Kotynina w moczu jako wskaźnik ekspozycji na dym tytoniowy w ocenie przebiegu klinicznego choroby Leśniowskiego-Crohna u dzieci i młodzieży – obserwacje własne

Wstęp
Choroba Leśniowskiego-Crohna jest jedną z postaci nieswoistych chorób zapalnych jelit i charakteryzuje się przewlekłym procesem zapalnym ściany przewodu pokarmowego. Poza objawami ze strony przewodu pokarmowego towarzyszy jej szeroki przekrój objawów pozajelitowych i ogólnych. Przebieg kliniczny u niektórych pacjentów może być powikłany współistnieniem innych schorzeń układowych. Choroba Leśniowskiego-Crohna ma przewlekły i nawrotowy charakter, ze skłonnością do okresowych zaostrzeń oraz samoistnych lub indukowanych leczeniem remisji. Przebieg kliniczny może być łagodny, jednak u części chorych staje się trudny do przewidzenia i wymaga modyfikacji długotrwałej farmakoterapii, a niekiedy leczenia chirurgicznego [1]. Mimo intensywnych prób określenia pierwotnej przyczyny wywołującej chorobę Leśniowskiego-Crohna oraz inne postacie nieswoistego zapalenia jelit, etiologia tych schorzeń – jak dotąd – pozostaje nieznana. W piśmiennictwie wymienia się wiele prawdopodobnych czynników etiologicznych, w tym genetyczne, autoimmunologiczne oraz środowiskowe [2–4]. Jednym z istotnych czynników środowiskowych modyfikujących przebieg choroby jest ekspozycja na dym tytoniowy [4–7]. Palenie tytoniu jest szeroko rozpowszechnionym nałogiem, który wg najnowszych danych Światowej Organizacji Zdrowia (World Health Organization – WHO) dotyczy ok. 37% mężczyzn i 19% kobiet na świecie. Dym papierosowy wywiera negatywny wpływ na zdrowie zarówno w grupie czynnych palaczy, jak i osób przebywających w ich otoczeniu. Powszechnie znany jest fakt biernego palenia tytoniu (ang. environmental smoking) u dzieci i młodzieży. Ekspozycja na dym tytoniowy w okresie prenatalnym i perinatalnym nie jest obojętna dla zdrowia i życia dziecka. Bardzo silna tytoniozależność zaznacza się w chorobach układu oddechowego, sercowo-naczyniowego, przewodu pokarmowego oraz nowotworach złośliwych płuc, krtani, jamy ustnej i gardła, trzustki, wątroby, nerek, pęcherza moczowego, jelita grubego oraz szyjki macicy. W populacji osób dorosłych palenie tytoniu wywiera skrajnie przeciwne efekty na dynamikę nieswoistych chorób zapalnych jelit. U dorosłych obserwuje się pozytywny wpływ palenia tytoniu na przebieg wrzodziejącego zapalenia jelita grubego, które zdaje się być chorobą osób niepalących oraz byłych palaczy. Odwrotną zależność wykazano w chorobie Leśniowskiego-Crohna. W tej postaci ryzyko wystąpienia choroby jest wyższe u palaczy w porównaniu z osobami niepalącymi, a ponadto wiąże się z cięższym przebiegiem klinicznym choroby Leśniowskiego-Crohna [5, 6]. Pierwsze obserwacje związku palenia tytoniu z nieswoistymi zapaleniami jelit miały miejsce 25 lat temu i zostały opublikowane przez Harries i wsp. w 1982 r. [8]. Autorzy odnotowali, że grupę pacjentów z wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego w większości stanowiły osoby niepalące. Wśród 230 chorych z wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego odsetek osób palących wynosił tylko 8%, przy czym grupa ta była jedynie grupą kontrolną w badaniach dotyczących leczenia żywieniowego w chorobie Leśniowskiego-Crohna. Doniesienia te zapoczątkowały badania dotyczące odmiennego mechanizmu patogenetycznego obu postaci choroby oraz dyskusję nad wykorzystaniem nikotyny jako alternatywnej metody terapeutycznej. Istnieje niewiele prac w piśmiennictwie na temat wpływu ekspozycji na dym tytoniowy na przebieg kliniczny nieswoistych zapaleń jelit, w tym choroby Leśniowskiego-Crohna u dzieci i młodzieży [7].

