Nowości
Phage therapy as an alternative to infections with antibiotic-resistant bacteria

Komisja Europejska, amerykańska Food and Drug Administration i wiele organizacji międzynarodowych (np. Światowa Organizacja Zdrowia) uznało walkę z lekoopornością drobnoustrojów za działanie priorytetowe. Jednak, jak wskazują wyniki analiz, poszukiwanie nowych leków przeciwbakteryjnych przez przemysł farmaceutyczny jest ograniczone, m.in. ze względu na rosnące koszty związane z prowadzeniem stosownych badań naukowych, niski zwrot poniesionych kosztów i wysokie ryzyko związane z możliwością stosunkowo szybkiego wytworzenia się oporności [1]. Pojawiły się już bakterie Gram-dodatnie oporne na linezolid i chinuprystynę/dalfoprystynę – antybiotyki wprowadzone niedawno do leczenia zakażeń wywołanych przez szczepy oporne na wankomycynę [2]. Problemy związane z zakażeniami tymi bakteriami dotyczą również Polski [3]. Niestety, w coraz większym odsetku przyczyną infekcji wieloopornymi bakteriami są nie tylko zakażenia szpitalne, ale i nabyte poza tym środowiskiem [4]. Wśród alternatywnych wobec antybiotyków i chemioterapeutyków sposobów zwalczania infekcji bakteryjnych, w tym zakażeń szczepami wieloopornymi, coraz częściej wymienia się terapię z użyciem bakteriofagów [5–8].
Bakteriofagi jako potencjalny środek w leczeniu zakażeń bakteryjnych
Bakteriofagi (w skrócie fagi) to wirusy bakteryjne bardzo rozpowszechnione w przyrodzie – zasiedlają glebę, oceany, a nawet gorące źródła [9]. Występują również w pokarmie i organizmach ludzi oraz zwierząt (izolowano je np. z ludzkiego kału). Podane doustnie mogą przenikać do krwiobiegu i być wydalane z moczem [10–12]. Bakteriofagi szybko penetrują z krwi do wątroby i śledziony, a także nerek, grasicy i otrzewnej [9]. Dystrybucja fagów do narządów może też się odbywać poprzez naczynia limfatyczne [13]. Wykazano, że mogą pokonywać barierę krew-mózg, nie tracąc zdolności do niszczenia bakterii [14]. Bakteriofagi infekują wyłącznie komórki bakteryjne. W komórce gospodarza możliwe są 2 podstawowe cykle życiowe fagów: lizogenny i lityczny. W cyklu lizogennym materiał genetyczny wirusa zostaje wbudowany do genomu bakterii i wraz z nim ulega replikacji, przez długi czas nie wywierając na komórkę szkodliwego wpływu. Głównym celem cyklu litycznego jest natomiast namnażanie fagów, czego konsekwencją jest śmierć komórki gospodarza [15]. Zdolność efektywnego zabijania bakterii implikuje możliwość zastosowania fagów litycznych w profilaktyce i leczeniu infekcji bakteryjnych. Fundamentalną cechą fagów, jako potencjalnych leków przeciwbakteryjnych, jest silne działanie bakteriobójcze in vitro i in vivo zarówno przeciw bakteriom Gram-dodatnim, jak i Gram-ujemnym. W klasycznych doświadczeniach Smitha i Hugginsa, pojedyncza dawka kolifaga była bardziej skuteczna od powtarzanych dawek 4 różnych antybiotyków w mysim modelu infekcji E. coli [16]. Tak dużą skuteczność fagów tłumaczy się ich unikatową zdolnością replikacji w komórkach bakteryjnych, dzięki której liczba wirionów zwiększa się w miejscu toczącej się infekcji. Ze względu na brak możliwości namnażania w komórkach eukariotycznych, po eradykacji bakterii miano fagów zmniejsza się aż do całkowitego ich usunięcia z ustroju (np. wydalanie z moczem, kałem). Możliwość replikacji nabiera szczególnego znaczenia w wypadku leczenia infekcji rozwijającej się w gorzej ukrwionych tkankach; do eliminacji bakterii wystarczy wówczas dotarcie do zakażonego obszaru nawet małej liczby wirionów. Równocześnie możliwość namnażania w komórkach bakteryjnych znacznie utrudnia charakterystykę BF pod względem farmakokinetycznym [17]. Wielkie znaczenie ma zdolność zabijania przez fagi bakterii antybiotykoopornych, co udowodniono na mysim modelu infekcji wywołanej przez opornego na