, wspólne hodowle prowadzono, zawieszając 10 × 10–6 neutrofilów i 1 × 10–6 chondrocytów.

Pomiar chemiluminescencji

Do pomiarów chemiluminescencji wykorzystano Luminometr 1251 (Pharmacia LKB). Pomiar emisji światła (maksymalną wartość CL uznano za miarę oksydacyjnej aktywności neutrofilów) przeprowadzano w temperaturze 37°C. Neutrofile stymulowano PMA (40 µl/ml, stężenie końcowe 320 nM). Pomiary CL wykonywano z udziałem luminolu (pomiar ogólnej oksydacyjnej aktywności neutrofilów, stężenie końcowe 150 µM) lub lucygeniny (pomiar aktywności zewnątrzkomórkowej, stężenie końcowe 200 µM).

Pomiar bioluminescencji

Oznaczenie stężenia ATP przeprowadzono metodą bio­luminescencyjną, przy zastosowaniu zestawu 1243-107 ATP Assay Kit (firmy LKB-Wallac). Schemat przeprowadzanej reakcji: ATP + lucyferyna + O2 (w obecności lucyferazy) = oksylucyferaza + AMP + PPi + CO2 + światło. Odpowiednie standardy umożliwiały przeliczenie poziomu światła na stężenie ATP. Pomiar uwalnianego przez uszkodzone komórki ATP przeprowadzono w próbkach płynu znad hodowli komórkowych, natomiast pomiar ogólnego poziomu ATP, po wykonaniu lizy komórek, przy zastosowaniu Tritonu X-100.

Oznaczenia biochemiczne

Pomiar stężenia glutationu (GSH i GSSG) przeprowadzono metodą fluorymetryczną Hissin i Hilf [9]. Oznaczenie poziomu dialdehydu malonylowego [MDA, poziom peroksydacji lipidów (LPO)] metodą Kramera i wsp. [10]. Stężenie dehydrogenazy mleczanowej (LDH) oznaczono za pomocą zestawu firmy Promega.