Cel pracy
Celem pracy była ocena wybranych czynników przebiegu klinicznego choroby Leśniowskiego-Crohna u dzieci i młodzieży w aspekcie ekspozycji na dym tytoniowy.
Materiał i metody
Do badania zakwalifikowano 48 pacjentów z rozpoznaną chorobą Leśniowskiego-Crohna w wieku 4–18 lat, hospitalizowanych w Katedrze i Klinice Pediatrii, Alergologii i Gastroenterologii Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy – 35 (72,9%) osób, oraz w Katedrze i Klinice Pediatrii, Gastroenterologii i Onkologii Dziecięcej Akademii Medycznej w Gdańsku – 13 (27,1%) chorych. Ostateczne rozpoznanie choroby Leśniowskiego-Crohna zostało ustalone na podstawie wyników badań endoskopowych górnego i dolnego odcinka przewodu pokarmowego oraz wyników badań histopatologicznych. Aktywność choroby oceniano wg indeksu aktywności choroby PCDAI (ang. pediatric Crohn disease activity index) wg Hyamsa w modyfikacji Ryżki i Woynarowskiego. Aktywność schorzenia oceniano wg przyjętej punktacji dla poszczególnych objawów i klasyfikowano wg przyjętych przedziałów punktowych. Po obliczeniu wskaźnika aktywności choroby wszystkich badanych zakwalifikowano do podgrup – a, β lub c. Na podstawie wyniku uzyskanego w skali PCDAI pacjentów z niską aktywnością lub łagodną postacią (odpowiednio 0–10 pkt i 11–25 pkt) kwalifikowano do podgrupy a, z umiarkowaną (26–50 pkt) do podgrupy b, a z ciężką postacią do podgrupy c (>51 pkt). W celu określenia zależności między ekspozycją na dym tytoniowy a przebiegiem klinicznym choroby Leśniowskiego-Crohna w badanej grupie dzieci i młodzieży dokonano oznaczenia obecności i pomiaru stężenia kotyniny w moczu jako obiektywnego markera ekspozycji. Jednym z warunków włączenia pacjentów do badania i pobrania moczu w celu oznaczenia obecności i stężenia kotyniny była deklaracja, że w ciągu co najmniej 7 ostatnich dni nie nastąpiła zmiana stylu życia, szczególnie w zakresie narażenia na dym tytoniowy. Ze względu na obecność kotyniny w moczu wszystkie osoby zakwalifikowane do badania podzielono na następujące grupy: • I – chorzy na chorobę Leśniowskiego-Crohna z dodatnim wynikiem kotyniny w moczu (n=16), • II – osoby leczone z powodu choroby Leśniowskiego-Crohna z ujemnym wynikiem kotyniny w moczu (n=32). W celu oznaczenia obecności i stężenia kotyniny w moczu od wszystkich badanych pobierano próbki moczu w ilości min. 20 ml w dniu przyjęcia do kliniki (najpóźniej w dniu następnym) do standardowego pojemnika z pokrywką o pojemności 100 ml. Materiał biologiczny był zakwaszony 100 µl 25-milimolowego roztworu HCl w metanolu i przechowywany w temperaturze –18°C do czasu dokonania badania. Analiza kotyniny polegała na jej ilościowej ekstrakcji typu ciecz-ciecz z moczu, a następnie oznaczeniu odparowanego eluatu techniką wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detektorem wielodiodowym (HPLC/DAD – high performance liquid chromatography).
