Intestinal barrier disfunction and endotoxemia – links in the inflammatory cascade in alcoholic liver disease

Wstęp
Śmiertelność z powodu alkoholowej choroby wątroby (AChW) w USA i w krajach Europy Zachodniej oszacowano na ok. 5–6%, co sprawia, że zajmuje ona 9. miejsce wśród najczęstszych przyczyn zgonów w tej populacji [1]. Średnie spożycie alkoholu przez dorosłego Europejczyka w 2005 r. wynosiło 11 l, a w Polsce, gdzie nadużywanie alkoholu osiągnęło status choroby społecznej, 9,5 l [2]. Kryteria uzależnienia od alkoholu spełnia ok. 2% dorosłych Polaków [3]. Prawie u wszystkich nadużywających alkoholu pacjentów rozwija się stłuszczenie wątroby, jednak tylko u 10–35% stwierdza się alkoholowe zapalenie wątroby, a progresję do marskości obserwuje się u ok. 8–20% chorych [1, 2].
Analiza danych epidemiologicznych pozwala przypuszczać, że poza nadmiernym spożyciem alkoholu również inne czynniki muszą odgrywać rolę w patogenezie tego schorzenia. Wyniki badań z ostatnich lat wskazują, że etanol, jego metabolity oraz lipopolisacharydy (LPS) bakterii jelitowych wspólnie mogą mieć kluczowe znaczenie dla wystąpienia i rozwoju tej choroby. W piśmiennictwie medycznym istnieje już sporo dowodów na to, że destrukcja bariery jelitowej i endotoksemia stanowią istotny kofaktor w inicjacji i prawdopodobnie również progresji AChW [4–7]. Wyniki badań eksperymentalnych wskazują, że skojarzone oddziaływanie etanolu i endotoksyn uszkadza wątrobę w większym stopniu niż każda z tych substancji osobno [8]. Oznaczenia stężenia endotoksyn we krwi osób z AChW wykazały, że 5–20 razy przewyższa ono poziom obserwowany u zdrowych osobników [9, 10].

Źródło endotoksemii u osób z alkoholową chorobą wątroby
Endotoksyny to LPS pochodzące ze ściany komórkowej bakterii Gram-ujemnych. W skład krążących endotoksyn wchodzą zarówno obumarłe bakterie, jak i LPS ścian komórkowych bakterii żywych. W normalnych warunkach absorpcja endotoksyn jest regulowana przez sprawnie działającą barierę śluzówkową jelit i tylko niewielka ich ilość przenika do krwi wrotnej [4, 6]. Klirens LPS z krwi odbywa się przy udziale komórek śródbłonka zatok wątrobowych (liver sinusoida endothelial cells – LSEC), które stanowią pierwszą linię obrony przed szkodliwymi cząsteczkami napływającymi z przewodu pokarmowego [11]. Komórki śródbłonka zatok wątrobowych są odpowiedzialne za usuwanie z krążenia drogą endocytozy rozpuszczalnych makromolekuł i substancji koloidowych (cząsteczek mniejszych niż 100 nm), podczas gdy komórki Kupffera (Kupffer cells – KC) – rezydujące w wątrobie makrofagi – odpowiadają za eliminację nierozpuszczalnych molekuł drogą fagocytozy [12]. W fizjologicznych warunkach zarówno KC, jak i LSEC uczestniczą w regulacji stężenia LPS w wątrobie i utrzymują reakcje zapalne na minimalnym poziomie. Konsumpcja alkoholu zaburza funkcjonowanie i szczelność bariery jelitowej, zwiększając dowóz LPS do wątroby, co przerywa stan homeostazy. Zwiększenie stężenia endotoksyny we krwi pod wpływem ekspozycji na etanol mogą nasilać trzy czynniki:
1) przerost bakterii jelitowych – u alkoholików stwierdzono zwiększoną liczbę mikroorganizmów w aspiratach z jelita cienkiego w porównaniu z osobami zdrowymi; wykazano, że etanol spowalnia motorykę żołądkowo-jelitową, a to sprzyja przerostowi bakterii w świetle przewodu pokarmowego [6, 13];
2) dysfunkcja bariery śluzówkowej jelit – wyniki badań wskazują, że konsumpcja alkoholu zwiększa przepuszczalność błony śluzowej jelit w stosunku do makromolekuł zarówno u alkoholików, jak i u zdrowych osobników [7, 10];
3) zmniejszony klirens endotoksyn z krwi – etanol upośledza czynność fagocytarną KC i zmniejsza wychwyt endotoksyn z krwi, nasilając ich przeciek do krążenia systemowego [4, 14].
