Molecular alterations in glioblastoma multiforme: new directions and prospects

WSTĘP
Glejak wielopostaciowy (GM – glioblastoma multiforme) pod względem zaburzeń molekularnych jest nowotworem bardzo złożonym, różniącym się profilem molekularnym i epidemiologicznym. W kancerogenezie GM uczestniczy szereg genów supresorowych, takich jak PTEN, TP53, RB1, CDKN2a, CDKN2B, P14^ARF oraz amplifikacja różnych protoonkogenów EGFR, CDK4, MDM2, PDGFRA. Współczesna klasyfikacja WHO wyróżnia 3 stopnie złośliwości glejaków rozlanych (G2-G4), na podstawie cech histopatologicznych i przewidywanego przeżycia chorych, a glejak wielopostaciowy jest najbardziej złośliwym guzem glejowym, złożonym z nisko zróżnicowanych nowotworowych astrocytów [1]. Ze względu na różny mechanizm genetyczny, profil epidemiologiczny oraz różną odpowiedź na leczenie wyróżnia się, tzw. wtórny GM, który rozwija się wskutek progresji z preegzystentnych glejaków WHO GII i GIII, częściej u ludzi młodych poniżej 45. roku życia oraz tzw. pierwotny GM powstającym de novo, z krótkim wywiadem klinicznym, częściej u osób starszych [2]. Wtórny glioblastoma związany jest z mutacją P53 oraz utratą heterozygotyczności (LOH, loss of heterozygosity) na chromosomie 17p, 10q, 19q. Pierwotny GM jest związany z amplifikacją lub nadekspresją EGFR oraz MDM2, LOH 10p i 10q, delecją P16, mutacją PTEN [3]. Do najczęstszych zaburzeń genetycznych w GM należy utrata heterozygotyczności na chromosomie 10 (80–95 proc.) [4, 5].

Na poziome funkcji genów oba typy glioblastoma łączą podobne zaburzenia: uszkodzenie funkcji bądź to przez mutację P53, bądź przez amplifikację MDM2 lub MDM4 lub inaktywację P14^ARF [6, 7]. Znany jest również mechanizm alternatywnego splicingu MDM2 z akumulacją TP53, bez mutacji tego genu [8]. Podobnie zaburzenia kontroli cyklu komórkowego na drodze zależnej od genu RB1 w obu typach GM zależą od amplifikacji CDK4, CDK6, CCND1 lub CCND3, homozygotycznej delecji lub hipermetylacji CDKN2A i CDKN2B oraz zmian RB1 [6, 9, 10]. Natomiast różnice pomiędzy obu typami, wg najnowszych badań, dotyczą ekspresji w pierwotnych glioblastoma genów uczestniczących w angiogenezie m.in. VEGF, fms-related tyrosine kinase 1 i IGFBP2 [11].

BADANIA Z UŻYCIEM
MIKROMACIERZY DNA
Badania z użyciem mikromacierzy DNA pozwoliły na weryfikację poglądów, dotyczących patogenezy i cech klinicznych w innych nowotworach, takich jak chłoniaki, szczególnie w chłoniaku B z dużych komórek (DLBCL) [12], raku gruczołu piersiowego [13], czerniaku złośliwym [14]. W guzach pochodzenia astrocytarnego, szczególnie w glioblastoma wydają się mieć szczególne znaczenie ze względu na możliwość ingerencji terapeutycznej w mechanizmy progresji w tych nowotworach lub na poziomie ekspresji genów w GM, powstającym de novo.

