Microsatellite instability in women with endometrial cancer from the Lodz region of Poland

Wstęp
Na całym świecie rejestruje się stały wzrost liczby chorych na raka błony śluzowej jamy macicy, w związku z czym choroba ta staje się poważnym problemem diagnostycznym i terapeutycznym. W genomie komórek rakowych, w tym raka trzonu macicy, wykryto zaburzenia w sekwencjach mikrosatelitarnych. Sekwencje mikrosatelitarne to krótkie, powtarzające się sekwencje nukleotydów, rozsiane w warunkach prawidłowych w całym genomie. Za zmiany te określane mianem niestabilności sekwencji mikrosatelitarnych (ang. microsatellite instability – MSI) jest odpowiedzialny uogólniony defekt mechanizmów odpowiadających za wierność replikacji DNA lub za poreplikacyjną naprawę DNA [1]. Defekty tego typu pojawiają się w wyniku mutacji genów mutatorowych MMR (ang. mismatch repair), biorących udział w naprawie nieprawidłowo sparowanych zasad DNA oraz zasad niesparowanych, powstających wskutek insercji lub delecji. Badania wskazują, że MSI odgrywa ważną rolę w rozwoju różnych nowotworów [2–4], w tym raka endometrium [5–8]. Rak endometrium należy do najczęstszych nowotworów złośliwych rozwijających się w trzonie macicy [9]. Rak błony śluzowej trzonu macicy występuje w 80% w okresie pomenopauzalnym. Tylko 5% zachorowań na ten nowotwór notuje się przed 40. rokiem życia. Zajmuje on czwarte miejsce wśród zachorowań na raka u kobiet [10]. Rocznie odnotowuje się na całym świecie ok. 150 tys. nowych zachorowań na raka endometrium. Niestabilność mikrosatelitarna (MSI) po raz pierwszy została wykryta u rodzin z zespołem HNPCC (ang. hereditary nonpyloposis colorectal cancer) [11, 12]. Za jej powstawanie odpowiedzialny jest defekt w genach naprawczych. W 90% przypadków HNPCC mutacje germinalne mają miejsce w genach MSH2 i MLH1 [13]. Jednym z częściej występujących nowotworów w koincydencji z rakiem jelita grubego jest rak endometrium. W genomie jego komórek dochodzi często do MSI pod wpływem uszkodzeń w genach mutatorowych [14, 15]. Poza tym wiadomo, że niestabilność mikrosatelitarną spotyka się w 9–45% sporadycznych przypadków raka trzonu macicy [16, 17]. W prezentowanej pracy przeprowadzono analizę genetyczną niestabilności mikrosatelitarnych u chorych na raka endometrium. W celu analizy MSI zastosowano panel 5 markerów (wg kryterium Bethesda) [18]; 2 jednonukleotydowe powtórzenia (BAT25 i BAT26) oraz 3 dwunukleotydowe powtórzenia (D2S123, D5S346 i D17S250).
Materiał i metody
Pacjentki z rakiem endometrium
Materiał do badań w postaci próbek krwi pobranej na cytrynian oraz wycinków z guza endometrium został uzyskany od 100 pacjentek z rakiem endometrium w wieku pomenopauzalnym. Pacjentki mieściły się w przedziale wiekowym 55–82 lat (średnia wieku ±SD, 68,8±6,68 roku). Wszystkie nowotwory sklasyfikowano wg kryteriów ustalonych przez FIGO (ang. International Federation of Gynaecology and Obstetrics).
Grupa kontrolna
Jako kontrolę zastosowano krew uzyskaną od kobiet (n=100), u których nie stwierdzono choroby nowotworowej.
Izolacja DNA
DNA był izolowany z zastosowaniem komercyjnie dostępnego zestawu QIAmp Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Niemcy) zgodnie z zaleceniami producenta.