metycylinę gronkowca złocistego (MRSA) [18], oporne na wankomycynę enterokoki (VRE) [19], wielooporny szczep P. aeruginosa [20] oraz E. coli wytwarzające b-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL) [21]. Również w tych pracach do wyleczenia zakażenia wystarczała zaledwie jedna dawka faga. Warto ponadto odnotować możliwość uzyskania efektu synergistycznego w działaniu przeciwbakteryjnym faga i antybiotyku, co wykazano w modelu infekcji E. coli u kurcząt [22]. Najważniejszym elementem ograniczającym skuteczność działania leków przeciwbakteryjnych jest rozwój oporności. Przyjmuje się, że ryzyko jej powstania jest w wypadku bakteriofagów mniejsze niż dla antybiotyków, dzięki możliwości zachodzenia w genomie faga mutacji, które mogą umożliwiać łatwiejszą adaptację do mutujących komórek bakteryjnych [23]. Poza tym, przynajmniej w niektórych wypadkach, rozwój oporności na bakteriofagi wiąże się ze zmniejszeniem zjadliwości bakterii [16]. Wiele prac przedklinicznych dokumentuje nie tylko wysoką skuteczność fagoterapii, lecz również jej bezpieczeństwo. Praktycznie w żadnym z kontrolowanych badań eksperymentalnych z użyciem oczyszczonych preparatów fagowych nie zaobserwowano u zwierząt doświadczalnych objawów ubocznych. Przykładem są 4 niedawno opublikowane prace na temat leczenia bakteriemii wywołanej S. aureus [18], E. faecium [19], P. aeruginosa [20] i E. coli [21]. W żadnej z nich nie stwierdzono u myszy objawów niepożądanych, które teoretycznie mogły być oczekiwane, np. jako konsekwencja masywnej bakteriolizy. Jednym z głównych problemów znacznie utrudniających zastosowanie terapii fagowej jest wąskie spektrum działania przeciwbakteryjnego bakteriofagów. Najczęściej jest ono ograniczone do części szczepów w obrębie jednego gatunku bakterii [19]. Jest to korzystne, gdyż umożliwia eliminację bakterii patogennych bez naruszenia równowagi naturalnej mikroflory, co może być konsekwencją antybiotykoterapii. Z drugiej jednak strony, wąski zakres działania przeciwbakteryjnego w praktyce powoduje, że konieczna jest ocena in vitro wrażliwości czynnika etiologicznego na bakteriofagi przed podaniem preparatu fagowego pacjentowi. Inne rozwiązanie to zastosowanie koktajlu fagowego, czyli kilku różnych fagów, wspólnie zapewniających szerszy zakres działania przeciwbakteryjnego. Istnieją również metody oparte na wielokrotnym pasażowaniu, które umożliwiają otrzymanie nowych wrażliwych fagów w przypadku utraty przez nie zdolności do lizy specyficznych bakterii [24]. Drugim istotnym problemem znacznie ograniczającym skuteczność fagoterapii jest szybki klirens fagów, uzależniony głównie od niespecyficznego wychwytywania wirionów przez komórki układu siateczkowo-śródbłonkowego wątroby i śledziony. Dobrym rozwiązaniem jest izolacja wariantów bakteriofagów cechujących się wydłużonym okresem półtrwania w surowicy. Są one dość łatwe do uzyskania przy użyciu metody seryjnego pasażu u myszy [11]. Interakcje fagów i komórek bakteryjnych mogą być również zaburzone przez swoiste przeciwciała przeciwfagowe, co może ograniczać efektywność terapii, zwłaszcza po podaniu wielokrotnych dawek fagów. Do tej pory nie zaproponowano skutecznej metody ograniczającej ich immunogenność, sugeruje się jedynie zwiększenie kolejnych dawek lub podanie fagów o podobnym zakresie działania przeciwbakteryjnego, lecz odmiennej specyficzności antygenowej [23]. Trzeba jednak pamiętać, że podawanie doustne może nie pobudzać produkcji przeciwciał, ponieważ taka droga podawania antygenu wiedzie często do tolerancji. Warto ponadto podkreślić, że skuteczność fagoterapii u zwierząt była dotychczas oceniana wyłącznie na modelach ostrych infekcji. Niektórzy eksperci kwestionują możliwość uzyskania równie wysokiej efektywności w leczeniu zakażeń przewlekłych [25].
