ORIGINAL PAPER
The value of the assessment of interleukin-6 (IL-6), matrix metalloproteinases and their inhibitors in serum in the assessment of rheumatoid arthritis activity

Adres do korespondencji:
dr hab. med. Piotr Adrian Klimiuk, Klinika Reumatologii i Chorób Wewnętrznych, Akademia Medyczna, ul. Skłodowskiej 24a,
15-276 Białystok
Praca wpłynęła: 3.08.2005 r.

Wstęp
Reumatoidalne zapalenie stawów (RS) jest przewlekłym zapalnym schorzeniem układowym tkanki łącznej, w przebiegu którego dochodzi do niszczenia struktur stawowych i okołostawowych. W rezultacie prowadzi ono do ograniczenia możliwości wykonywania przez chorego codziennych czynności życiowych. Istotną rolę w patogenezie RZS wydają się pełnić limfocyty, makrofagi i synowiocyty, które niszczą tkanki stawowe poprzez wiele mechanizmów, w tym przez produkowane przez siebie cytokiny oraz metaloproteinazy (MMPs, matrix metalloproteinases) [1, 2]. Obok kluczowych prozapalnych cytokin, takich jak czynnik martwicy nowotworów α (TNF-α,
tumour necrosis factor α) i interleukina 1β (IL-1β), w patogenezie RZS istotną rolę odgrywa IL-6 [3–6]. Wykazuje ona potencjał do pobudzania produkcji białek ostrej fazy, i to nawet większy niż IL-1β [7]. IL-6 jest ponadto czynnikiem wzrostu dla limfocytów B i stymuluje wydzielanie immunoglobulin. Cytokina ta aktywuje także komórki T i pobudza proliferację fibroblastów [8]. W przebiegu RZS niezmiernie ważne jest zwiększanie przepuszczalności śródbłonka dla limfocytów przez IL-6 [4], co w rezultacie pozwala na ich migrację do błony maziowej stawów. Właściwość ta jest szczególnie istotna w zainicjowaniu i rozwoju reumatoidalnego procesu zapalnego w obrębie stawowej błony maziowej. IL-6 odgrywa również pośrednio rolę w procesie degradacji chrząstki stawowej. Związane jest to z blokowaniem przez nią proliferacji chondrocytów i tworzenia proteoglikanów oraz stymulowaniem rozpadu proteoglikanów wywołanemu przez IL-1β [9]. Ponadto
IL-6 jest odpowiedzialna za wystąpienie gorączki i pobudzanie katabolizmu, prowadzące do kacheksji [4]. Znaczenie IL-6 w patogenezie RZS potwierdzają próby kliniczne terapii, skierowane przeciwko tej cytokinie, których skutkiem jest zmniejszenie aktywności choroby [10]. Należy jednak pamiętać, że IL-6 przejawia również właściwości cytokiny przeciwzapalnej. Wykazano, że IL-6 zmniejsza syntezę TNF-α i IL-1β [4] oraz pobudza wytwarzanie tkankowych inhibitorów metaloproteinaz (TIMPs, tissue inhibitors of metalloproteinases) [11]. TIMPs są, jak wiadomo, inhibitorami metaloproteinaz (MMPs, matrix metalloproteinases) biorących udział w procesach degradacji i przebudowy tkanek stawowych [11, 12]. Celem pracy była analiza korelacji pomiędzy stężeniem IL-6 w surowicy a stężeniem metaloproteinaz, ich tkankowych inhibitorów oraz klinicznymi wskaźnikami aktywności choroby u chorych na reumatoidalne zapalenie stawów.

Grupa badana i metody
Badaniami objęto 32 chorych (25 kobiet i 7 mężczyzn) z reumatoidalnym zapaleniem stawów rozpoznanym na podstawie kryteriów Amerykańskiego Kolegium Reumatologicznego (ACR, American College of Rheumatology) z 1987 r. [13]. Wśród analizowanych pacjentów średnia wieku wynosiła 55,1±12,7 roku, a czas trwania choroby 17,1±6,9 roku. W trakcie 3 ostatnich miesięcy przed badaniem niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ) stosowane były przez wszystkich chorych, a 23 przyjmowało także leki modyfikujące przebieg choroby (17 metotreksat i 6 sulfasalazynę). Aktywność choroby analizowano na podstawie liczby bolesnych i obrzękniętych stawów, wskaźnika stawowego Ritchiego [14], szybkości opadania krwinek czerwonych (OB) oraz stężenia białka C-reaktywnego (CRP, C-reactive protein).
W badaniach wykorzystano krew pobieraną z żyły łokciowej, którą następnie wykrzepiano przez 30 min, po czym wirowano przez 10 min (1000 x g). Surowicę pochodzącą od poszczególnych chorych dzielono na pojedyncze próbki, które mrożono w temperaturze
-80°C. Używając komercyjnych zestawów ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), oznaczano w surowicy stężenia IL-6 (Bender MedSystems, Vienna, Austria) oraz MMP-1, MMP-3, MMP-9, TIMP-1 i TIMP-2 (Biotrak, Amersham Pharmacia Biotech Limited, Little Chalfont Buckinghamshire, England), ściśle stosując się do instrukcji producenta. Stężenia IL-6 wyrażono w pg/ml, natomiast MMPs i TIMPs w ng/ml. Czułość poszczególnych zestawów ELISA była następująca: 1,4 pg/ml (IL-6); 1,7 ng/ml (MMP-1); 2,35 ng/ml (MMP-3); 0,6 ng/ml (MMP-9); 1,25 ng/ml (TIMP-1) i 3,0 ng/ml (TIMP-2).
Analizy statystycznej dokonano na podstawie korelacji Spearmana. Korelację uznawano za znamienną przy p<0,05.

