Isoenzymes A and B of N-acetyl-β-D-hexosaminidase in tissue of colon cancer

Wstęp

Prognoza dla Polski zakłada szybki wzrost zachorowalności na nowotwory jelita grubego i umieralności z ich powodu mężczyzn w wieku średnim (45–64 lata) i dojrzałym (po 65. roku życia). Wśród kobiet prognozuje się niewielki wzrost zachorowalności i dalsze ograniczenie umieralności [1]. Szacuje się, że na nowotwory jelita grubego w 2025 roku zachoruje około 15 500 mężczyzn i 9100 kobiet [1]. W ciągu najbliższych dwóch dekad liczba zgonów z powodu nowotworów jelita grubego zwiększy się prawdopodobnie w populacji mężczyzn prawie dwukrotnie (do około 10 000) i o około 1/3 w populacji kobiet (do 6400) [1].

W usuwaniu glikokoniugatów (glikolipidów, glikoprotein i proteoglikanów) tkanek zniszczonych przez nowotwór bierze udział N-acetylo-β-D-heksozoaminidaza – HEX (E.C. 3.2.1.25), najaktywniejsza kwaśna egzoglikozydaza lizosomalna odszczepiająca reszty N-acetyloglukozoaminy (GlcNAc) i N-acetylogalaktozoaminy (GalNAc) z nieredukcyjnego końca łańcuchów oligosacharydowych glikokoniugatów [2, 3].

Wcześniejsze badania wskazują na dużą wartość diagnostyczną oznaczenia stężenia HEX i jej izoenzymów A i B w surowicy, a także stężenia HEX oraz jej izoenzymów A i B w przeliczeniu na kreatyninę w moczu chorych na raka jelita grubego. Także oznaczanie aktywności specyficznej HEX i izoenzymu A w moczu ma wartość diagnostyczną w wykrywaniu raka jelita grubego [4].

Cel

Celem badań była ocena aktywności HEX oraz jej izoenzymów A i B w guzach nowotworowych pobranych od chorych z gruczolakorakiem jelita grubego i gruczolakorakiem śluzotwórczym jelita grubego, z uwzględnieniem typu histopatologicznego, klasyfikacji Duke’a oraz płci.

Materiał i metody

Podczas zabiegu chirurgicznego pobrano fragmenty tkanki nowotworowej o stopniu dojrzałości komórkowej G2 od 17 chorych (11 kobiet i 6 mężczyzn) w wieku 39–82 lat (średnia: 68,39 ±11,34 roku) z rozpoznanym gruczolakorakiem (n = 15) i gruczolakorakiem śluzotwórczym (n = 2) jelita grubego oraz fragmenty jelita pobranego z miejsc odległych od zmiany nowotworowej o 5 cm (granica czystości onkologicznej) (n = 15). Cztery wycięte nowotwory nie przekraczały ściany jelita (klasa A według Duke’a), 5 wyciętych nowotworów przekraczało ścianę jelita do surowicówki lub tkanki tłuszczowej okołoodbytniczej (klasa B), a 8 dało przerzuty do węzłów chłonnych (klasa C). Materiał do badań uzyskano od pacjentów leczonych w I Klinice Chirurgii Ogólnej i Endokrynologii Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku za zgodą Komisji Bioetycznej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku (RI-003/300/2006).

Fragmenty tkanek zawieszano w oziębionym 0,15-molowym roztworze KCl zawierającym 0,2% trytonu X-100 w stosunku wagowo-objętościowym 1 : 9 i homogenizowano za pomocą homogenizatora nożowego Ultra-turrax T8 IKA-Werke w naczyniach obłożonych lodem. Homogenaty wirowano przy 10 000 × γ w ciągu 30 min w temperaturze +4°C. Płyn nadosadowy przechowywano w temperaturze –80°C.

N-acetylo-β-D-heksozoaminidazę i jej izoenzymy A i B oznaczano metodą Marciniak i wsp. [5] w modyfikacji Szajdy i wsp. [4, 6]. Do 10 µl odpowiednio rozcieńczonego płynu nadosadowego z odwirowanego homogenatu dodawano 40 µl 0,1-molowego buforu fosforanowo-cytrynianowego o pH 4,7 i 30 µl 20-milimolowego roztworu substratu (4-nitrophenylo-N-acetylo-β-D-glukozoaminid – Sigma, St. Louis, MO, USA) w 0,1-molowym buforze fosforanowo-cytrynianowym o pH 4,7. Mieszaninę inkubowano 60 min w temperaturze 37°C. Reakcję przerywano przez dodanie 200 µl 0,2-molowego buforu boranowego o pH 9,8. W celu oznaczenia aktywności izoenzymu B do 10 µl odpowiednio rozcieńczonego płynu nadosadowego z odwirowanego homogenatu dodawano 40 µl 0,1-molowego buforu fosforanowo--cytrynianowego o pH 4,7 i preinkubowano 180 min w temperaturze 50°C w celu dezaktywacji termolabilnego izoenzymu A, a następnie dodawano 30 µl 20-milimolowego roztworu substratu i inkubowano 60 min w temperaturze 37°C. Reakcję przerywano przez dodanie 200 µl 0,2-molowego buforu boranowego o pH 9,8. Aktywność izoenzymu A obliczano z różnicy między aktywnością HEX i HEX B (HEX A = HEX – HEX B). Aktywność HEX i HEX B, odpowiadającą ilości uwolnionego p-nitrofenolu z 4-nitrofenylo-N-acetylo-β-glukozoaminidu, mierzono przy długości fali 405 nm przy użyciu czytnika płytek ELX800 i programu komputerowego KC junior (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA).