Wyniki

Założeniem badań było porównanie interakcji, które zachodzą pomiędzy neutrofilami pozyskanymi od osób zdrowych bądź chorych na RZS a biorusztowaniem oraz chondrocytami zasiedlającymi biorusztowania z kwasu poliglikolowego (PGA). Doświadczenia prowadzono w klasycznym układzie doświadczalnym (pożywka hodowlana), w obecności 50-proc. FBS oraz w obecności 50-proc. SF, pozyskanego od pacjentów z RZS. W przeprowadzonych doświadczeniach wykorzystano stworzony uprzednio przez autorów niniejszej pracy model doświadczalny, umożliwiający uzyskanie warunków hodowli maksymalnie zbliżonych do panujących in vivo w jamie stawu [8].
Zważając na to, iż w każdym przypadku skrawki biorusztowań różniły się swoją wagą, oraz uwzględniając trudności z oceną końcowej liczby komórek na biorusztowaniach, w wynikach zaprezentowano rezultaty pojedynczych eksperymentów.
Pierwszym etapem badań było badanie wpływu biorusztowań na metabolizm oksydacyjny neutrofilów. W tym celu oznaczono w nich stężenie wewnątrzkomórkowego glutationu zredukowanego (GSH), a następnie stosunku GSH do glutationu utlenionego (GSGG).
W doświadczeniach neutrofile inkubowano z biorusztowaniami w medium hodowlanym, w medium hodowlanym zawierającym ponadto 50-proc. FBS oraz w medium hodowlanym zawierającym 50-proc. SF. Kontakt neutrofilów z biorusztowaniem powodował zmniejszenie się stężenia GSH w komórkach neutrofilów (ryc. 1).
Stężenie GSH w neutrofilach izolowanych z krwi osób zdrowych jest większe niż w komórkach izolowanych z płynu stawowego pacjentów chorych na RZS. Wraz z upływem czasu inkubacji, stężenie GSH w neutrofilach krwi się zmniejsza, a największe zmniejszenie poziomu następuje w wyniku kontaktu neutrofilów z biorusztowaniem w klasycznej pożywce hodowlanej. W przypadku inkubacji neutrofilów pacjentów chorych na RZS największe zmniejszenie poziomu GSH zaobserwowano w przypadku kontaktu tych komórek z biorusztowaniem w środowisku 50-proc. SF (ryc. 1).
Na rycinie 2 zaprezentowano wyniki eksperymentów, w których – po upływie 12 i 24 godzin inkubacji neutrofilów osadzonych na biorusztowaniach – w trzech powyższych układach doświadczalnych (pożywka, FBS, SF) oznaczano proporcje pomiędzy GSH/GSSG. Zmiana proporcji, polegająca na wzroście GSSG kosztem GSH, świadczy o narastającym stresie oksydacyjnym w ko-mórkach. W neutrofilach izolowanych z krwi i hodowanych na biorusztowaniu w warunkach standardowych stosunek GSH/GSSG był zazwyczaj podobny (1 : 1). Na biorusztowaniu opłaszczonym 50-proc. FBS zdecydowanie większe było stężenie GSH niż GSSG, odwrotną sytua­cję zanotowano w przypadku neutrofilów izolowanych z krwi i hodowanych na biorusztowaniu w obecności 50-proc. SF (ryc. 2a).
W przypadku neutrofilów izolowanych z SF we wszystkich przypadkach stężenie GSSG było zdecydowanie większe niż GSH. Powyższy efekt ulegał nasileniu wraz ze zmianą środowiska doświadczalnego – w stopniu najmniejszym w środowisku z dodatkiem 50-proc. FBS, w największym zaś w środowisku 50-proc. SF, w któ­rym to przypadku stosunek GSH/GSSG określono jako odzwierciedlający najsilniejszy z zanotowanych w niniejszych doświadczeniach stres oksydacyjny (ryc. 2b).
W tabeli I przedstawiono wyniki oznaczeń poziomu chemiluminescencji (CL) lucygeninozależnej oraz luminolozależnej. Część doświadczeń przeprowadzono w układzie doświadczalnym umożliwiającym zbadanie wpływu ciśnienia na metabolizm oksydacyjny neutrofilów.
Chondrocyty hodowane wraz z neutrofilami nasilają poziom CL, a więc destrukcję, szczególnie gdy są hodowane w środowisku z 50-proc. SF. Wraz z upływem czasu poziom CL luminolozależnej (ogólnej) obniża się, w przypadku środowiska patologicznego praktycznie do zera. Inkubacja z deoksyglukozą (DOG), inhibitorem glikolizy i produkcji komponentów NADPH oksydazy, odwraca efekt zarówno obniżenia CL luminolozależnej, jak i zwiększenia CL lucygeninozależnej.
Kolejnym etapem badania była ocena żywotności neutrofilów w środowisku patologicznym (50-proc. SF), w tym wpływu powstającego w tych warunkach stresu oksydacyjnego na żywotność komórek. W tym celu oznaczano stężenia zewnątrzkomórkowego adenozynotrójfosforanu (ATP), dialdehydu malonowego (MDA) i dehydrogenazy mleczanowej (LDH) w płynie lub znad hodowli chondrocytów bądź chondrocytów hodowanych wspólnie z neutrofilami, w różnych warunkach hodowlanych (standardowe medium, 50-proc. FBS, 50-proc. SF). Wraz z upływem czasu hodowli żywotność neutrofilów się zmniejsza, co jest najbardziej widoczne w środowisku patologicznym (50-proc. SF) (ryc. 3).
W tabeli II zaprezentowano wyniki stężenia bio­chemicznych markerów śmierci nekrotycznej chondrocytów. Stężenie zewnątrzkomórkowego ATP uwalnianego z chon­drocytów było większe w przypadku hodowli w środowisku 50-proc. SF. Najniższy poziom zewnątrzkomórkowego MDA zaobserwowano w hodowli chondrocytów w środowisku 50-proc. FBS, a najwyższy w środowisku 50-proc. SF.
Stężenie uwalnianej LDH proporcjonalnie się zwiększało w czasie doświadczenia, najwyższy wzrost odnotowano w przypadku hodowli chondrocytów na biorusztowaniu w środowisku 50-proc. SF. Hodowla chondrocytów na biorusztowaniu, w standardowym medium ho­do­wlanym, widoczna jest na rycinie 4.
Stężenia markerów śmierci nekrotycznej komórek w układzie doświadczalnym, w którym inkubowano neutrofile łącznie z chondrocytami, przedstawiono w tabeli III. Stężenie uwalnianej z obu typów komórek LDH było mniejsze w warunkach „optymalnych” (50-proc. FBS), natomiast jego proporcjonalny wzrost następuje w warunkach hodowli, kolejno na biorusztowaniu w standardowym medium hodowlanym oraz w obecności 50-proc. SF. Inkubacja hodowli komórkowej z DOG hamuje jednak zwiększenie zarówno stężeń zewnątrzkomórkowego LDH, ATP, jak i MDA we wszystkich hodowlach. Wspólna hodowla chondrocytów i neutrofilów na biorusztowaniu w środowisku 50-proc. SF została przedstawiona na rycinie 5.