Wyniki
W rezultacie przeprowadzonych analiz stwierdzono dodatnią korelację (r=0,647; p<0,001) pomiędzy stężeniem IL-6 i łącznym stężeniem wszystkich badanych metaloproteinaz (MMP-1, MMP-3 i MMP-9) w surowicy chorych na RZS (ryc. 1.). Znamienną statystycznie zależność (r=0,591; p<0,001) wykazano również pomiędzy stężeniem IL-6 i łącznym stężeniem badanych tkankowych inhibitorów metaloproteinaz (TIMP-1 i TIMP-2) w surowicy badanych pacjentów (ryc. 2.).
W surowicy pacjentów z RZS stężenie IL-6 korelowało ze wskaźnikami aktywności choroby, takimi jak szybkość opadania krwinek czerwonych (OB) (r=0,721; p<0,001), stężenie białka C-reaktywnego (CRP) (r=0,601; p<0,001), liczba bolesnych (r=0,518; p<0,01) i obrzękniętych stawów (r=0,525; p<0,01) czy wskaźnik Ritchiego (r=0,464; p<0,01). Również łączne stężenie badanych metaloproteinaz (MMP-1, MMP-3 i MMP-9) korelowało z OB (r=0,737; p<0,001), CRP (r=0,371; p<0,05), liczbą bolesnych (r=0,533; p<0,01) i obrzękniętych stawów (r=0,590; p<0,001) czy wskaźnikiem Ritchiego (r=0,469; p<0,01). Ponadto łączne stężenie badanych tkankowych inhibitorów metaloproteinaz (TIMP-1 i TIMP-2) korelowało z OB (r=0,506; p<0,01), CRP (r=0,355; p<0,05), liczbą bolesnych (r=0,510; p<0,01) i obrzękniętych stawów (r=0,477; p<0,01) czy wskaźnikiem Ritchiego (r=0,373; p<0,05).