Białko w homogenatach tkanek oznaczano metodą Lowry’ego i wsp. [7]. Stężenie białka odczytywano z krzywej wzorcowej sporządzonej dla liofilizowanej albuminy (Sigma, St. Louis, MO, USA). Aktywności HEX oraz jej izoenzymów A i B wyrażono w nKat na 1 mg białka (aktywność specyficzna) i w nKat na 1 γ mokrej tkanki.



Analiza statystyczna



Do analizy statystycznej wyników testem Manna-Whitneya wykorzystano program SPSS® 8.0 for Windows PL (SPSS, Chicago, IL, USA). Korelacje badano przy użyciu testu Spearmana. Wartości p mniejsze niż 0,05 uznano za statystycznie istotne. Badania powtarzalności (precyzji w serii) oznaczania HEX wykonano w 6 nadsączach z homogenatów tkanek kontrolnych jelita grubego (oddalonych od guza o 5 cm).

Wyniki

Współczynnik zmienności pomiarów aktywności HEX wykonanych w 6 próbkach makroskopowo niezmienionego jelita pobranych podczas operacji od pacjentów z gruczolakorakiem jelita grubego wynosił 4,69 ±0,66.

Badanie wskazuje na istotny wzrost aktywności specyficznej (nKat/1 mg białka) oraz stężenia (nKat/1 γ mokrej tkanki) HEX i jej izoenzymów A i B w tkankach gruczolakoraka jelita grubego w porównaniu z makroskopowo niezmienionymi fragmentami kontrolnymi jelita (tab. I). W porównaniu z tkanką kontrolną na podstawie klasyfikacji Duke’a stwierdzono istotnie wyższą aktywność specyficzną HEX B oraz stężenie HEX i HEX B w guzach jelita grubego klasy A, istotnie wyższą aktywność specyficzną HEX B i stężenie HEX, jej izoenzymów A i B w guzach klasy B oraz istotnie wyższą aktywność specyficzną i stężenie w klasie C (tab. II). Odnotowano także istotnie wyższą aktywność specyficzną HEX B oraz stężenie HEX i HEX B w tkance raka jelita grubego klasy A w porównaniu z klasą B. Nie stwierdzono natomiast istotnych różnic między aktywnością HEX i jej izoenzymów A i B w tkankach raka jelita grubego kobiet i mężczyzn (tab. III).

Nie odnotowano istotnych zależności (korelacji) między aktywnością specyficzną HEX (r = –0,4360, p = 0,119), HEX A (r = –0,2370, p = 0,415) i HEX B (r = –0,43875, p = 0,171) oraz stężeniem HEX (r = –0,4375, p = 0,118), HEX A (r = –0,3566, p = 0,211) i HEX B (r = –0,2411, p = 0,406) a etapem rozwoju nowotworu według klasyfikacji Duke’a.

Omówienie

Rola HEX i jej izoenzymów A i B w procesie nowotworzenia nie jest dokładnie poznana. Wydaje się, że podobnie jak inne endo- [8] i egzoglikozydazy [9, 10] mogą one uczestniczyć w niszczeniu tkanki przez guz, wpływać na interakcje komórka–komórka i/lub degradację macierzy wewnątrzkomórkowej [11, 12]. Zdaniem Lewa i wsp. [13] HEX A działający na kwaśne substraty, takie jak glikozoaminoglikany i glikolipidy oraz glikoproteiny zawierające kwasy sialowe, jest mediatorem stanu zapalnego wydzielanym do przestrzeni zewnątrzkomórkowej, odzwierciedla w płynach ustrojowych aktywność metaboliczną i wydzielniczą komórek. HEX B działający na obojętne łańcuchy oligosacharydowe jest wskaźnikiem uszkodzenia komórek [13].