Badania z użyciem mikrosiatek DNA (microarray analysis) pozwoliły na identyfikację nowych genów, uczestniczących w mechanizmie progresji glejaków o niższym stopniu złośliwości do GM, niektóre z nich szczególnie częściej dotyczyły GM na poziomie transkrypcyjnym (COL4A2, FOXM1, MGP, TOP2A, CENPF, IGFBP2, VEGFA, ADD3, CAMK2G) [15]. Te, jak do tej pory nieliczne, badania wskazują na szczególną rolę zaburzeń ekspresji genu IGFBP2 (insulin-like growth factor binding protein 2) [16, 17]. W liniach komórkowych glioblastoma z nadekspresją IGFBP2, wzrost ekspresji genów odpowiedzialnych za inwazję, m.in. ekspresji metaloproteinazy-2 podścieliska (MMP-2), wskazuje na dużą rolę tego genu w procesie miejscowej inwazji nowotworu [18]. Badania Rickmana i wsp. z użyciem analizy mikrosiatek wykazały niezwykłą złożoność zaburzeń genetycznych w GM obejmujących 167 genów, poprzednio nie wiązanych z GM [19]. Są to grupy genów odpowiedzialnych za naprawę, replikację i zachowanie prawidłowego DNA (np. MCM2, TOP2A, PCNA), geny cyklu komórkowego (CKS2, CDC20, CDK4, CDKN3), regulacji transkrypcji, translacji (FOXG1B, TLSH/CHOP, FOXMBL2), genów receptorów i sygnałów transdukcji m.in. (GPR37, IGFBP2, SDC1), zahamowanie apoptozy (API4-survivin, TXN), geny stresu komórkowego (HSPB1 – heat shock protein), degradację białek (UBCH10, E2-EPF – ubiqiutin carrier protein), podścielisko zewnątrzkomórkowe (TGFB1 – transforming growth factor; HXB – tenascin C), cytoskeleton (MYLK – myosin; TUBB4, TUBG1 – tubulin beta 4, gamma 1, CALD1 – caldesmon, FLNA – actin-binding protein-280), adhezji komórkowej (CD24, VCAM1 – vascular cell adhesion molecule 1), homeostazę (CA2 – carbonic anhydrase II), białka mitochondrialne (TSFM-Ts translation elongation factor), transport jądrowy (KPNA2 – karyopherin α2) oraz gen o nieznanej funkcji MEST (Mesoderm specific transcript [mouse] homolog) [19].
CZYNNIKI ROKOWNICZE
Pomimo intensywnych badań molekularnych i immunohistochemicznych oraz wielu działań terapeutycznych, średnia przeżywalność pacjentów wynosi nadal poniżej roku życia [20]. Istniejące różnice w przeżywalności wśród chorych oraz duża odporność na leczenie w porównaniu z innymi nowotworami, skłaniają do poszukiwania nowych czynników rokowniczych. Do najważniejszych klasycznych czynników rokowniczych należy wiek, płeć, wielkość guza i jego lokalizacja, rozległość zabiegu operacyjnego, ocena stanu ogólnego wg Karnofsky’ego oraz sposoby leczenia po wycięciu lub biopsji guza [20, 21]. Badania korelacji najczęstszych zaburzeń genetycznych z przeżywalnością chorych nie przyniosły oczekiwanych i jednoznacznych rezultatów. Kontrowersje dotyczą znaczenia rokowniczego oraz nadekspresji P53 – część badań wskazuje na powiązanie z krótszym całkowitym przeżyciem [22], inne badania nie wykazały związku [23, 24].

Prognostyczne znaczenie amplifikacji/nadekspresji EGFR jest również kontrowersyjne. EGFR może ulegać amplifikacji (w 46–50 proc.) lub nadekspresji (97,5 proc. przypadków z amplifikacją) i różnym mutacjom, z których najczęstsza dotyczy regionu III EGFRvIII oraz typu dzikiego EGFRwt. Większość badań wskazuje na negatywny wpływ zmian EGFR na całkowite przeżycie, szczególnie u ludzi poniżej 60. roku życia [25], jednakże część badań neguje te opinie [23, 26]. U pacjentów z amplifikacją EGFR nadekspresja EGFRvIII była niekorzystnym, znaczącym czynnikiem rokowniczym dla całkowitego czasu przeżycia. Natomiast przypadki z nadekspresją EGFRvIII i EGFRwt bez amplifikacji tego genu nie wpływały na rokowanie [27]. U młodych pacjentów jedynie nadekspresja EGFR bez mutacji P53 ma niekorzystne znaczenie rokownicze [28]. Najnowsze badania wskazują, iż różnice w polimorfizmie pojedynczych nukleotydów (GA lub GG) w regionie 5’ genu EGF mają wpływ na nawroty choroby i krótsze przeżycie, niezależnie od statusu EGFR [29].