Fagoterapia w praktyce klinicznej
Zdolność efektywnego zabijania bakterii implikuje możliwość zastosowania fagów litycznych w profilaktyce i leczeniu infekcji bakteryjnych. Pierwsze próby w tej dziedzinie podjęto już na początku lat 20. XX wieku, kilka lat po odkryciu bakteriofagów. Fagi nigdy jednak nie zdobyły silnej pozycji w medycynie zachodniej, a zainteresowanie nimi znacznie zmniejszyło się po wprowadzeniu pierwszych antybiotyków. Od odkrycia bakteriofagów w roku 1917 do połowy lat 40. XX wieku opublikowano setki prac opisujących zastosowanie fagów w leczeniu biegunek i innych infekcji u ludzi [7, 26]. Również w Polsce w latach międzywojennych XX wieku prowadzono próby tego rodzaju leczenia w znanej Klinice Chirurgicznej Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie [27]. W tym czasie na świecie produkowano nawet komercyjnie preparaty fagowe. Jednak z powodu kontrowersyjnych wyników spowodowanych słabą znajomością natury fagów, ich niewłaściwym stosowaniem (np. przeciwko niewrażliwym bakteriom czy chorobom o etiologii innej niż bakteryjna), a także szybkiego rozwoju antybiotykoterapii, w krajach zachodnich zarzucono ten kierunek badań [7]. W II połowie XX wieku BF były stosowane głównie w Europie Środkowej i Wschodniej, gdzie dwoma największymi ośrodkami fagoterapii były (i są nadal) Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu (najważniejsze publikacje instytutu z tego zakresu są dostępne pod adresem internetowym: http://surfer.iitd.pan.wroc.pl/phages/phages.html) i Instytut Eliavy w Tibilisi [26, 28]. Od kilku lat obserwuje się olbrzymi wzrost zainteresowania zastosowaniem fagów w profilaktyce i leczeniu infekcji bakteryjnych. Wiele prywatnych firm w USA, Kanadzie, Wielkiej Brytanii i Izraelu zaczęło prowadzić intensywne badania związane z terapią fagową [5]. Pod koniec 2005 r. Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu otworzył pierwszy w Unii Europejskiej Ośrodek Terapii Fagowej, w którym prowadzone jest eksperymentalne leczenie chorych zakażonych antybiotykoopornymi bakteriami za pomocą bakteriofagów, zgodnie z aktualnymi wymogami terapii eksperymentalnej. Nature Medicine określiło to wydarzenie jako fundamentalny krok naprzód w terapii fagowej [29]. W kolekcji Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu znajduje się ponad 300 fagów, które mogą być stosowane u chorych z zakażeniami wywołanymi przez bakterie z rodzaju Staphylococcus, Enterococcus, Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Shigella, Serratia, Salmonella, Proteus, Pseudomonas i Stenotrophomonas. Preparaty fagowe przygotowywane są wg zmodyfikowanej procedury Ślopka i wsp. indywidualnie dla każdego chorego [30, 31]. Pierwszym etapem jest znalezienie w kolekcji faga, wykazującego aktywność lityczną przeciwko szczepowi bakterii wyhodowanemu od pacjenta – proces ten nazywa się typowaniem fagowym. Materiał mikrobiologiczny do typowania fagowego stanowią z reguły już zidentyfikowane szczepy