Dyskusja
Biorąc pod uwagę częstość występowania w populacji oraz prowadzący do inwalidztwa przebieg, reumatoidalne zapalenie stawów stanowi niezmiernie ważny problem społeczny. W przebiegu choroby u wielu pacjentów oprócz zmian stawowych rozwijają się także powikłania narządowe, stanowiące zagrożenie dla ich zdrowia i życia. Skłoniło to wielu badaczy do zwrócenia szczególnej uwagi na tę układową chorobę tkanki łącznej. Wykazano, że ważną rolę w destrukcji tkanek stawowych i okołostawowych odgrywają limfocyty, makrofagi i synowiocyty. Przyjmuje się, że biorą one udział w reumatoidalnym procesie zapalnym, m.in. poprzez wytwarzanie prozapalnych cytokin i metaloproteinaz
[1, 2]. Do prozapalnych cytokin biorących udział w patogenezie schorzenia oprócz TNF-α i interleukiny 1β
(IL-1β) należy również IL-6 wytwarzana przez monocyty, komórki śródbłonka, fibroblasty i limfocyty T. Produkcja IL-6 jest stymulowana przez IL-1β i TNF-α [4, 15]. W RZS obecność IL-6 wykazano w błonie maziowej stawów, w płynie stawowym oraz w surowicy krwi. Ekspresja
IL-6 w błonie maziowej stawów, płynie stawowym i krwi u chorych na RZS jest większa w porównaniu z pacjentami z chorobą zwyrodnieniową stawów oraz osobami zdrowymi [3, 4, 6]. Jak wiadomo, IL-6 pełni wiele ważnych funkcji w procesie zapalnym, o których wspomniano we wstępie.
W przebiegu reumatoidalnego procesu zapalnego tkanki stawowe i okołostawowe niszczone są przez metaloproteinazy syntetyzowane przez makrofagi i synowiocyty [1, 2, 11]. Spośród metaloproteinaz wyróżnia się m.in. kolagenazę (MMP-1), stromelizynę 1 (MMP-3) i żelatynazę B (MMP-9). Obecność MMPs stwierdzono nie tylko w maziówce stawowej czy w płynie stawowym, ale także w surowicy krwi pacjentów z RZS [16, 17]. Niszcząca aktywność metaloproteinaz jest regulowana m.in. przez wytwarzanie ich w postaci nieaktywnych proenzymów, jak i przez ich inhibitory, do których należą też tkankowe inhibitory metaloproteinaz. Stwierdzono, że produkcja TIMPs jest pobudzana m.in. przez IL-6 [11].
W poprzedniej pracy wykazaliśmy korelację stężenia IL-6 w surowicy chorych na RZS ze stężeniem kolagenazy, stromelizyny 1 i żelatynazy B. Stwierdziliśmy również korelację IL-6 z tkankowymi inhibitorami metaloproteinaz, zarówno TIMP-1, jak i TIMP-2 [18]. W obecnym opracowaniu postanowiliśmy zwrócić szczególną uwagę i przedstawić korelację IL-6 zarówno z łącznym stężeniem badanych metaloproteinaz (MMP-1, MMP-3 i MMP-9), jak i łącznym stężeniem badanych tkankowych inhibitorów metaloproteinaz (TIMP-1 i TIMP-2). Wykazaliśmy zarówno korelację pomiędzy stężeniem IL-6 a całkowitym stężeniem badanych MMPs, jak i całkowitym stężeniem badanych TIMPs. Wydaje się, że łączne analizowanie stężeń badanych MMPs i TIMPs zaangażowanych w patogenezę choroby jest właściwsze w ocenie aktywności procesu reumatoidalnego.
Ponadto w obecnej pracy stwierdziliśmy korelację nie tylko stężeń IL-6, ale i łącznych stężeń badanych metaloproteinaz (MMP-1, MMP-3, MMP-9) oraz tkankowych inhibitorów metaloproteinaz (TIMP-1 i TIMP-2) w surowicy krwi ze wskaźnikami aktywności choroby, takimi jak szybkość opadania krwinek czerwonych, stężenie białka C-reaktywnego, liczba bolesnych i obrzękniętych stawów oraz wskaźnik stawowy Ritchiego. Także w innych badaniach u chorych na RZS wykazano korelację IL-6 z OB i CRP [3, 6, 19, 20]. Wiadomo również, że stężenie IL-6 koreluje ze stężeniem takich cytokin, jak IL-1β i TNF-α, uważanych za odgrywające kluczową rolę w patogenezie RZS [21]. W opracowaniach innych autorów zaobserwowano również korelację pomiędzy stężeniem w surowicy MMP-3 a OB i liczbą obrzękniętych stawów [22–24] oraz pomiędzy stężeniem TIMP-1 a OB [23]. Wyniki naszych badań w powiązaniu z danymi z piśmiennictwa sugerują, że określanie w surowicy chorych na RZS stężenia IL-6, łącznego stężenia badanych MMPs (MMP-1, MMP-3 i MMP-9) oraz TIMPs (TIMP-1 i TIMP-2) może być pomocne w ocenie aktywności choroby i monitorowaniu leczenia.

Wnioski
1. W surowicy chorych z reumatoidalnym zapaleniem stawów stężenie interleukiny 6 koreluje z łącznym stężeniem badanych metaloproteinaz (MMP-1, MMP-3 i MMP-9) oraz tkankowych inhibitorów metaloproteinaz (TIMP-1 i TIMP-2).
2. Stężenie IL-6, łączne stężenie badanych metaloproteinaz (MMP-1, MMP-3 i MMP-9) oraz tkankowych inhibitorów metaloproteinaz (TIMP-1 i TIMP-2) w surowicy chorych na RZS koreluje ze wskaźnikami aktywności choroby, takimi jak szybkość opadania krwinek czerwonych, stężenie białka C-reaktywnego, liczba bolesnych i obrzękniętych stawów oraz wskaźnik stawowy Ritchiego.
3. Analiza stężenia IL-6, łącznego stężenia badanych metaloproteinaz (MMP-1, MMP-3 i MMP-9) oraz tkankowych inhibitorów metaloproteinaz (TIMP-1 i TIMP-2) w surowicy chorych może być pomocna w ocenie aktywności RZS i monitorowaniu leczenia.