Dyskusja

W większości badań dotyczących patogenezy RZS zwracano przede wszystkim uwagę na znaczenie limfocytów T w rozwoju tej choroby. Limfocyty T mają jednak jedynie nieznaczne możliwości uszkodzenia tkanek, główną rolę odgrywają zatem wyłącznie we wstępnych fazach RZS. Komórkami odpowiadającymi za większość realnych uszkodzeń w jamie stawu wydają się neutrofile, których liczba w płynie stawowym pacjenta z RZS może wynosić nawet do 5 × 10–9 [11].
Postępy inżynierii materiałowej oraz medycyny regeneracyjnej przybliżają coraz bardziej moment wykorzystania w leczeniu RZS implantów zasiedlonych własnymi komórkami pacjenta. W dotychczasowych badaniach autorzy niniejszej pracy zwrócili uwagę na to, że warunki panujące w stawie in vivo (podwyższone ciśnienie, środowisko o podwyższonej lepkości) powinny być przynaj­mniej częściowo odtworzone w warunkach in vitro [8]. Większość badań mających na celu opisanie relacji pomiędzy neutrofilami a biorusztowaniami do tej pory była wykonywana w warunkach mało zbliżonych do warunków panujących in vivo, w jamie stawu [12–14].
Aby zbadać dokładny charakter interakcji pomiędzy neutrofilami osób zdrowych oraz chorych na RZS a chondrocytami zasiedlającymi biorusztowania, badania prowadzono równocześnie w trzech układach doświadczalnych: klasyczne środowisko z typowymi mediami hodowlanymi (DMEM/F12), środowisko z 50-proc. FBS (uznane za najbardziej odpowiadające środowisku fizjologicznemu) oraz środowisko z 50-proc. SF pobranym od pacjentów z RZS (uznane za środowsko odpowiadające środowisku patologicznemu).
Zmniejszenie stężenia GSH może świadczyć o zwiększonej aktywności, a tym samym nasilającym się stresie oksydacyjnym. Jak zauważyli Sato i wsp. [15], w neutrofilach pobranych z jamy ustnej, częściowo już zaktywowanych, stężenie wewnątrzkomórkowego GSH jest znacznie obniżone, w porównaniu z neutrofilami izolowanymi z krwi obwodowej tego samego pacjenta [15]. Również w badaniach autorów niniejszej pracy kontakt neutrofilów z biorusztowaniem powodował zmniejszenie się stężenia GSH w komórkach neutrofilów. Stężenie GSH w neutrofilach izolowanych z krwi osób zdrowych był wyższy niż w komórkach izolowanych z płynu stawowego pacjentów chorych na RZS. W przypadku inkubacji neutrofilów pacjentów chorych na RZS największe zmniejszenie stężenia GSH zaobserwowano w przypadku kontaktu tych komórek z biorusztowaniem w środowisku 50-proc. SF.
Jest wiele markerów stresu oksydacyjnego [16, 17]. Za jeden z najbardziej charakterystycznych uznawana jest zmiana stosunku GSH do GSSG, na korzyść tego ostatniego. W naszych doświadczeniach w neutrofilach izolowanych z krwi osób zdrowych i hodowanych na biorusztowaniu w warunkach standardowych stosunek GSH/GSSG był zazwyczaj podobny (1 : 1). Na biorusztowaniu opłaszczonym 50-proc. FBS zdecydowanie większe było stężenie GSH niż GSSG, odwrotną sytuację zanotowano z kolei w przypadku neutrofilów izolowanych z krwi, a hodowanych na biorusztowaniu w obecności 50-proc. SF. W przypadku neutrofilów izolowanych z SF u chorych na RZS we wszystkich przypadkach stężenie GSSG było zdecydowanie większe niż stężenie GSH. Powyższy efekt ulegał nasileniu wraz ze zmianą środowiska doświadczalnego – w stopniu najmniejszym w środowisku z dodatkiem 50-proc. FBS, w największym zaś w środowisku 50-proc. SF.
Przedstawione wyniki potwierdzają, że na nasilenie stresu oksydacyjnego neutrofilów istotny wpływ wywiera środowisko, tym większy, im bardziej jest ono zmienione (kolejno; FBS, standardowa hodowla, SF). W badaniach Biagioni i wsp. [16] dotyczących neutrofilów izolowanych od pacjentów z chorobą Crohna, powodującą – jak wiadomo – silny stres oksydacyjny w komórkach neutrofilów, zaobserwowano równie znaczący, tak jak i w badaniach autorów niniejszej pracy wzrost GSSG kosztem GSH [22].