bakteryjne, wyizolowane od pacjenta, dostarczone do Laboratorium Bakteriofagowego na skosie albo płytce agarowej odpowiedniej dla danego szczepu. Jeśli wynik typowania jest dodatni, w drugim etapie wyselekcjonowany rodzaj bakteriofagów namnaża się na odpowiednim szczepie bakterii pochodzącym z kolekcji Instytutu lub szczepie wyhodowanym od pacjenta. Uzyskuje się w ten sposób tzw. lizat fagowy, w którym oprócz cząstek fagowych w wodzie peptonowej znajdują się produkty przemiany i rozkładu bakterii. Lizat przesącza się przez filtr bakteryjny, oznacza w nim miano fagów, ampułkuje (po 5 ml lub 10 ml) i kontroluje jałowość preparatów, które dalej przechowuje się w temperaturze 2–8°C. W latach 1981–1986, we współpracy Instytutu z klinikami Akademii Medycznej we Wrocławiu i innymi szpitalami, terapię fagową zastosowano u 550 chorych w wieku od 1. tygodnia do 86 lat, z różnymi spontanicznymi lub pooperacyjnymi ropnymi infekcjami wywołanymi przez bakterie z rodzajów Staphylococcus (73,1% przypadków), Klebsiella, Echerichia, Proteus, Pseudomonas [32]. W 32,4% przypadków występowała infekcja mieszana, a 94,2% wszystkich chorych było wcześniej nieskutecznie leczonych antybiotykami. Bakteriofagi stosowano doustnie i miejscowo. Podawano je 3 razy dziennie po 10 ml, 30 min przed jedzeniem, po uprzedniej neutralizacji soku żołądkowego. Leczenie prowadzono od 1 do 12 tyg. (średnio 5 tyg.). W 152 przypadkach fagi podawano równolegle z antybiotykami, natomiast u 398 pacjentów zastosowano same fagi. Odsetek osób, u których infekcja spowodowana była szczepem antybiotykoopornym, wynosił 94,2%. Pozytywne wyniki leczenia (oparte na ocenie skuteczności eliminacji procesu ropnego, gojeniu zmian miejscowych i posiewach) uzyskano u ponad 92,4% chorych. Najsłabsze wyniki obserwowano u pacjentów z zespołem pozakrzepowym (ok. 76% wyleczeń), najlepsze – w zakażeniach przewodu pokarmowego, ostrym ropnym zapaleniu osierdzia, czyraczności (niemal 100% skuteczności). Wysoką, co najmniej 90% skuteczność fagoterapii stwierdzono również w zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych, zapaleniu kości i szpiku, zapaleniach kości po złamaniu, zakażeniach układu moczowego, przewlekłych ropnych przetokach, zapaleniu powiek, spojówek, ucha środkowego, ropniach skóry, ropowicy, trądziku martwiczym i ropniach gruczołu piersiowego. Na podkreślenie zasługuje fakt, że aż w 87 z 98 przypadków posocznicy osiągnięto pozytywny efekt terapeutyczny. Bakteriofagami leczono (doustnie i miejscowo, średnio przez 4 tyg.) również 7 pacjentów po zabiegu na otwartym sercu i dużych naczyniach z ostrym ropnym zapaleniem osierdzia, wywołanym przez Staphylococcus (5 przypadków) albo mieszaną infekcję Staphylococcus i Pseudomonas lub Escherichia (2 przypadki), u których antybiotykoterapia była nieskuteczna. Pozytywny efekt leczenia (całkowite wyleczenie lub eliminacja procesu ropnego i gojenie) obserwowano u 6 osób, a zadowalający u 1 [32, 33]. Od 1987 r. do 1999 r. terapię fagami