Analiza niestabilności mikrosatelitarnych
Próbki genomowego DNA uzyskane od kobiet z rakiem endometrium i kontrolnego DNA zostały poddane analizie z zastosowaniem panelu 5 markerów mikrosatelitarnych dla jednonukleotydowych i dwunukleotydowych sekwencji powtórzonych: BAT 25 (locus 4q12), BAT 26 (2p16), D2S123 (2p16-p21), D5S346 (5q21-q22) and D17S250 (17q11.2-q12) [18]. Wszystkie sekwencje starterów uzyskano z komputerowej bazy danych Genome DataBase (GDB, at: http://www.gdb.org). Warunki reakcji polimerazy łańcuchowej (PCR) podano w tab. I. Reakcja PCR została przeprowadzona w termocyklerze Perkin-Elmer/Gene Amp, PCR System 2400. Mieszanina reakcyjna (25 µl) obejmowała 5 ng genomowego DNA, 0,2 µmol każdego startera (ARK Scientific GmbH Biosystems, Darmstad, Niemcy), 2,5 mM MgCl2, 1 mM dNTP i 1 U Taq Polymerase (Qiagen GmbH, Hilden, Niemcy). Produkt PCR podlegał elektroforezie denaturującej w 8-procentowym żelu poliakryloamidowym i był wizualizowany przez barwienie srebrem. Pacjentki, których próbki DNA wykazywały allele nieobecne w kontrolnym DNA, były klasyfikowane jako MSI pozytywne.
Analiza statystyczna
W celu analizy statystycznej zastosowano test c2, p<0,05 traktowano jako wynik statystycznie znaczący.
Wyniki
Próbka była klasyfikowana jako przypadek o wysokim stopniu niestabilności mikrosatelitarnej (ang. MSI-high – MSI-H), jeśli dwa lub więcej markerów wykazywało niestabilność, natomiast o niskim stopniu niestabilności mikrosatelitarnej (ang. MSI-low – MSI-L), jeśli jeden marker wykazywał niestabilność w porównaniu z kontrolnym DNA. Próbki, w których nie stwierdzono niestabilności mikrosatelitarnej, definiowano jako MSI stabilne (ang. MS-stable – MSS). Przebadano 100 pacjentek z rakiem endometrium oraz 100 kobiet z grupy kontrolnej. Nie stwierdzono różnic w niestabilności mikrosatelitarnej pomiędzy próbkami DNA uzyskanymi z guza a próbkami DNA otrzymanymi z krwi, pochodzącymi od tej samej pacjentki. Czterdzieści ze 100 pacjentek (40%) wykazywało niestabilność mikrosatelitarną przy zastosowaniu pełnego panelu 5 markerów; 30 pacjentek zostało zaklasyfikowanych jako przypadki o wysokim stopniu niestabilności mikrosatelitarnej, a 10 jako przypadki o niskim stopniu niestabilności (tab. II). Wykazano, że obecność MSI u chorych na raka endometrium jest wyższa niż w grupie kontrolnej (p<0,05).