Gdy dowóz endotoksyn przewyższa zdolność do ich usunięcia, dochodzi do: 1) lokalnej aktywacji KC [14], 2) upośledzenia funkcji oczyszczającej, wzmożonej ekspresji molekuł włóknienia (fibronektyna) i nasilonej apoptozy LSEC [5] oraz 3) zwiększenia poziomu endotoksyn w krążeniu systemowym [negatywnie oddziałuje na inne narządy: zapalenie trzustki, zespół ostrej niewydolności oddechowej dorosłych (acute respiratory distress syndrome – ARDS), uszkodzenie mózgu] [6].
U przewlekle nadużywających alkoholu pacjentów z AChW wzrost przepuszczalności bariery jelitowej (leaky gut syndrome, leaky intestine) utrzymuje się długo, nawet do 2 tyg. po jego odstawieniu. U zdrowych osobników i alkoholików bez AChW dysfunkcja ma charakter przejściowy [6].
Udział endotoksemii w patogenezie AChW przedstawiono na rycinach 1. i 2.

Mechanizm uszkodzenia bariery jelitowej przez aldehyd octowy
Mikroflora jelit odgrywa istotną rolę w powstawaniu i akumulacji aldehydu octowego w świetle okrężnicy.
Z obserwacji uzyskanych w warunkach doświadczalnych wynika, że sam etanol prawdopodobnie bezpośrednio negatywnie nie wpływa na barierę jelitową.
W warunkach in vitro do upośledzenia bariery jelitowej było potrzebne jego stężenie ponad 1% [4]. Tak duże stężenie alkoholu nie zdarza się w dystalnym odcinku przewodu pokarmowego, nawet u alkoholików.
Wyniki badań sugerują, że kluczową rolę w zaburzeniach bariery jelitowej odgrywa aldehyd octowy. Dysfunkcję taką wykazano w błonie śluzowej okrężnicy ludzkiej [15]. Wydaje się, że rozkład etanolu do aldehydu octowego w obrębie światła jelita grubego jest niezbędnym warunkiem do przerwania bariery jelitowej. Głównym źródłem aldehydu octowego w tym obszarze są przemiany metaboliczne generowane przy udziale dehydrogenazy bakterii jelitowych, mimo że komórki nabłonka jelitowego również wykazują ekspresję tego enzymu [4, 16]. Do akumulacji acetaldehydu w świetle jelit dochodzi w wyniku niewielkiej zdolności jego dalszego rozkładu do kwasu octowego przez mikroflorę przewodu pokarmowego. Zastosowanie antybiotyku częściowo zmniejsza stężenie jelitowego acetaldehydu, co potwierdza rolę mikroflory jelitowej w wytwarzaniu tego związku w świetle przewodu pokarmowego. Dwunastodniowa antybiotykoterapia redukowała przepuszczalność bariery jelitowej wyindukowaną u szczurów etanolem. Równolegle obserwowano zmniejszenie endotoksemii [17].

Molekularny mechanizm dysfunkcji bariery jelitowej
Molekularny mechanizm uszkodzenia bariery jelitowej przez aldehyd octowy jest złożony. Przerwaniu ulegają ścisłe łącza komórkowe (tight junctions – TJ) oraz połączenia przylegające (adherens junctions – AJ). Każdy typ połączeń ma specyficzne komponenty białkowe. Należą do nich białka przezbłonowe: typowe dla połączeń ścisłych (TJ) – okludyna, klaudyna; typowe dla połączeń przylegających (AJ) – kadheryna oraz tzw. białka peryferyjne reprezentowane przez białka strefy zamykającej (zonula occludens-1, czyli ZO-1, głównie w ścisłych łączach komórkowych TJ); oraz kateniny (w połączeniach przylegających, AJ). Ta ostatnia grupa białek peryferyjnych pozostaje w związku z mikrofilamentami aktynowymi cytoszkieletu komórki [18, 19].