zastosowano u 1307 pacjentów (w wieku od 4 tyg. do 89 lat) z różnymi zakażeniami bakteryjnymi szczepami wieloopornymi rodzajów Staphylococcus, Klebsiella, Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Enterobacter [34]. Odsetek pozytywnych wyników typowania fagowego bakterii wyizolowanych od kwalifikowanych wtedy do terapii wynosił 95% dla szczepów Staphylococcus, 89% dla Pseudomonas, 81% dla Escherichia i 60% dla Klebsiella. Bakteriofagi podawano przez 1–12 tyg. (średnio 32 dni), wg schematu stosowanego w latach poprzednich. Całkowite wyleczenie (i eliminację bakterii) uzyskano u 85,9% osób, a poprawę, ale bez eradykacji patogenu u 10,4%. U 3,8% chorych terapia była nieskuteczna. Najlepsze wyniki uzyskano u pacjentów z ropnym zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych (100% całkowitych wyleczeń), zapaleniem kości i szpiku (95%), ropnym zapaleniem gruczołu piersiowego (93,1%), przewlekłymi ropnymi przetokami (93%), ropnym zapaleniem stawów i mięśni (89%), ropnym zapaleniem ucha środkowego (88,4%), posocznicą (87,7%). W grupie z ropnymi zakażeniami pooperacyjnymi, odsetek całkowitych wyleczeń wynosił 86% (u pozostałych stwierdzano poprawę, ale nie wyeliminowano bakterii). Terapię fagową prowadzono z bardzo dobrym skutkiem u dzieci. Szczegółowa analiza jej wyników u 114 pacjentów w różnym wieku – od noworodków i niemowląt do 20. roku życia (39 pacjentów poniżej 3. roku życia, 29 pacjentów w wieku 14–20 lat) – wykazała, że u 95,5% z nich leczenie zakończyło się pozytywnym efektem (ocenianym na podstawie skuteczności eliminacji procesu ropnego oraz posiewach) niezależnie od wieku i natężenia stanu schorzenia [33]. Przyczyną zakażeń były szczepy Staphylococcus, Klebsiella, Escherichia, Proteus lub Pseudomonas (monoinfekcje stwierdzono u 68,4% przypadków, a infekcje mieszane u 36,6%). U 64,9% osób stosowano wyłącznie fagoterapię, a u 35,1% fagi równocześnie z antybiotykami. Leczenie było szczególnie skuteczne w przypadku zakażeń przewodu pokarmowego i sepsy (95,2%), nosogardzieli, zatok przynosowych i ropnych zapaleń płuc (92,5%), zapalenia skóry i tkanki podskórnej, czyraczności (92,5%), zapalenia kości i mięśni (100%) oraz ropnych ran pooperacyjnych i urazów (100%). Strój i wsp. na Oddziale Niemowlęcym Zespolonego Szpitala Dziecięcego w Sosnowcu stosowali fagoterapię preparatem zawierającym pojedynczy szczep faga lizujący pałeczki Klebsiella u noworodka urodzonego w 35. tyg. ciąży poprzez cięcie cesarskie (1 punkt w skali Apgar), u którego od pierwszej doby występowały objawy posocznicy z ropnym zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych wywołanej przez oporny na stosowane antybiotyki szczep Klebsiella pneumoniae [35]. Preparat faga podawano przez 5 tyg. doustnie 3 razy dziennie po 5 ml, 30 minut przed karmieniem, po wcześniejszej neutralizacji soku żołądkowego. Uzyskano wyjałowienie płynu mózgowo-rdzeniowego, poprawę stanu ogólnego, przyrost masy ciała i normalizację wyników laboratoryjnych.