Dyskusja
Proces rozwoju raka endometrium ciągle nie jest do końca poznany. Wiadomo, że powstawanie nowotworu jest wynikiem akumulacji wielu zmian genetycznych [19]. W procesie nowotworzenia biorą udział trzy główne grupy genów. W warunkach prawidłowych podlegają one kontrolowanej ekspresji podczas embriogenezy, różnicowania i proliferacji komórek, natomiast ich mutacje prowadzą do zaburzenia tych procesów i w konsekwencji do transformacji nowotworowej. Są to: • onkogeny powstające z protoonkogenów w wyniku mutacji o charakterze dominującym, co oznacza, że produkt zmutowanego allelu wykazuje wyższą aktywność niż produkt allelu niezmutowanego z tej samej pary genów, • geny supresorowe, których mutacje recesywne, a więc ujawniające się tylko wówczas, gdy zachodzą w obydwu kopiach genu, są odpowiedzialne za fenotyp nowotworowy, • geny mutatorowe, których mutacje są odpowiedzialne za częstotliwość pojawiania się mutacji w genomie (geny kodujące enzymy kontrolujące wierność replikacji i naprawy DNA). Defekty w funkcjonowaniu genów mutatorowych prowadzą do powstawania niestabilności mikrosatelitarnych. Dane literaturowe wskazują, że MSI może odgrywać ważną rolę w patogenezie i progresji raka endometrium [20–24]. Badania wskazują, że MSI może być markerem tendencji do powstawania błędów replikacyjnych w nowotworach [8, 22, 25]. Defekty w genach naprawczych, takich jak MLH1, MSH2 i MSH6 powodują błędy replikacyjne, ujawniające się jako niestabilność markerów mikrosatelitarnych. Wykazano, że utrata ekspresji genu MLH1 jest częstym zjawiskiem w raku endometrium [26–28]. W nowotworach endometrium z wysokim stopniem niestabilności mikrosatelitarnej stwierdzono utratę ekspresji genu MLH1, podczas gdy utrata ekspresji tego genu była mniej częstsza w przypadkach niskiego indeksu MSI. Ponieważ patologiczna ekspresja genu MLH1 nie występuje we wszystkich nowotworach z pozytywnym indeksem MSI, sugeruje to, że w tym procesie mogą uczestniczyć inne geny naprawcze [28]. W prezentowanej pracy wykazano związek pomiędzy występowaniem raka endometrium a obecnością MSI – 40% chorych wykazywało MSI w przeciwieństwie do 12% osób z grupy kontrolnej. Badania genetyczne wskazują, że w raku endometrium są wykrywane zmiany genetyczne, takie jak mutacje p53, utrata heterozygotyczności LOH czy zaburzenia amplifikacji genów K-ras, PTEN oraz Her2/neu [29]. Badania autorów niniejszej pracy potwierdziły fakt, że z tym nowotworem związana jest niestabilność mikrosatelitarna. Wysoka częstość występowania MSI u kobiet z rakiem endometrium dostarcza motywu do jej zastosowania jako markera wykrywania grupy wysokiego ryzyka wystąpienia tego nowotworu. Do potwierdzenia tego przypuszczenia konieczne są kolejne badania, które obejmą większą grupę. Praca powstała w oparciu o grant nr 6P05E12220 uzyskany z Komitetu Badań Naukowych (KBN).
Piśmiennictwo
1. Lothe RA. Microsatellite instability in human solid tumours. Mol Med Today 1997; 3: 61-8. 2. Benachenhou N, Guiral S, Gorska-Flipot I, et al. Frequent loss of heterozygosity at the DNA mismatch-repair loci hMLH1 and hMSH3 in sporadic breast cancer. Br J Cancer 1999; 79: 1012-7. 3. Thibodeau SN, Bren G, Schaid D. Microsatellite instability in cancer of the proximal colon. Science 1993; 260: 816-9. 4. Pinto M, Oliveira C, Machado JC, et al. MSI-L gastric carcinomas share the hMLH1 methylation status of MSI-H carcinomas but not their clinicopathological profile. Lab Invest 2000; 80: 1915-23. 5. Chadwick RB, Pyatt RE, Niemann TH, et al. Hereditary and somatic DNA mismatch repair gene mutations in sporadic endometrial carcinoma. J Med Genet 2001; 38: 461-6. 6. Furlan D, Casati B, Cerutti R, et al. Genetic progression in sporadic endometrial and gastrointestinal cancers with high microsatellite instability. J Pathol 2002; 197: 603-9. 7. Muresu R, Sini MC, Cossu A, et al. Chromosomal abnormalities and microsatellite instability in sporadic endometrial cancer. Eur J Cancer 2002; 38: 1802-9. 