Część badań wskazuje na dużą rolę prognostyczną utraty funkcji supresorowej genu PTEN/MMAC1 w glejakach złośliwych i w glejaku wielopostaciowym. Mutacja tego genu jest związana z progresją nowotworu oraz krótszym przeżyciem pacjentów [30]. Co więcej, zaburzenia któregokolwiek z genów uczestniczących w patogenezie RB1, tzn. (CDKN2A, CDKN2B, RB1, CDK4) niezależnie i w połączeniu z mutacją PTEN wpływają znacząco na skrócenie długości życia [31]. Istnieją jednakże doniesienia o braku różnic w mutacji PTEN, p53, CDKN2A, EGFR i MDM2 u pacjentów z krótkim przeżyciem <6 mies. i z długim przeżyciem powyżej 2 lat [32]. Do niekorzystnych rokowniczo czynników należy wzrost poziomu cząsteczek uczestniczących w aktywacji drogi PI3K/AKT, co koreluje z wyższym stopniem złośliwości glejaków, obniżeniem apoptozy i gorszym rokowaniem [33]. Utrata 6q, 10q oraz dodatkowy chromosom 19q towarzyszą krótkotrwałym przeżyciom, natomiast utrata 19q towarzyszy dłuższym przeżyciom powyżej 3 lat i podobnie jak w skąpodrzewiaku jest markerem dobrej odpowiedzi na chemioterapię [34]. Równie korzystnym czynnikiem rokowniczym w GM z dłuższym przeżyciem jest tzw. alternatywne wydłużenie telomerazy (ALT) [35].

Zaburzenia PTEN pojawiają się późno w kancerogenezie i są uznawane za marker progresji i przerzutów nowotworu. Ekspresja dzikiego (prawidłowego) genu PTEN w komórkach glejowych powoduje zahamowanie cyklu podziału komórki w fazie G1, co wiąże się z redukcją PI-3K i inaktywacją kinaz, szczególnie PKB. Ekspresja PTEN wiąże się ze wzrostem ekspresji genu supresorowego P27/KIP1, obniżeniem ekspresji cykliny A, D1, D3, kinazy cyklinozależnej CDK2, defosforylacji RB oraz Akt. Z drugiej strony antysensowne oligonukleotydy P27 hamują te procesy. Badania te wskazują, iż PTEN indukuje zahamowanie podziału komórki w fazie G1 na drodze zależnej od P27/KIP1, natomiast nie zależy od P53 [36, 37]. Co więcej, niski poziom P27/KIP1 oraz wysoki cykliny E jest związany z gorszym rokowaniem w nowotworach pochodzenia glejowego [38]. Mutacja PTEN wraz z aktywacją EGFR uczestniczy w obniżaniu poziomu ekspresji VEGF i fosforylacji Akt na drodze zależnej od PI-3K [39].