Bezpieczeństwo terapii fagowej
Dotychczas nie pojawiły się doniesienia sugerujące, że bakteriofagi mogą być przyczyną jakichkolwiek komplikacji lub schorzeń u ludzi. Wprawdzie mogą one pośredniczyć w przekazywaniu genów oporności na antybiotyki między bakteriami, jednakowoż takich fagów nie stosuje się w terapii. Istnieją pewne obawy, że fagi mogą spowodować szybkie zniszczenie dużej liczby bakterii Gram-ujemnych, co wiąże się z uwolnieniem endotoksyn bakteryjnych i zagrożeniem wystąpienia wielu objawów niepożądanych, włącznie ze wstrząsem kardiogennym, szczególnie u chorych predysponowanych [6]. Zjawisko to obserwowano u zwierząt i ludzi w przypadku niektórych antybiotyków [36]. Dotychczasowe badania przedkliniczne fagów nie potwierdzają jednak tej hipotezy [37]. Wyniki badań Ślopka i wsp. wskazują, że bakteriofagi nawet stosowane w postaci lizaków, rzadko powodują pojawienie się objawów niepożądanych [30]. Tylko u 3 ze 138 pacjentów (109 leczonych preparatami fagowymi doustnie i zewnętrznie, 22 tylko doustnie, a 7 tylko zewnętrznie) stwierdzono objawy niepożądane: u 2 wystąpiła nietolerancja po podaniu doustnym – objawiająca się głównie bólami wątroby między 3. a 5. dniem leczenia (prawdopodobnie spowodowanymi uwolnieniem endotoksyn). W jednym przypadku stosowania zewnętrznego stwierdzono miejscowe objawy uczuleniowe. Na szczególne podkreślenie zasługuje fakt, że na dużym materiale Kliniki Chirurgii Uniwersytetu Jagiellońskiego, nawet przy podawaniu parenteralnym fagów i to u dzieci, włączając niemowlęta, praktycznie nie obserwowano poważnych objawów ubocznych zarówno w obserwacji doraźnej, jak i odległej [27]. Bruttin i Brussow, którzy 15 zdrowym ochotnikom podawali doustnie oczyszczonego faga T4 (fag E. coli) w dawce 103 pfu/ml i 105 pfu/ml, również nie obserwowali częstszego występowania objawów niepożądanych, związanych z przyjmowaniem fagów (w tym wzrostu poziomu transaminaz) w porównaniu z placebo [38]. Nieznane są skutki odległego w czasie oddziaływania fagów na organizm i materiał genetyczny człowieka. Jednak warto podkreślić, że przez ponad 30 lat test powstawania przeciwciał w odpowiedzi na dożylnie podane fagi służy monitorowaniu odpowiedzi immunologicznej u pacjentów z niedoborem odporności (biorcy szpiku, zakażeni HIV, dzieci z niedoborami odporności w renomowanych centrach akademickich w USA) [39–41]. Co więcej, Food and Drug Administration po stwierdzeniu, że mimo oczyszczenia, niektóre szczepionki zawierają bakteriofagi oraz rozważeniu wszystkich za i przeciw, zgodziła się dopuścić do obrotu preparaty zawierające unavoidable bacteriophage [42]. Wydaje się zatem, że terapia fagowa jest w pełni bezpieczna i bardzo dobrze tolerowana, tym bardziej, że fagi te są naturalnym składnikiem naszego środowiska (woda, ziemia, pokarmy, są również obecne w przewodzie pokarmowym i ślinie). W konkluzji należy stwierdzić, że terapia fagowa może być metodą bezpieczną i o wysokiej skuteczności u chorych z zakażeniami lekoopornymi. Wydarzenia ostatnich miesięcy w pełni to potwierdzają, jako że zaczyna się ją również stosować w Wielkiej Brytanii i USA [43, 44].