8. Stefansson I, Akslen LA, MacDonald N, et al. Loss of hMSH2 and hMSH6 expression is frequent in sporadic endometrial carcinomas with microsatellite instability: a population-based study. Clin Cancer Res 2002; 8: 138-43. 9. Rose PG. Endometrial carcinoma. N Engl J Med 1996; 335: 610-9. 10. Brémond A, Bataillard A, Thomas L, et al. Cancer of the endometrium. French National Federation of Cancer (FNCLCC). Br J Cancer 2001; 84: 31-6. 11. Ionov Y, Peinado MA, Malkhosyan S, et al. Ubiquitous somatic mutations in simple repeated sequences reveal a new mechanism for colonic carcinogenesis. Nature 1993; 363: 558-61. 12. Peltomäki P, Lothe RA, Aaltonen LA, et al. Microsatellite instability is associated with tumours that characterize the hereditary non-polyposis colorectal carcinoma syndrome. Cancer Res 1993; 53: 5853-5. 13. Peltomäki P, Vasen HF. Mutations predisposing to hereditary nonpyloposis colorectal cancer: database and results of a collaborative study. The International Collaborative Group on Hereditary Nonpyloposis Colorectal Cancer. Gastroenterology 1997; 113: 1146-58. 14. Muresu R, Sini MC, Cossu A, et al. Chromosomal abnormalities and microsatellite instability in sporadic endometrial cancer. Eur J Cancer 2002; 38: 1802-9. 15. Ørbo A, Eklo K, Kopp M. A semiautomated test for microsatellite instability and its significance for the prognosis of sporadic endometrial cancer in northern Norway. Int J Gynecol Pathol 2002; 21: 27-33. 16. Caduff RF, Johnston CM, Svoboda-Newman M. Clinical and pathological significance of microsatellite instability in sporadic endometrial carcinoma. Am J Pathol 1996; 148: 1671-8. 17. Gurin CC, Federici MG, Kang L, Boyd J. Causes and consequences of microsatellite instability in endometrial carcinoma. Cancer Res 1999; 59: 462-6. 18. Boland CR, Thibodeau SN, Hamilton SR, et al. National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer. Cancer Res 1998; 58: 5248-57. 19. Mutter GL. Diagnosis of premalignant endometrial disease. J Clin Pathol 2002; 55: 326-31. 20. Arzimanoglou II, Gilbert F, Barber HR. Microsatellite instability in human solid tumors. Cancer 1998; 82: 1808-20. 21. Katabuchi H, van Rees B, Lambers I, et al. Mutations in DNA mismatch repair genes are not responsible for microsatellite instability in most sporadic endometrial carcinomas. Cancer Res 1995; 55: 5556-60. 22. Parc YR, Halling KC, Burgart LJ, et al. Microsatellite instability and hMLH1/ hMSH2 expression in young endometrial carcinoma patients: associations with family history and histopathology. Int J Cancer 2000; 86: 60-6. 23. Liu VW, Yang HJ, Wang Y, et al. High frequency of mitochondrial genome instability in human endometrial carcinomas. Br J Cancer 2003; 89: 697-701. 24. Hardisson D, Moreno-Bueno G, Sanchez L, et al. Tissue microarray immunohistochemical expression analysis of mismatch repair (hMLH1 and hMSH2 genes) in endometrial carcinoma and atypical endometrial hyperplasia: relationship with microsatellite instability. Mod Pathol 2003; 16: 1148-58. 25. Ilyas M, Straub J, Tomlinson IP, et al. Genetic pathways in colorectal and other cancers. Eur J Cancer 1999; 35: 1986-2002. 26. Gurin CC, Federici MG, Kang L, et al. Causes and consequences of microsatellite instability in endometrial carcinoma. Cancer Res 1999; 59: 462-6. 27. Esteller M, Levine R, Baylin SB, et al. MLH1 promoter hypermethylation is associated with the microsatellite instability phenotype in sporadic endometrial carcinomas. Oncogene 1998; 17: 2413-7. 28. Salvesen HB, MacDonald N, Ryan A, et al. Methylation of hMLH1 in a population-based series of endometrial carcinoma. Clin Cancer Res 2000; 6: 3607-13. 29. Lax SF. Molecular genetic pathways in various types of endometrial carcinoma: from a phenotypical to a molecular-based classification. Virchows Arch 2004; 4: 213-23.