Badania własne wskazują na istotny wzrost aktywności specyficznej i stężenia HEX, jej izoenzymów A i B w tkance gruczolakoraka jelita grubego w porównaniu z fragmentami tkanki kontrolnej (tab. I). W badaniach wykazano, że HEX B już od wczesnej fazy (klasa A według Duke’a) uczestniczy w rozwoju raka jelita grubego (tab. II). Badania własne potwierdziły wyniki Plucinsky’ego i wsp. [14], którzy nie stwierdzili zależności między aktywnością HEX i HEX B w tkance guza jelita grubego a fazą rozwoju nowotworu według klasyfikacji Duke’a. Analiza uzyskanych wyników własnych wskazuje na brak zależności między aktywnością HEX i jej izoenzymów A i B w tkance zdrowej i nowotworowej a płcią.

Wychodząc z założenia, że HEX i jej izoenzymy przechodzą do kału razem ze złuszczonymi komórkami gruczolakoraka, w badaniach własnych sugeruje się celowość przeprowadzenia prób oznaczania aktywności HEX w kale pacjentów z rakiem jelita grubego. Jeżeli uda się oznaczyć aktywność HEX i jej izoenzymów w kale i wykazać jej znamienny wzrost u pacjentów z rakiem jelita grubego, może to być podstawą opracowania metody uzupełniającej oznaczenia krwi utajonej w kale, uznawanej obecnie za badanie przesiewowe w kierunku raka jelita grubego [15].

Wnioski

Istotnie wyższa aktywność HEX i jej izoenzymów A i B w tkankach guza jelita grubego w porównaniu z tkanką jelita grubego makroskopowo niezmienioną wskazuje na wzrost katabolizmu glikokoniugatów w tkance raka jelita grubego. Wykrycie oznaczalnych aktywności HEX i jej izoenzymów w kale pacjentów z nowotworami jelita grubego może być podstawą opracowania markera użytecznego w badaniach przesiewowych w kierunku raka jelita grubego.

Piśmiennictwo

 1. Didkowska J, Wojciechowska U, Zatoński W. Prognozy zachorowalności i umieralności na nowotwory złośliwe w Polsce do 2025 roku. Centrum Onkologii Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie, Warszawa 2009: 23-8.

 2. Winchester B. Lysosomal metabolism of glycoproteins. Glycobiology 2005; 15: 1R-15R.

 3. Zwierz K, Zalewska A, Zoch-Zwierz W. Isoenzymes of N-acetyl-beta-hexosaminidase. Acta Biochim Polon 1999; 46: 739-51.

 4. Szajda SD, Borzym-Kluczyk M, Snarska J, et al. N-acetyl-beta-D-hexosaminidase and its isoenzymes A and B in blood serum and urine, as a potential colon cancer markers. Hepatogastroenterology 2009; 56: 1287-98.

 5. Marciniak J, Zalewska A, Popko J, Zwierz K. Optimization of an enzymatic method for the determination of lysosomal N-acetyl-beta-D-hexosaminidase and beta-glucuronidase in synovial fluid. Clin Chem Lab Med 2006; 44: 933-7.

 6. Szajda SD, Snarska J, Puchalski Z, Zwierz K. Lysosomal exoglycosidases in serum and urine of patients with colon adenocarcinoma. Hepatogastroenterology 2008; 55: 921-5.

 7. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem 1951; 193: 265-75.

 8. Stypułkowska A, Zwierz P, Zwierz K. Endoglikozydazy i glikoamidazy. Post Bioch 2004; 50: 82-7.

 9. Chojnowska S, Kępka A, Szajda SD, et al. Exoglycosidase markers of diseases. Biochem Soc Trans 2011; 39: 406-9.

10. Waszkiewicz N, Szajda SD, Zalewska A, et al. Alcohol abuse and glycoconjugate metabolism. Folia Histochem Cytochem 2012; 50: 1-11.

11. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. Molecular biology of the cell. Garland Science, N.Y., 2002; 1313-62.

12. Laferte S, Loh LC. Characterization of a family of structurally related glycoproteins expressing beta1-6-branched asparagine-linked oligosaccharides in human colon carcinoma cells. Biochem J 1992; 283; 193-201.

13. Lew DB, Dempsey BK, Zhao Y, et al. Beta-hexosaminidase-induced activation of p44/42 mitogen-activated protein kinase is dependent on p21Ras and protein kinase C and mediates bovine airway smooth-muscle proliferation. Am J Respir Cell Mol Biol 1999; 21: 111-8.

14. Plucinsky MC, Prorok JJ, Alhadeff JA. Beta-hexosaminidase from colon and sera of dukes-classified colorectal cancer patients: activity levels, isozyme patterns, and kinetic properties. J Natl Cancer Inst 1986; 77: 57-62.

15. Kasztelan-Szczerbińska B, Cichoż-Lach H, Słomka M. Rak jelita grubego jako problem zdrowia publicznego – ocena aktualnych możliwości diagnostycznych. Pol Arch Med Wewn 2008; 118: 1-3.