Poziom chemiluminescencji zależnej od lucygeniny (CL zewnątrzkomórkowa) odpowiedzialnej za większość uszkodzeń tkanek wzrasta wraz ze wzrostem ciśnienia środowiska (zarówno 50-proc. FBS, jak i 50-proc. SF). Zależność ta utrzymuje się również po 24-godzinnej hodowli neutrofilów. Przeprowadzone doświadczenia potwierdzają wnioski z wcześniejszych badań autorów, wykazując nasilenie CL zewnątrzkomórkowej emitowanej przez neutrofile inkubowane w płynie stawowym o dużej gęstości [8].
Chondrocyty hodowane wraz z neutrofilami nasilają CL, szczególnie jeśli są hodowane w środowisku z 50-proc. SF. Wraz z upływem czasu następuje osłabienie CL luminolozależnej (ogólnej). Dalsza aktywacja neutrofilów przez chondrocyty wynika z faktu, że znajdując się w stanie stresu oksydacyjnego, mierzonego zmniejszonym stężeniem GSH [18], wydzielają one wiele czynników aktywujących komórki zapalne [18–20]. Badania Green i wsp. [20] oraz Kurz i wsp. [21] wykazały nasilony wypływ substancji wewnątrzkomórkowych z chondrocytów poddanych działaniu ciśnień, a Graff i wsp. [22] sugerują, że czynnikiem o najsilniejszym oddziaływaniu jest ATP. ­Eksperymenty przeprowadzone przez autorów niniejszej pracy potwierdzają sugestie o niezwykle ważnej roli chondrocytów i innych komórek docelowych [23] w mo­dulowaniu przebiegu procesu zapalnego [24–27], a badania powyższych relacji w pełnym modelu doświadczalnym (neutrofile plus chondrocyty plus biorusztowania plus płyn stawowy plus zmienne ciśnienia) w pełni potwierdzają te sugestie.
Obecność w powyższym układzie doświadczalnym DOG, inhibitora zarówno procesu glikolizy, jak i szlaku pentozofosforanowego (czyli produkcji komponentów NADPH oksydazy), odwraca efekt wszelkich zmian poziomu emisji WRT przez neutrofile, potwierdzając wcześ­niejsze doniesienia autorów niniejszej pracy o możliwości regulowania procesu zapalnego przez ten właśnie czynnik [28].
Analiza markerów stresu oksydacyjnego, którego efektem końcowym jest nekrotyczna śmierć komórki, wykazała, że w badanym układzie doświadczalnym komórki są uszkadzane przez ten właśnie stres, którego finalnym skutkiem jest nekroza. Wraz z upływem czasu hodowli żywotność neutrofilów się zmniejsza, najbardziej w środowisku patologicznym (50-proc. SF). Również stężenie biochemicznych markerów nekrozy chondrocytów, takich jak stężenie zewnątrzkomórkowego ATP uwalnianego z chondrocytów, było największe w przypadku hodowli w środowisku „patologicznym” (50-proc. SF).
Podobną relację zanotowano w przypadku zewnątrzkomórkowego MDA: najmniejsze jego stężenie zaobserwowano w hodowli chondrocytów w środowisku 50-proc. FBS, a największe w środowisku 50-proc. SF. Stężenie uwalnianego LDH zwiększało się proporcjonalnie w czasie doświadczenia, najwyższe zwiększenie stężenia również odnotowano w przypadku hodowli chondrocytów na biorusztowaniu w środowisku 50-proc. SF.
Inkubacja hodowli komórkowych z DOG ograniczała zwiększanie się zarówno stężeń zewnątrzkomórkowego LDH, ATP, jak i MDA, i to we wszystkich badanych hodowlach, co potwierdza możliwość ograniczenia stresu oksydacyjnego poprzez zablokowanie aktywności szlaku pentozofosforanowego w komórkach neutrofilów. Podobne wyniki autorzy uzyskali we wcześniejszych pracach – nekroza hodowanych komórek w hodowlach mieszanych, tj. neutrofilów z chondrocytami, była znacznie ograniczona po zahamowaniu aktywności szlaku pentozofosforanowego [28].