Podczas ekstrakcji kotyniny z moczu do pobranego materiału biologicznego dodawano dichlorometan i 1-molowy roztwór NaOH w celu zapewnienia odczynu za- sadowego (pH=11). Ekstrakcję prowadzono w łaźni ultradźwiękowej przez 30 min. Rozpuszczalnik organiczny oddzielano, odparowywano do sucha, a pozostałość rozpuszczano w metanolu. Otrzymane ekstrakty poddawano analizie metodą HPLC/DAD. Analizę jakościową i ilościową kotyniny przeprowadzono metodą HPLC/DAD w następujących warunkach: chromatograf cieczowy firmy Agilent Technologies (Waldbronn, Niemcy) składający się z pompy binarnej i autosamplera (objętość nastrzyku 20 µl). Rozdział chromatograficzny przeprowadzono na kolumnie Zorbax Eclipse XDB C8 (150 × 4,6 mm; 5 µm) w temperaturze 25°C. Jako fazę ruchomą zastosowano mieszaninę metanol/bufor amonowy pH=3,5 (15:85 v/v) z przepływem 0,8 ml/min. Detekcję przeprowadzono przy długości fali l=260 nm. Wzorcowy wzór kotyniny (Promochem, Polska) o stężeniu 1 mg/ml służył do kalibracji urządzenia. Pozostałe odczynniki użyto w procesie ekstrakcji i analizie chromatograficznej (Sigma Aldrich). Jednorazowa próbka moczu od każdego badanego była poddawana 3-krotnemu oznaczeniu kotyniny, a ostateczny wynik stanowił średnią arytmetyczną tych oznaczeń. Stężenia kotyniny podawano w wartościach bezwzględnych w ng/ml. Oznaczenia jej stężenia dokonywano w Katedrze i Zakładzie Medycyny Sądowej Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu. Uzyskane wyniki badań poddano analizie statystycznej. Dane o charakterze jakościowym, w tym dane ankietowe, analizowano testem c2 oraz c2 z poprawką Yatesa w przypadku, gdy liczba w podgrupie w rozkładzie oczekiwanym w grupach była niższa niż 5. Istotność różnic między przeciętnymi stężeniami kotyniny w moczu pacjentów w zależności od wybranych czynników analizowano testami nieparametrycznymi ze względu na niespełnione założenia analizy wariancji. Zgodność rozkładu kotyniny w badanej próbie z rozkładem normalnym analizowano testem Kołmogorowa-Smirnowa z poprawką Lillieforsa oraz testem Shapiro-Wilka. Homogeniczność wariancji w grupach analizowano testem Levene’a. W celu oszacowania istotności różnic między przeciętnymi w analizowanych podgrupach wykorzystano test U Manna-Whitneya (porównanie 2 grup) oraz test Kruskala-Wallisa (ponad 2 grupy). Oszacowania istotności różnic przeprowadzono na podstawie testów post hoc na poziomie istotności p Ł0,05 i p Ł0,01. Na prowadzenie badań uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej Collegium Medicum w Bydgoszczy.