PERSPEKTYWY
NA PRZYSZŁOŚĆ
Charakterystyka zaburzeń genowych i markerów molekularnych, korelująca z przebiegiem klinicznym jest konieczna wobec nowych metod leczniczych, które mogą polepszyć wyniki leczenia. Ostatnie badania z użyciem analizy mikrosiatek DNA pozwoliły na wyodrębnienie kilkuset nowych genów, wykazujących zwiększoną ekspresję w GM (WHO GIV) w porównaniu z astrocytoma pilocyticum (WHO GI) [19]. Ta niezwykła liczba nowo zidentyfikowanych genów stwarza potrzebę wyodrębnienia nowego profilu molekularnego GM, w powiązaniu z obrazem histopatologicznym i przebiegiem klinicznym choroby [40]. Stwarza to nowe szanse diagnostyczne oraz terapeutyczne. W obecnym stanie wiedzy najbardziej obiecującym celem terapii wydaje się być kinaza PI3K, uczestnicząca w regulacji cząsteczki Akt i P27 [41] oraz w komórkach PTEN negatywnych, w indukcji EGFR-delta, EGFR vIII, PDGFR (plateled-derived growth factor receptor) na powierzchni komórki. Ponadto, takim celem mogą być: PTEN, P53, telomeraza, angiogeneza w tym anty-VEGF w korelacji z radioterapią [42], czynniki wpływające na inwazję matrix m.in. integryny [43, 44], immunoterapia z użyciem interleukiny 4 i 13, szczególnie we wznowach [45, 46], adjuwantowa radioimmunoterapia z użyciem przeciwciał przeciwko EGFR (125) I w połączeniu z radioterapią [47] oraz użycie nowego inhibitora kinazy tyrozynowej EGFR (Osi-774), wzmagającego apoptozę na drodze niezależnej od P53 [48].

Podziękowania. Praca została sfinansowana z badań własnych Uniwersytetu Medycznego w Łodzi nr 502-11-127.
PIŚMIENNICTWO
1. Kleihus P, Cavenee WK. Pathology and genetics of tumours of the nervous system. WHO classification of tumours. IARCPress, Lyon 2000.
2. Kleihus P, Ohgaki H. Primary and secondary glioblastoma from concept to the clinical diagnosis. Neuro-Oncology 1999; 1: 44.
3. Lang FF, Miller DC, Koslow M, Newcomb EW. Pathways leading to glioblastoma multiforme: a molecular analysis of genetic alteration in 65 astrocytic tumors. J Neurosurg 1994; 81: 427-36.
4. Fults D, Pedone C. Deletion mapping o f the long arm of chromosome 10 in glioblastoma multiforme. Genes Chromosomes Cancer 1993; 7: 173-7.
5. Louis DN. A molecular genetic model of astrocytoma histopathology. Brain Pathology 1997; 7: 755-64.
6. Cavenee WK, Furnari FB, Nagane M, et al. Diffusely infiltrating astrocytomas. In: Pathology and genetics. Tumours of the nervous system. Edited by P Kleihues and WK Cavenee. Lyon, IARC Press, 2000; 10-21.
7. Ichimura K, Bolin MB, Goike HM, et al. Deregulation of the p14ARF/Mdm2/p53 pathway is a prerequisite for human astrocytic gliomas with G1-s transition control gene abnormalities. Cancer Res 2000; 60: 417-424.
8. Kraus A, Neff F, Behn M, et al. Expression of alternatively spliced mdm2 transcripts correlates with stabilized wild-type p53 protein in human glioblastoma cells. Int J Cancer 1999, 80, 930-934.
9. Büschges R, Weber RG, Actor B, et al. Amplification and expression of cyclin D genes [CCND1, CCND2 and CCND3] in human malignant gliomas. Brain Pathol 1999; 9: 435-43.
10. Biernat W, Tohma Y, Yonekawa Y, et al. Alterations of cell cycle regulatory genes in primary (de novo) and secondary glioblastomas. Acta Neuropathol 1997; 94: 303-9.
11. Godard S, Getz G, Delorenzi M, et al. Classification of human astrocytic gliomas on the basis of gene expression: a correlated group of genes with angiogenic activity emerges as a strong predictor of subtypes. Cancer Res 2003; 63: 6613-25.
12. Alizadeh AA, Eisen MB, Davis RE, et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling [see comments]. Nature 2000; 403: 503-11.
13. Perou CM, Sorlie T, Eisen MB et a. Molecular portraits of human breast tumors. Nature [Lond], 2000, 747-752.
14. Bittner M, Melzer P, Chen Y, et al. Molecular classification of cutaneous malignant melanoma by gene expression profiling. Nature 2000; 406: 536-40.