Podsumowanie

Z historycznego punktu widzenia śmierć komórek usiłowano zdefiniować już pod koniec XIX wieku [23]. Oprócz tradycyjnej nekrozy sugerowano istnienie innych rodzajów śmierci: koagulacyjnej nekrozy, autolizy, fizjologicznej śmierci komórek, chromatolizy (tak nazywano apoptozę w 1914 r.) czy onkozy (oncosis). Ostatnio dla określenia wszystkich śmierci niebędących apoptozą zaproponowano termin śmierci „wypadkowej” (accidental cell death) [23]. Zdaniem Takkei i wsp. [7] istnieje również bardzo specyficzny rodzaj śmierci, mianowicie śmierć neutrofilów będąca efektem ich aktywacji przez obcy materiał, która następuje w wyniku unikalnych, nieopisanych jeszcze reakcji komórki i którą należy określać mianem synxenatosis. Określenie to jest utworzone ze słów wskazujących na to, że śmierć komórki (death, tanato) jest wynikiem adhezji neutrofilów (syndesi) do zewnętrznego materiału (xeno) [7].
Wyniki badań autorów niniejszej pracy nie potwierdzają istnienia jakiejś nieznanej formy śmierci komórek przylegających do biorusztowań. W warunkach zbliżonych do warunków panujących w jamie stawu pacjentów z RZS komórki przylegające do biorusztowań podlegają typowej nekrozie. Wydaje się, że na rozbieżności w wynikach wpływają warunki przeprowadzanych doświadczeń, które powinny jednak maksymalnie wiernie odzwierciedlać warunki panujące in vivo. W swoich publikacjach autorzy niniejszej pracy sugerowali już konieczność stosowania fizjologicznych stężeń SF [8, 28]. Znaczący wpływ fizjologicznych stężeń SF na aktywność neutrofilów zanotowano również w innych doniesieniach [29, 30].
Dopiero w czasie eksperymentów prowadzonych na neutrofilach inkubowanych w warunkach zbliżonych do fizjologicznych, tj. w obecności 50- i 75-procentowego stężenia SF, udało się wykazać znaczący wpływ SF na proces apoptozy neutrofilów [29]. Gdy w celu odtworzenia warunków in vivo Icking-Kunert i wsp. [30] inkubowali neutrofile w obecności 50-proc. SF, zanotowali ich przekształcenie się w komórki dendrytycznopodobne (dendritic-like). Według cytowanych autorów to właśnie może być jedną z głównych przyczyn przekształcania się procesów zapalnych w zapalenia przewlekłe [30].
Niniejsza praca stanowi podsumowanie wstępnych badań nad możliwościami oddziaływania na przebieg procesu RZS, przy zastosowaniu terapii z wykorzystaniem implantów [8, 28]. Nasuwa się wniosek, że tylko badania prowadzone w warunkach możliwie maksymalnie wiernie odzwierciedlających warunki panujące in vivo mogą cokolwiek powiedzieć na temat rzeczywistych oddziaływań pomiędzy komórkami. Nie jest wykluczone, że umożliwi to nowe spojrzenie na wiele stosowanych dotąd procedur terapii biologicznej.