Wyniki
Analizie poddano częstość występowania i stężenie kotyniny w moczu badanych pacjentów. Kotyninę w moczu (grupa I) stwierdzono u 16 osób, co stanowi 33,33% badanych. Grupę II (brak kotyniny w moczu) stanowiło 32 (66,67%) chorych. Średnie stężenie kotyniny u pacjentów w grupie I wynosiło 127,8 ng/ml. Analizie poddano aktualny stopień aktywności choroby w zależności od obecności kotyniny w moczu. Nie wykazano statystycznie istotnych różnic w stopniu aktywności choroby u osób z kotyniną w moczu i bez jej obecności. Dokładne dane tej analizy przedstawiono w tab. I. Analizie poddano wiek chorych w momencie wystąpienia pierwszych objawów choroby w zależności od obecności kotyniny w moczu. Badane grupy nie różniły się istotnie statystycznie pod względem wieku wystąpienia pierwszych symptomów nieswoistych zapaleń jelit (p=0,1206). Dane tego badania przedstawiono w tab. II. Badano ponadto czas, jaki upływa od momentu wystąpienia pierwszych objawów do rozpoznania. Na podstawie przeprowadzonej analizy wykazano, że w grupie chorych na chorobę Leśniowskiego-Crohna czas od momentu wystąpienia pierwszych objawów do rozpoznania był istotnie statystycznie dłuższy w grupie pacjentów, u których stwierdzono kotyninę w moczu niż w grupie osób, u których nie wykryto tego związku. Dane tej analizy przedstawiono w tab. III. Wskazuje to na istotny wpływ dymu tytoniowego na czas, jaki upływa od momentu pierwszych objawów do rozpoznania choroby Leśniowskiego-Crohna. Badaniu poddano wiek chorych w momencie rozpoznania w badanych grupach. Na podstawie analizy stwierdzono, że średnia wieku w momencie rozpoznania w grupie chorych na chorobę Leśniowskiego-Crohna i z kotyniną w moczu (grupa I) była statystycznie istotnie wyższa niż u leczonych na chorobę Leśniowskiego-Crohna, u których nie wykryto kotyniny w moczu (grupa II). Dane tej analizy przedstawiono w tab. II. Analizie poddano średnią liczbę zaostrzeń, hospitalizacji z powodu zaostrzenia w ciągu roku oraz częstość stosowania steroidoterapii w poszczególnych grupach badanych w zależności od obecności kotyniny w moczu. W przeprowadzonym badaniu nie stwierdzono statystycznie istotnej różnicy w częstości zaostrzeń choroby i liczbie hospitalizacji z powodu zaostrzenia w ciągu roku w obu grupach. Nie wykazano statystycznie istotnej różnicy w częstości stosowania steroidoterapii w ciągu roku w badanych grupach. Dane z tego badania przedstawiono w tab. IV. Nie odnotowano również statystycznie istotnej zależności konieczności stosowania immunosupresji w dotychczasowym przebiegu choroby u pacjentów narażonych i nienarażonych na dym tytoniowy w chorobie Leśniowskiego-Crohna. Dokładne dane tej analizy przedstawiono w tab. V.

Omówienie
Od ponad 25 lat zauważa się skrajnie przeciwne efekty palenia tytoniu na przebieg nieswoistych zapaleń jelit u osób dorosłych. Ekspozycja na dym tytoniowy przynosi pewne korzyści u dorosłych z wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego, natomiast w chorobie Leśniowskiego-Crohna jest czynnikiem wpływającym na pogorszenie przebiegu choroby. W 1982 r. pierwsze takie obserwacje opublikowali Harries i wsp. [8], twierdząc, że wrzodziejące zapalenie jelita grubego jest chorobą osób niepalących. Następnie Somerville i wsp. [9] zaobserwowali, że chorzy na chorobę Leśniowskiego-Crohna częściej są aktywnymi palaczami. Bridger i wsp. [10] badając grupę jednojajowych bliźniąt, stwierdzili, że choroba Leśniowskiego-Crohna częściej rozwija się u osób palących, natomiast na wrzodziejące zapalenie jelita grubego częściej zapadały osoby niepalące. W prospektywnych badaniach przeprowadzonych przez Duffy i wsp. [11] w grupie dorosłych z rozpoznaną chorobą Leśniowskiego-Crohna obserwowano większą aktywność choroby u czynnych palaczy w porównaniu z dorosłymi osobami niepalącymi. Większość publikacji oceniających wpływ ekspozycji na dym tytoniowy na przebieg nieswoistych zapaleń jelit dotyczy populacji osób czynnie palących. W piśmiennictwie niewiele jest doniesień dotyczących wpływu biernego palenia na przebieg tych schorzeń. Eliakim i wsp. [12] prowadząc badania dorosłych osób pochodzenia żydowskiego, narażonych na bierne palenie, nie wykazali jego wpływu na dynamikę nieswoistych zapaleń jelit. Z kolei na podstawie badań przeprowadzonych przez Persson i wsp. [13] stwierdzono zwiększenie ryzyka rozwoju choroby Leśniowskiego-Crohna u dorosłych pacjentów, eksponowanych na dym tytoniowy w okresie dzieciństwa.