Praca częściowo finansowana z grantu Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego /PBZ-MIN-007/P04/2003/
Piśmiennictwo
1. Wenzel RP. The antibiotic pipeline-challenges, costs, and values. N Engl J Med 2004; 351: 523-526. 2. Menichetti F. Current and emerging serious Gram-positive infections. Clin Microbiol Infect 2005; 11 (S3): 22-28. 3. Krawczyk B, Samet A, Bronk M, Hellmann A, Kur J. Emerging linezolid-resistant, vancomycin resistant Enterococcus faecium from a patient of a haematological unit in Poland. Pol J Microbiol 2004; 53: 193-196. 4. Hryniewicz W. Antybiotykooporność – narastający problem kliniczny. Terapia 2004; 2: 53-56. 5. Thiel K. Old dogma, new tricks – 21st Century phage therapy. Nat Biotechnol 2004; 22: 31-36. 6. Dixon B. New dawn for phage therapy. Lancet Infect Dis 2004; 4: 186. 7. Bradbury J. My enemy’s enemy is my friend. Using phages to fight bacteria. Lancet 2004; 363: 624-625. 8. Levin BR, Bull JJ. Population and evolutionary dynamics of phage therapy. Nature Rev Microbiol. 2004; 2: 166-173. 9. Dąbrowska K, Świtala-Jeleń K, Weber-Dąbrowska B, Górski A. Bacteriophage penetration in vertebrates. J Appl Microbiol 2005; 98: 7-13. 10. Keller R, Engley FB. Fate of bacteriophage particles introduced into mice by various routes. Proc Soc Exp Biol Med 1958; 98: 577-579. 11. Merril CR, Biswas B, Carlton R, Jensen NC, Creed GJ, Zullo S, Adhya S. Long-circulating bacteriophage as antibacterial agents. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 3188-3192. 12. Weber-Dąbrowska B, Dąbrowski M, Ślopek S. Studies on bacteriophage penetration in patients subjected to phage therapy. Arch Immunol Ther Exp 1987; 35: 563-568. 13. Hildebrand GJ, Wolochow H. Translocation of bacteriophage across the intestinal wall of the rat. Proc Soc Exp Biol Med 1962; 109: 183-185. 14. Carrera MR, Kaufmann GF, Mee JM, Meijler MM., Koob GF, Janda KD. Treating cocaine addiction with viruses. Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101: 10416-10421. 15. Campbell A. The future of bacteriophage biology. Nat Rev Gen 2003; 4: 471-477. 16. Smith HW, Huggins MB. Successful treatment of experimental Escherichia coli infections in mice using phage: its general superiority over antibiotics. J Gen Microbiol 1982; 128: 307-318. 17. Payne RJ, Phil D, Jansen VA. Phage therapy: the peculiar kinetics of self-replicating pharmaceuticals. Clin Pharmacol Ther 2000; 68: 225-30. 18. Matsuzaki S, Yasuda M, Nishikawa H, Kuroda M, Ujihara T, Shuin T, Shen Y, Jin Z, Fujimoto S, Nasimuzzaman MD, Wakiguchi H, Shigeyoshi S, Sugiura T, Koda S, Muraoka A, Imai S. Experimental protection of mice against lethal Staphylococcus aureus infection by novel bacteriophage FMR11. J Inf Dis 2003; 187: 613-624. 19. Biswas B, Adhya S, Washart P, Paul B, Trostel AN, Powell B, Carlton R, Merril CR. Bacteriophage therapy rescues mice bacteremic from a clinical isolate of vancomycin-resistant Enterococcus faecium. Infect Immun 2002; 70: 204-210. 20. Wang J, Hu B, Xu M, Yan Q, Liu S, Zhu X, Sun Z, Reed E, Ding L, Gong J, Li QQ, Hu J. Use of bacteriophage in the treatment of experimental animal bacteremia from imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa. Int J Mol Med 2006; 17: 309-317. 21. Wang J, Hu B, Xu M, Yan Q, Liu S, Zhu X, Sun Z, Tao D, Ding L, Reed E, Gong J, Li QQ, Hu J. Therapeutic effectiveness of bacteriophages in the rescue of mice with extended spectrum beta-lactamase-producing Escherichia coli bacteremia. Int J Mol Med 2006; 17: 347-355. 22. Huff WE, Huff GR, Rath NC, Balog JM, Donoghue AM. Therapeutic efficacy of bacteriophage and Baytril (Enrofloxacin) individually and in combination to treat colibacillosis in broilers. Poultry Sci 2004; 83: 1944-1947. 