15. Van den Boom J, Wolter M, Kuick R, et al. Characterization of gene expression profiles associated with glioma progression using oligonucleotide-based microarray analysis and real-time reverse transcription-polymerase chain reaction. Am J Pathol 2003; 163: 1033-43.
16. Fueller GN, Rhee CH, Hess KR, et al. Reactivation of insulin-like growth factor binding protein 2 expression in glioblastoma multiforme: a revelation by parallel gene expression profiling. Cancer Res 1999; 59: 4228-32.
17. Sallinen S-L, SallinenP-K, Haapasalo HK, et al. Identification of differentially expressed genes in human gliomas by DNA microarray and tissue chip techniques. Cancer Res 2000; 60: 6617-22.
18. Wang H, Wang H, Shen W, et al. Insulin-like growth factor binding protein 2 enhances glioblastoma invasion by activating invasion-enhancing genes. Cancer Res 2003; 63: 4315-21.
19. Rickman DS, Bobek MP, Misek DE, et al. Distinctive molecular profiles of high-grade and low-grade gliomas based on oligonucleotide microarray analysis. Cancer Res 2001; 61 (18): 6885-91.
20. Jeremic B, Milicic B, Grujicic D, et al. Clinical prognostic factors with malignant glioma treated with combined modality approach. Am J Clin Oncol 2004; 27: 195-204.
21. Batchelor TT, Betensky RA, Esposito JM, et al. Age-dependent prognostic effects of genetic alterations in glioblastoma. Clin Cancer Res 2004; 10: 228-33.
22. Korkolopoulou P, Christodoulou P, Kouzelis K, et al. MDM2 and p53 expression in gliomas; a multivariate survival analysis including proliferation markers and epidermal growth factor receptor. Br J Cancer 1997; 75: 1269-78.
23. Newcomb EW, Cohen H, Lee SR, et al. Survival of patients with glioblastoma multiforme is not influenced by altered expression of p16, p53, EGFR, MDM2 or Bcl-2 genes. Brain Patol 1998; 8: 655-67.
24. Kordek R, Biernat W, Alwasiak J, et al. P53 protein and epidermal growth factor receptor expression in human astrocytomas. J Neurooncol 1995; 26: 11-6.
25. Etienne MC, Formento JL, Lebrun-Frenay C, et al. Epidermal growth factor receptor and labeling index are independent prognostic factors in glial tumor outcome. Clin Cancer Res 1998; 4: 2383-90.
26. Waha A, Baumann A, Wolf HK, et al. Lack of prognostic relevance of alterations in epidermal growth factor receptor-transforming growth factor- apathway in human astrocytic gliomas.
J Neurosurg 1996; 85: 634-41.
27. Shinojima N, Tada K, Shiraishi S, et al. Prognostic value of epidermal growth factor receptor in patients with glioblastoma multiforme. Cancer Res 2003; 63: 6962-70.
28. Simons ML, Lamborn KR, Takahashi M, et al. Analysis of complex relationships between age, p53, epidermal growth factor receptor, and survival in glioblastoma patients. Cancer Res 2001; 61: 1122-8.
29. Bhowmick DA, Zhuang Z, Wait SD, Weil RJ. A functional polymorphism in the EGF gene is found with increased frequency in glioblastoma multiforme patients and is associated with more aggressive disease. Cancer Res 2004; 64: 1220-3.
30. Smith JS, Tashibana I, Passe SM, et al. PTEN mutation, EGFR amplification, and outcome in patients with anaplastic astrocytoma and glioblastoma multiforme. J Natl Cancer Inst 2001; 93: 1246-56.
31. Backlund LM, Nilsson BR, Goike HM, et al. Short postoperative survival for glioblastoma patients with a dysfunctional Rb1 pathway in combination with no wild-type PTEN. Clin Cancer Res. 2003; 9: 4151-8.