Łącza komórkowe to wyspecjalizowane kompleksy połączeń międzykomórkowych, które tworzą barierę dla dyfuzji makromolekuł, natomiast AJ są zlokalizowane poniżej TJ i nie stanowią fizycznej bariery dla dyfuzji makromolekuł. Połączenia przylegające w sposób pośredni regulują integralność TJ i dlatego wpływają na funkcję bariery nabłonka. Zarówno TJ, jak i AJ są regulowane poprzez transdukcję sygnałów wewnątrzkomórkowych. Aldehyd octowy zmniejsza aktywność fosfa-tazy tyrozynowej i zwiększa fosforylację tyrozyny w połączeniach TJ i AJ. Prowadzi to do dysocjacji białek od cytoszkieletu aktynowego oraz redystrybucji E-kadheryny i -kateniny w połączeniach międzykomórkowych i w pierwszym rzędzie zaburza integralność AJ. Zmiany te prawdopodobnie stanowią sygnał do przerwania TJ. Dezintegrację połączeń TJ i AJ pod wpływem aldehydu octowego w biopunktatach błony śluzowej jelita grubego ludzi opisali Basuroy i wsp. [15].
Alkohol może zwiększać przepuszczalność jelitową również poprzez nasilanie ekspresji indukowanej syntazy tlenku azotu (inducible nitric oxide synthase – iNOS). W badaniach na ludzkich liniach komórkowych Caco-2 stwierdzono wzmożoną syntezę tlenku azotu (NO) oraz wolnego rodnika nadtlenkowego [6, 20]. Towarzyszył temu zwiększony stopień nitrowania i utleniania tubuliny oraz uszkodzenie mikrotubul cytoszkieletu komórek. Wyniki badań sugerują, że NO i wolny rodnik nadtlenkowy, wytwarzane po ekspozycji na etanol, mogą reagować ze sobą i tworzyć anion nadtlenoazotynu (ONOO–), który ostatecznie upośledza funkcję bariery jelitowej. Podanie inhibitora iNOS lub zmiatacza wolnych rodników (L-cysteina) zmniejszało uszkodzenia generowane alkoholem [6].

Profilaktyka zaburzeń bariery śluzówkowej po ekspozycji na etanol
W badaniach doświadczalnych zidentyfikowano kilka czynników, które zapobiegają uszkodzeniom bariery jelitowej przez alkohol i budzą nadzieję na możliwość potencjalnego ich wykorzystania w strategii terapeutycznej AChW. Należą do nich: epidermalny czynnik wzrostu (epidermal growth factor – EGF), L-glutamina, płatki owsiane, cynk i probiotyki.
Epidermalny czynnik wzrostu uwalniany w ślinie i innych wydzielinach przewodu pokarmowego chroni integralność błony śluzowej. Wykazano, że EGF zapobiega uszkodzeniom TJ pod wpływem acetaldehydu poprzez stabilizację cytoszkieletu aktynowego oraz przeciwdziałanie dysocjacji białek TJ i AJ za pośrednictwem supresji aktywności enzymu iNOS [21].
L-glutamina stanowi podstawowy składnik odżywczy dla wzrostu i różnicowania się komórek nabłonka jelit. Jej ochronne działanie wynika z przeciwdziałania redystrybucji białek (okludyny, ZO-1, E-kadheryny, -kateniny) połączeń międzykomórkowych pod wpływem aldehydu octowego. Efekt ten L-glutamina wywiera za pośrednictwem receptora EGF. Ochronne działanie tego związku wykazano również w błonie śluzowej jelita grubego ludzi [15, 22].
Wyniki przeprowadzonych badań wykazały również, że suplementacja cynku oraz podaż płatków owsianych redukują uszkodzenie wątroby w połączeniu ze zmniejszeniem wyindukowanej etanolem przepuszczalności bariery jelitowej i endotoksemii [4, 6, 23]. Mechanizm działania powyższych czynników pozostaje w sferze badań.
Ochronną rolę probiotyków (Lactobacillus GG, Bifidobacteria) zaobserwowano w alkoholowym uszkodzeniu wątroby w modelu zwierzęcym. Mechanizm tego działania może wiązać się z hamowaniem przez probiotyki wzrostu bakterii jelitowych, co wtórnie przeciwdziała destrukcji bariery jelitowej i endotoksemii. Stwierdzono ponadto, że Lactobacillus rhamnosus GG ma zdolność metabolizowania aldehydu octowego do kwasu octowego. Probiotyki mogą więc zmniejszać ilość toksycznego dla nabłonka jelitowego aldehydu octowego dwutorowo: 1) poprzez redukcję źródła jego wytwarzania (bakterii jelitowych) oraz 2) poprzez metabolizowanie aldehydu octowego do kwasu octowego. Doniesienia te wymagają potwierdzenia w kolejnych badaniach [4, 6, 24].