W dostępnym piśmiennictwie znaleziono jedno doniesienie polskich autorów na temat wpływu ekspozycji na dym tytoniowy na przebieg nieswoistego zapalenia jelit u pacjentów pediatrycznych. Grzybowska i wsp. [7] badając obecność kotyniny w moczu, ocenili wpływ narażenia na dym tytoniowy na częstość nawrotów obu postaci nieswoistego zapalenia jelit u 21 pacjentów z wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego oraz u 5 chorych na chorobę Leśniowskiego-Crohna. W badaniach własnych nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic w stopniu aktywności choroby w zależności od ekspozycji na dym tytoniowy w chorobie Leśniowskiego-Crohna. Podobne obserwacje dotyczące biernego palenia poczynili Eliakim i wsp. [12], jednak dotyczyły one osób dorosłych. W badaniach własnych nie wykazano wpływu ekspozycji na dym tytoniowy na moment ujawnienia się choroby Leśniowskiego-Crohna, czyli na wiek wystąpienia pierwszych objawów. Stwierdzono natomiast istotny statystycznie dłuższy czas upływający od momentu wystąpienia pierwszych objawów do rozpoznania w grupie pacjentów z chorobą Leśniowskiego-Crohna narażonych na działanie dymu tytoniowego w porównaniu z osobami nienarażonymi. Odnotowano również istotny statystycznie starszy wiek w momencie rozpoznania w grupie narażonych chorych na chorobę Leśniowskiego-Crohna niż pacjentów nieeksponowanych na działanie dymu tytoniowego. U chorych na chorobę Leśniowskiego-Crohna ekspozycja na dym tytoniowy miała statystycznie istotny wpływ na opóźnienie momentu rozpoznania. W dostępnym piśmiennictwie nie znaleziono podobnych spostrzeżeń. W badaniach własnych nie wykazano wpływu narażenia na dym tytoniowy na częstość występowania zaostrzeń choroby oraz hospitalizacji z powodu zaostrzenia w chorobie Leśniowskiego-Crohna. Inne obserwacje poczynili Grzybowska i wsp. [7], stwierdzając, że u pacjentów z wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego narażonych na działanie dymu tytoniowego dochodzi do częstszych nawrotów choroby o średnio ciężkim przebiegu niż u osób nieeksponowanych bądź chorych na chorobę Leśniowskiego-Crohna. Wyniki te są odmienne od obserwacji różnych autorów, dotyczących palących osób dorosłych. Russel i wsp. [14] prowadząc badania prospektywne, wykazali, że u pacjentów z chorobą Leśniowskiego-Crohna aktywnie palących częściej występują zaostrzenia choroby oraz że są oni narażeni na częstsze interwencje chirurgiczne. Z kolei Beaugerie i wsp. [15] obserwowali zwiększenie aktywności choroby oraz częstsze hospitalizacje u osób chorych na wrzodziejące zapalenie jelita grubego, które zaprzestały palenia. W badaniach własnych nie stwierdzono również wpływu ekspozycji na dym tytoniowy na częstość stosowania steroidoterapii oraz immunosupresji u badanych osób. W dostępnym piśmiennictwie nie znaleziono doniesień oceniających te parametry w grupie pacjentów pediatrycznych. Wyniki badań własnych sugerują, że ekspozycja na dym tytoniowy może utrudniać i opóźniać moment rozpoznania, a tym samym wdrożenia odpowiedniego leczenia u chorych na chorobę Leśniowskiego-Crohna. Jest to zgodne z obserwacjami innych autorów, iż palenie tytoniu może pogarszać przebieg niektórych chorób autoimmunologicznych [16]. Z uwagi na niejednoznaczne wyniki badań wpływu biernej ekspozycji na nieswoiste choroby zapalne jelit u pacjentów pediatrycznych, wskazane są dalsze badania w tej grupie chorych.