Piśmiennictwo
1. Bresnihan B. Pathogenesis of joint damage in rheumatoid arthritis. J Rheumatol 1999; 26: 717-19.
2. van den Berg WB, van Lent PL. The role of macrophages in chronic arthritis. Immunobiology 1996; 195: 614-23.
3. Bernacka K, Sierakowski S, Lachowicz M i wsp. Próba korelacji stężenia rodników hydroksylowych w ocenie dwualdehydu malonowego ze stężeniem IL-1β, IL-6 i TNFa w surowicy pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów. Reumatologia 1996; 34: 15-20.
4. Klimiuk PA, Sierakowski S. Cytokiny w reumatoidalnym zapaleniu stawów. I. Cytokiny prozapalne. Pol Merk Lek 2001; 11: 510-13.
5. Olszewski WL, Pazdur J, Kubasiewicz E, et al. Lymph draining from foot joints in rheumatoid arthritis provides insight into local cytokine and chemokine production and transport to lymph nodes. Arthritis Rheum 2001; 44: 541-9.
6. Sierakowski S, Bernacka K, Lachowicz M, et al. Concentrations of IL-6 and TNFa in the serum of patients with rheumatoid arthritis in the course of disease. Reumatologia 1996; 34: 184-90.
7. Suffredini AF, Fantuzzi C, Badolato R, et al. New insights into the biology of the acute phase response. J Clin Immunol 1999; 19: 203-14.
8. Dinant HJ, Dijkmans BAC. New therapeutic targets for rheumatoid arthritis. Pharm World Sci 1999; 21: 49-59.
9. Jikko A, Wakisaka T, Iwamoto M, et al. Effects of interleukin-6 on proliferation and proteoglycan metabolism in articular chondrocyte cultures. Cel Biol Int 1998; 22: 615-21.
10. Klimiuk PA, Sierakowski S. Cytokiny i ich antagoniści w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów. Przegl Lek 2002; 59: 108-12.
11. Nagase H, Okada Y. Proteinases and matrix degradation. In: Textbook of rheumatology. Kelley WN, Harris ED, Ruddy S, et al. (eds). W. B. Saunders Company, Philadelphia 1997; 323-41.
12. Firestein GS. Etiology and pathogenesis of rheumatoid arthritis. In: Textbook of rheumatology. Kelley WN, Harris ED, Ruddy S, et al. (eds). W. B. Saunders Company, Philadelphia 1997; 851-97.
13. Arnett FC, Edworthy SM, Bloch DA, et al. The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 1988; 31: 315-24.
14. Ritchie DM, Boyle JA, McInnes JM, et al. Clinical studies with an articular index for the assessment of joint tenderness in patients with rheumatoid arthritis. Q J Med 1968; 37: 393-406.
15. Abbas AK, Lichtman AH, Pober JS. Cytokines. In: Cellular and molecular immunology. Abbas AK, Lichtman AH, Pober JS (eds). W. B. Saunders Company, Philadelphia 1994; 240-60.
16. Klimiuk PA, Sierakowski S, Latosiewicz R, et al. Serum matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in different histological variants of rheumatoid synovitis. Rheumatology (Oxford) 2002; 41: 78-87.
17. Klimiuk PA, Yang H, Goronzy JJ, et al. Production of cytokines and metalloproteinases in rheumatoid arthritis is T cell dependent. Clin Immunol 1999; 90: 65-78.
18. Klimiuk PA, Sierakowski S, Chwiećko J. Stężenie interleukiny 6 (IL-6) w surowicy koreluje ze stężeniem metaloproteinaz i ich tkankowych inhibitorów w reumatoidalnym zapaleniu stawów. Pol Arch Med Wewn 2003; 109: 119-23.
19. Franke S, Herrmann D, Hein G, et al. Interleukin-6, soluble interleukin-2-receptor and soluble interleukin-6-receptor in sera of patients with rheumatoid arthritis: influences of disease activity and drug therapy. Eur J Med Res 1997; 29: 401-6.
20. Houssiau FA, Devogelaer J, Van Damme J, et al. Interleukin-6 in synovial fluid and serum of patients with rheumatoid arthritis and other inflammatory arthritides. Arthritis Rheum 1988; 31: 784-8.
21. van Leeuwen MA, Westra J, Limburg PC, et al. Interleukin-6 in relation to other proinflammatory cytokines, chemotactic activity and neutrophil activation in rheumatoid synovial fluid. Ann Rheum Dis 1995; 54: 33-8.
22. Ichikawa Y, Yamada C, Horiki T, et al. Serum matrix metalloproteinase-3 and fibrin degradation product levels correlate with clinical disease activity in rheumatoid arthritis. Clin Exp Rheumatol 1998; 16: 533-40.
23. Keyszer G, Lambiri I, Nagel R, et al. Circulating levels of matrix metalloproteinases MMP-3 and MMP-1, tissue inhibitor of metalloproteinases 1 (TIMP-1), and MMP-1/TIMP-1 complex in rheumatic disease. Correlation with clinical activity of rheumatoid arthritis versus other surrogate markers. J Rheumatol 1999; 26: 251-8.
24. So A, Chamot AM, Peclat V, et al. Serum MMP-3 in rheumatoid arthritis: correlation with systemic inflammation but not with erosive status. Rheumatology 1999; 38: 407-10.