23. Carlton R. Phage therapy: past history and future prospects. Arch Immunol Ther Exp 1999; 47: 267-274. 24. O’Flaherty S, Ross RP, Meaney W, Fitzgerald GF, Elbreki MF, Coffey A. Potential of the polyvalent anti-Staphylococcus bacteriophage K for control of antibiotic-resistant staphylococci from hospitals. Appl Environ Microbiol 2005; 71: 1836-1842. 25. Levin BR., Bull JJ. Population and evolutionary dynamics of phage therapy. Nat Rev Microbiol 2004; 2: 166-173. 26. Sulakvelidze A, Alavidze Z, Morris JG Jr. Bacteriophage therapy. Antimicrob Agents Chemother 2001; 45: 649-659. 27. Jasieński J. Próby zastosowania bakteriofagii w chirurgii. Polska Gazeta Lekarska 1927; 4: 67-73. 28. Debattista J. Phage therapy: where East meets West. Expert Rev Anti Infect Ther 2004; 2: 815-819. 29. Hausler T. Bug killers. Nature Medicine 2006; 12: 600-601. 30. Ślopek S, Durlakowa I, Weber-Dąbrowska B, Kucharewicz-Krukowska A, Dąbrowski M, Bisikiewicz R. Results of bacteriophage treatment of suppurative bacterial infections. I. General evaluation of the results. Arch Immunol Ther Exp 1983; 31: 267-291. 31. Boratyński, J, Syper D, Weber-Dąbrowska B, Łusiak-Szelachowska M, Poźniak G, Górski A. Preparation of endotoxin-free bacteriophages. Cell Mol Biol Letters 2004; 9: 253-259. 32. Ślopek S, Weber-Dąbrowska B, Dąbrowski M, Kucharewicz-Krukowska A. Results of bacteriophage treatment of suppurative bacterial infections in the years 1981-1986. Arch Immunol Ther Exp 1987; 35: 569-583. 33. Ślopek S, Kucharewicz-Krukowska A, Weber-Dąbrowska B, Dąbrowski M. Results of bacteriophage treatment of suppurative bacterial infections. V. Evaluation of the results obtained in children. Arch Immunol Ther Exp 1985; 33: 241-259. 34. Weber-Dąbrowska B, Mulczyk M, Górski A. Bacteriophage therapy of bacterial infections: an update of our Institute`s experience. Arch Immunol Ther Exp 2000; 48: 547-551. 35. Strój L, Weber-Dąbrowska B, Partyka K, Mulczyk M, Wójcik M. Skuteczne zastosowanie bakteriofagoterapii w ropnym zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych u noworodka. Neurol Neurochir Pol 1999; 33: 693-698. 36. Lepper PM, Held TK, Schneider EM, Bolke E, Gerlach H, Trautmann M. Clinical implications of antibiotic-induced endotoxin release in septic shock. Intensive Care Med 2002; 28: 824-833. 37. Soothill J, Hawkins C, Anggard E, Harper D. Therapeutic use of bacteriophages. Lancet Infect Dis 2004; 4: 544-555. 38. Bruttin A, Brussow H. Human volunteers receiving Escherichia coli phage T4 orally: a safety test of phage therapy. Antimicrob Agents Chemother 2005; 49: 2874287-2874288. 39. Ochs HD, Davis SD, Wedgwood RJ. Immunologic responses to bacteriophage phi-X 174 in immunodeficiency diseases. J Clin Invest 1971; 50: 2559-2568. 40. Price TH, Ochs HD, Gershoni-Baruch R, Harlan JM, Etzioni A. In vivo neutrophil and lymphocyte function studies in a patient with leukocyte adhesion deficiency type II. Blood 1994; 84: 1635-1639. 41. Fogelman I, Davey V, Ochs HD, Elashoff M, Feinberg MB, Mican J, Siegel JP, Sneller M, Lane H.C. Evaluation of CD4+ T cell function In vivo in HIV-infected patients as measured by bacteriophage phiX174 immunization. J Infect Dis 2000; 182: 435-441. 42. Petricciani JC. An overview of viral and viral agents in cell culture systems. Cytotechnology 1998; 28: 49-52. 43. Marza JA, Soothill JS, Boydell P, Collyns TA. Multiplication of therapeutically administered bacteriophages in Pseudomonas aeruginosa infected patients. Burns 2006; 32: 644-646. 44. Wolcott R, Fralick J, Burrowes B. Bacteriophage in the treatment of chronic wounds. Texas Tech Univ Health Sciences, Lubbock, TX, USA. 1st Texas/Evergreen Phage/Virus Genomics and Ecology Meeting, May 12-16 2006, Kingsville, TX. Abstracts, p. 11.