32. Kraus JA, Glesmann N, Beck M, et al. Molecular analysis of the PTEN, TP53 and CDKN2A tumor suppressor genes in long-term survivors of glioblastoma multiforme. J Neurooncol 2000; 48: 89-94.
33. Chakravarti A, Zhai G, Suzuki Y, et al. The prognostic significance of phosphatidylinositol 3-kinase pathway activation in human gliomas. J Clin Oncol 2004; 22: 1926-33.
34. Burton EC, Lamborn KR, Feuerstein BG, et al. Genetic aberrations defined by comparative genomic hybridization distinguish long-term from typical survivors of glioblastoma. Cancer Res 2002; 62: 6205-10.
35. Hakin-Smith V, Jellinek DA, Levy D, et al. Alternative lengthening of telomeres and survival in patients with glioblastoma multiforme. Lancet 2003; 361: 836-8.
36. Gottschalk AR, Basila D, Wong M, et al. A p27 kip1 is required for PTEN-
induced G1 growth arrest. Cancer Res 2001; 61: 2105-11.
37. Li D-M, Sun H. PTEN/MMAC1/TEP1 suppresses the tumorigeneicity and induces G1 cell cycle arrest in human glioblastoma cells. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 26: 15406-11.
38. Tamiya T, Mizumatsu S, Ono Y, et al. High cyclinE/low p27Kip1 expression is associated with poor prognosis in astrocytomas. Acta Neuropathol 2001; 101: 334-40.
39. Pore N, Liu S, Haas-Kogan DA, et al. PTEN mutation and epidermal growth factor receptor activation regulate vascular endothelial growth factor (VEGF) mRNA expression in human glioma cells by transactivating the proximal VEGF promoter. Cancer Res 2003; 63: 236-41.
40. Nutt CL, Mani DR, Betensky RA, et al. Gene expression-based classification of malignant gliomas correlates better with survival than histological classification. Cancer Res 2003; 63: 1602-7.
41. Fan X, Aalto Y, Sanko SG, et al. Genetic profile, PTEN mutation and therapeutic role of PTEN i glioblastomas. Int J Oncol 2002; 21: 1141-50.
42. Steiner HH, Karcher S, Mueller MM, et al. Autocrine pathways of the vascular endothelial growth factor (VEGF) in glioblastoma multiforme: clinical relevance of radiation-induced increase of VEGF levels. J Neurooncol 2004; 66: 129-38.
43. Mischel PS, Cloughesy TF. Target molecular therapy of GBM. Brain Pathol 2003; 13: 52-61.
44. Kondo Y, Hollingsworth EF, Kondo S. Molecular targeting for malignant gliomas (Review). Int J Oncol 2004; 24: 1101-9.
45. Husain SR, Puri RK. Interleukin-13 receptor-directed cytotoxin for malignant glioma therapy: from bench to bedside. J Neurooncol 2003; 65: 37-48.
46. Kawakami M, Kawakami K, Puri RK. Interleukin-4-Pseudomonas exotoxin chimeric fusion protein for malignant glioma therapy. J Neurooncol 2003; 65: 15-25.
47. Wygoda Z, Tarnawski R, Brady L, et al. Simultaneous radiotherapy and radioimmunotherapy of malignant gliomas with anti-EGFR antibody labelled with iodine 125. Preliminary results. Nucl Med Rev Cent East Eur 2002; 5: 29-33.
48. Halatsch ME, Gehrke EE, Vougioukas VI, et al. Inverse correlation of epidermal growth factor receptor messenger RNA induction and suppression of anchorage-independent growth by OSI-774, an epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, in glioblastoma multiforme cell lines.
J Neurosurg 2004: 100: 523-33.
ADRES DO KORESPONDENCJI
dr n. med. Dorota Jesionek-Kupnicka
Zakład Patologii Nowotworów
Katedra Onkologii
Uniwersytet Medyczny
ul. Paderewskiego 4
93-509 Łodź
tel. +48 42 689 57 51
faks +48 42 656 28 24
e-mail: kupidor@poczta.onet.pl