Rola endotoksemii w patogenezie alkoholowej choroby wątroby
Endotoksemia wywołuje uszkodzenie wątroby poprzez aktywację KC i inicjację ich profibrogennych i prozapalnych efektów [4–6]. Ekspozycja na etanol zwiększa stężenie LPS we krwi wrotnej. W krwiobiegu LPS łączą się z osoczowym białkiem transportującym (lipopolysaccharide binding protein – LBP) i docierają do wątroby. Do aktywacji KC dochodzi w wyniku interakcji kompleksu LPS–LBP z receptorami błony komórkowej – powierzchniowym CD14 i przezbłonowym TLR4 [4, 6, 14]. Białko CD14 mające wysokie powinowactwo do endotoksyny pośredniczy w rozpoznaniu LPS przez TLR4. TLR4 jest receptorem zaangażowanym w rozpoznawanie endotoksyn bakterii Gram-ujemnych. W odróżnieniu od białka CD14, TLR4 zawiera przezbłonową domenę sygnałową, która umożliwia transdukcję sygnału i aktywację jądrowego czynnika transkrypcyjnego (nuclear factor B – NFB). W następstwie tej sygnalizacji dochodzi do intensywnej syntezy wolnych rodników tlenowych, chemokin i cytokin prozapalnych (głównie TNF- i TGF-1) [6, 14]. Rezultatem swoistej identyfikacji LPS przez KC jest rozwój kaskady zapalnej w wątrobie, tzn. wybiórcza aktywacja i gromadzenie komórek układu immunologicznego w celu skutecznego usunięcia obcej cząsteczki. Wydaje się, że przewlekła ekspozycja na etanol – w odróżnieniu od ekspozycji ostrej – zwiększa wrażliwość KC na stymulację LPS i dodatkowo wzmaga produkcję cytokin prozapalnych. Stwierdzono również zwiększoną ekspresję CD14, co może sprzyjać tym efektom [25].
Aktywowane przez LPS KC, w wyniku zwiększonej syntezy TGF-1, mogą pośredniczyć w aktywacji i proliferacji komórek gwiaździstych wątroby (hepatic stellatae cells – HSC) – kluczowego regulatora procesu włóknienia wątroby. Efektem aktywacji HSC jest w dalszej kolejności wzmożona synteza kolagenu i białek macierzy międzykomórkowej oraz włóknienie wątroby [26].
Stymulowana intensywną produkcją cytokin rekrutacja i napływ do wątroby komórek zapalnych z krążenia obwodowego potęgują uszkodzenie hepatocytów i zwrotnie podtrzymują proces aktywacji HSC. W taki sposób przewlekła konsumpcja alkoholu może prowadzić do marskości wątroby i wszelkich jej negatywnych skutków klinicznych (krwotoki z żylaków przełyku, encefalopatia wątrobowa, wodobrzusze).
W podsumowaniu należy stwierdzić, że:
1) konsumpcja alkoholu prowadzi do przerwania bariery jelitowej oraz endotoksemii – istotnego ogniwa kaskady zapalnej w patogenezie AChW,
2) dehydrogenaza bakterii jelitowych jest głównym źródłem syntezy i akumulacji toksycznego dla nabłonka jelit aldehydu octowego w świetle przewodu pokarmowego,
3) molekularny mechanizm uszkodzenia bariery jelitowej przez aldehyd octowy opiera się na procesach: fosforylacji i destrukcji TJ i AJ oraz nitrowania i utleniania tubuliny, a w konsekwencji uszkodzenia cytoszkieletu komórek,
4) wyniki badań doświadczalnych wskazują, że redukcję endotoksemii w AChW można uzyskać poprzez zastosowanie probiotyków (Lactobacillus GG, Bifidobacteria), L-glutaminy, EGF, podaż płatków owsianych lub suplementację cynku,
5) aktywowane przez LPS KC stanowią istotny element w inicjacji i/lub progresji AChW.

Piśmiennictwo
1. Vidali M, Stewart SF, Albano E. Interplay between oxidative stress and immunity in the progression of alcohol-mediated liver injury. Trends Mol Med 2008; 14: 63-71.
2. Hartleb M, Czech E. Alkoholowa choroba wątroby. Przegl Gastroenterol 2007; 2: 92-100.
3. Profilaktyka i rozwiązywanie problemów alkoholowych w sa­mo­rzą­dach lokalnych. Zestawienia statystyczne. Wydaw­nictwo Edukacyjne PARPA, Warszawa 2006.
4. Rao R. Endotoxemia and gut barrier dysfunction in alcoholic liver disease. Hepatology 2009; 50: 638-44.
5. Schaffert CS, Duryee MJ, Hunter CD, et al. Alcohol metabolites and lipopolysaccharide: roles in the development and/or progression of alcoholic liver disease. World J Gastroenterol 2009; 15: 1209-18.