Piśmiennictwo

 1. Nadzam GS, De La Cruz C, Greco RS, et al. Neutrophil Adhesion to Vascular Prostethic Surfaces triggers Nonapoptotic Cell Death. Ann Surg 2000; 231: 587-599.  
2. Sedwitz MM, Hye RJ, Stabile BE. The changing epidemiology of psudoaneurysm. Arch Surg 1988; 123: 473-476.  
3. Zimmerli W, Lew PD, Waldvogel FA. Pathogenesis of foreign body infection: evidence for a local granulocyte defect. J Clin Invest 1984; 73: 1191-1200.  
4. Nathan CF. Neutrophil activation on biological surfaces. J Clin Invest 1987; 80: 1550-1560.  
5. Henson PM, Johnston RB Jr. Tissue injury in inflammation. J Clin Invest 1987; 79: 669-674.  
6. Tsan MF. Phorbol myristate actetate induced neutrophil autotoxicity. J Cell Physiol 1980; 105: 327-334.  
7. Takei H, Araki A, Watanabe H, et al. Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis and necrosis. J Leuko Biol 1996; 59: 229-240.  
8. Gajewski M, Szczepanik S, Wysocki Ł i wsp. The effect of increasing amounts of synovial fluid isolated from patients with rheumatoid arthritis on the respiratory burst of human neutrophils. Reumatologia 2009; 47: 273-281.  
9. Hissin PJ, Hilf R. A fluorometric method for determination of oxidized and reduced glutathione in tissues. Analytical Biochem 1976; 74: 214-226.
10. Kramer K, Rademaker B, Rosendal WN, et al. Influence of lipid peroxidation on B-adrenoceptors. FEBS Lett. 1986; 198: 80-84.
11. Edwards SW, Hallett MB. Seeing the wood for the trees: forgotten role of neutrophils in rheumatoid arthritis. Immunology Today 1997; 18: 320-324.
12. Demaurex N, Downey GP, Wadell TK, et al. Intracellular pH regulation during spreading of human neutrophils. J Cell Biol 1996; 133: 1391-1402.
13. Liu L, Elwing H, Karlson A, et al. Surface-related triggering of the neutrophil respiratory burst. Characterization of the response induced by IgG adsorbed to hydrophilic and hydrophobic glass surfaces. Clin Exp Immunol 1997; 109: 204-210.
14. Katz DA, Haimovich B, Greco RS. Neutrophil activation by expanded polytertrachloroethylene is dependent on the induction of protein phosphorylation. Surgery 1994; 116: 446-455.
15. Sato EF, Higashino M, Ikeda K, et al. Oxidative stress-induced cell death of human oral neutrophils. Am J Physiol 2003; 284: C1048-C1053.
16. Biagioni C, Favilli F, Catarzi S, et al. Redox state and O2- production in neutrophils of Crohn’s disease patients. Expert Biol Med 2006; 231: 186-195.
17. Scheel-Toellner D, Wang K, Craddock R, et al. Reactive oxygen species limit neutrophil life span by activating death receptor signaling. Blood 2004; 104: 2557-2564.
18. Del Carlo M, Loeser RF. Increased oxidative stress with aging reduces chondrocyte survival. Correlation with intracellular glutathione levels. Arthritis Rheum 2003; 48: 3419-3430.
19. Del Carlo M, Loeser RF. Chondrocyte cell death mediated by reactive oxygen species-dependent activation of PKC-B1. Amer J Physiol Cell Physiol 2006; 290: C802-C811.
20. Green DM, Noble PC, Ahuero JS, Birdsall HH. Cellular events leading to chondrocyte death after cartilage impact injury. Arthritis Rheum 2006; 54: 1509-1517.
21. Kurz B, Lemke A, Kehn M, et al. Influence of tissue maturation and antioxidants on the apoptotic response of articular cartilage after injurious compression. Arthritis Rheum 2004; 50: 123-130.
22. Graff RD, Lazarowski ER, Banes AJ, et al. ATP release by mechanically loaded porcine chondrons in pellet culture. Arthritis Rheum 2000; 43: 1571-1579.
23. Gibson JS, Milner PI, White R, et al. Oxygen and reactive oxygen species in articular cartilage: modulators of ionic homeostasis. Pflugers Arch 2008; 455: 563-573.
24. Borsiczky B, Szabo Z, Jaberansari MT, et al. Activated PMNs leads to oxidative stress on chondrocytes: a study of swine kness. Acta Orthop Scand 2003; 74: 190-195.
25. Chung R, Cool JC, Scherer MA, et al. Roles of neutrophil-mediated inflammatory response in the bony repair of injured growth plate cartilage in young rats. J Leukoc Biol 2006; 80: 1272-1280.
26. Castillo EC, Kouri JB. A new role for chondrocytes as non-professional phagocytes. An in vitro study. Microsc Res Tech 2004; 64: 269-278.
27. Majno G, Joris I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol 1995; 146: 3-15.
28. Gajewski M, Warnawin E, Gajewska J i wsp. Badania nad mechanizmem toksycznego oddziaływania neutrofilów na chondrocyty hodowane w różnych stężeniach tlenu. Reumatologia 2006; 44: 76-86.
29. Bell AL., Magill MK, Irvine AE. Human blood and synovial fluid neutrophils cultured in vitro undergo programmed cell death which is promoted by the addition of synovial fluid. Ann Rheum Dis 1995; 54: 910-915.
30. Iking-Konert C, Ostendorf B, Sander O, et al. Transdifferentiation of polymorphonuclear neutrophils to dendritic-like cells at the site of inflammation in rheumatoid arthritis: evidecne for activation by the T cells. Ann Rheum Dis 2005; 64: 1436-1442.