Wnioski
Ekspozycja na dym tytoniowy może utrudniać i opóźniać moment rozpoznania, a tym samym wdrożenie odpowiedniego leczenia u chorych na chorobę Leśniowskiego-Crohna. Nie wykazano statystycznie istotnej różnicy w częstości nawrotów i aktywności choroby Leśniowskiego-Crohna u osób eksponowanych i nieeksponowanych na dym tytoniowy. Narażenie na dym tytoniowy nie wpływa na częstość stosowania steroidoterapii oraz konieczność immunosupresji u dzieci i młodzieży chorych na chorobę Leśniowskiego-Crohna. Praca finansowana w ramach grantu MNiI nr 2 P05E 113 29.

Piśmiennictwo
1. Ryżko J. Obraz kliniczny i farmakoterapia nieswoistych zapaleń jelit u dzieci. Pediatr Współcz 2004; 6: 449-53. 2. Fioschi C. Inflammatory bowel disease: etiology and pathogenesis. Gastroenterology 1998; 115: 182-205. 3. Grzybowska K. Udział układu immunologicznego w patogenezie nieswoistych zapaleń jelit u dzieci. Nowa Pediatr 2003; 32: 81-4. 4. Kamińska B. Nieswoiste zapalenia jelit u dzieci. Etiologia i patogeneza. W: Choroby jelita grubego u dzieci. Korzon M, Kamińska B, Skarszewski A (red.). Wyd. Adam Marszałek, Toruń 2004; 48-54. 5. Rosińska A, Więckowicz M, Cichy W. Wpływ nikotyny i innych składników dymu tytoniowego na przebieg nieswoistych zapaleń jelit u dzieci i dorosłych. Gastroenterol Pol 2006; 13: 131-5. 6. Thomas GA, Rhodes J, Green JT i wsp. Role of smoking in inflammatory bowel disease: implications for therapy. Postgrad Med 2000; 76: 273-9. 7. Grzybowska K, Grzybowski A, Dziuda-Gorzkowska M i wsp. Próba oceny wpływu narażenia na dym tytoniowy dzieci z nieswoistymi zapaleniami jelit. Pediatr Pol 2003; 78: 465-8. 8. Harries AD, Baird A, Rhodes J. Non-smoking: a feature of ulcerative colitis. Br Med J 1982; 284: 706-8. 9. Somerville KW, Logan RF, Edmond M, Langman MJ. Smoking and Crohn’s disease. Br Med J 1984; 289: 954-6. 10. Bridger S, Lee JC, Bjarnason I i wsp. In siblings with similar genetic susceptibility for inflammatory bowel disease, smokers tend to develop Crohn’s disease and non-smokers develop ulcerative colitis. Gut 2002; 51: 21-5. 11. Duffy LC, Zielezny MA, Marshall JR i wsp. Cigarette smoking and risk of clinical relapse in patients with Crohn’s disease. Am J Rev Prev Med 1990; 6: 161-6. 12. Eliakim R, Reif D, Lavy A i wsp. Passive smoking in patients with inflammatory bowel disease: an Izraeli multicentre casecontrol study. Eur J Gastroenterol Hepatol 2000; 12: 975-9. 13. Persson PG, Ahlbom A, Hellers G. Inflammatory bowel disease and tobacco smoke – a case control study. Gut 1990; 31: 1377-81. 14. Russel M, Niemann F, Bergers J i wsp. Cigarette smoking and quality of life in patients with IBD. South Limburg Study Group. Eur J Gastroenterol Hepatol 1996; 8: 1075-81. 15. Beaugerie L, Massot N, Carbonell F i wsp. Impact of cessation of smoking on the course of ulcerative colitis. Am J Gastroenterol 2001; 96: 2113-6. 16. Czarnywojtek A, Zgorzalewicz-Stachowiak M, Florek E i wsp. Stężenie kotyniny – markera nikotynizmu – u pacjentów z nadczynnością tarczycy. Endokrynol Pol 2006; 6: 612-8.