6. Purohit V, Bode JC, Bode C, et al. Alcohol, intestinal bacterial growth, intestinal permeability to endotoxin, and medical consequences: summary of a symposium. Acohol 2008; 42: 349-61.
7. Keshavarzian A, Farhadi A, Forsyth CB, et al. Evidence that chronic alcohol exposure promotes intestinal oxidative stress, intestinal hyperpermeability and endotoxemia prior to development of alcoholic steatohepatitis in rats. J Hepatol 2009; 50: 538-47.
8. Lambert JC, Zhou Z, Wang L, et al. Prevention of alteration in intestinal permeability is involved in zinc inhibition of acute etanol- induced liver damage in mice. J Pharmacol Exp Ther 2003; 305: 880-6.
9. Fujimoto M, Uemura M, Nakatani Y, et al. Plasma endotoxin and serum cytokine levels in patients with alcoholic hepatitis: relation to severity of liver disturbance. Alcohol Clin Exp Res 2000; 24: 48S-54S.
10. Parlesak A, Schäfer C, Schütz T, et al. Increased intestinal permeability to macromolecules and endotoxemia in patients with chronic alcohol abuse in different stages of alcohol-induced liver disease. J Hepatol 2000; 32: 742-47.
11. Knolle PA, Limmer A. Control of immune responses by savenger liver endothelial cells. Swiss Med Wkly 2003; 133: 501-6.
12. Gao B, Jeong WI, Tian Z. Liver: an organ with predominant innate immunity. Hepatology 2008; 47: 729-36.
13. Bode C, Kolepke R, Schäfer K, Bode JC. Breath hydrogen excretion in patients with alcoholic liver disease – evidence of small intestinal bacterial overgrowth. Z Gastroenterol 1993; 31: 3-7.
14. Hines IN, Wheeler MD. Recent advances in alcoholic liver disease III. Role of the innate immune response in alcoholic hepatitis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2004; 287: 310-4.
15. Basuroy S, Sheth P, Mansbach CM, Rao RK. Acetaldehyde disrupts tight junctions and adherens junctions in human colonic mucosa: protection by EGF and L-glutamine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2005; 289: G367-75.
16. Salaspuro M. Bacteriocolonic pathway for ethanol oxidation: characteristics and implications. Ann Med 1996; 28: 195-200.
17. Ferrier L, Berard F, Debrauwer L, et al. Impairment of the intestinal barrier by ethanol involves enteric microflora and mast cell activation in rodents. Am J Pathol 2006; 168: 1148-54.
18. Hartsock AW, Nelson JW. Adherens and tight junctions: structure, function and connections to the actin cytoskeleton. Biochim Biophys Acta 2008; 1778: 660-9.
19. Miyoshi J, Takai Y. Structural and functional associations of apical junctions with cytoskeleton. Biochim Biophys Acta 2008; 1778: 670-91.
20. Tang Y, Forsyth CB, Farhadi A, et al. Nitric oxide-mediated intestinal injury is required for alcohol-induced gut leakiness and liver damage. Alcohol Clin Exp Res 2009; 33: 1220-30.
21. Sheth P, Seth A, Thangavel M, et al. Epidermal growth factor prevents acetaldehyde-induced paracellular permeability in Caco-2 cell monolayer. Alcohol Clin Exp Res 2004; 28: 797-804.
22. Seth A, Basuroy S, Sheth P, et al. L-Glutamine ameliorates acetaldehyde-induced increase in paracellular permeability in Caco-2 cell monolayer. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2004; 287: G510-7.
23. Tang Y, Forsyth CB, Banan A, et al. Oats supplementation prevents alcohol-induced gut leakiness in rats by preventing alcohol-induced oxidative tissue damage. J Pharmacol Exp Ther 2009; 329: 952-8.
24. Forsyth CB, Farhadi A, Jakate SM, et al. Lactobacillus GG treatment ameliorates alcohol-induced intestinal oxidative stress, gut leakiness, and liver injury in a rat model of alcoholic steatohepatitis. Alcohol 2009; 43: 163-72.
25. Yin M, Bradford BU, Wheeler MD, et al. Reduced early alcohol-induced liver injury in CD14-deficient mice. J Immunol 2001; 166: 4737-42.
26. Kasztelan-Szczerbińska B, Słomka M, Daniluk J i wsp. Komórki gwiaździste jako główny regulator sygnalizacji międzyko­mórkowej w procesie włóknienia wątroby. Postępy Nauk Medycznych 2010; 23: 68-73.