Evaluation of the expression of the immunosuppressive enzyme – indoleamine 2,3-dioxygenase in ovarian cancer tissue

Wstęp

Pomimo ogromnego postępu w diagnostyce oraz leczeniu, rak jajnika pozostaje główną przyczyną zgonów wśród schorzeń onkologicznych [1]. Badania pokazują, że najczęściej na raka jajnika zapadają kobiety po 50. roku życia.

Menopauza nie stanowi jednak istotnego czynnika predysponującego do powstania raka jajnika [2]. Status menopauzalny nie wiąże się z przebiegiem klinicznym raka jajnika. Wiek uznawany jest jednak za wiarygodny i niezależny czynnik predykcyjny, związany z przeżyciem i odpowiedzią na leczenie [3]. Środowisko hormonalne, w którym rozwija się guz u kobiet przed menopauzą i po menopauzie jest różne [4]. Progresja choroby nowotworowej warunkowana jest wieloma czynnikami, przy czym odpowiedź układu immunologicznego na rozwijający się nowotwór jest jednym z najważniejszych elementów [5–7]. Ostatnie doniesienia dowodzą, że w mechanizm ucieczki nowotworu spod nadzoru immunologicznego jest zaangażowany enzym 2,3-dioksygenaza indolaminy (IDO) [5].

2,3-dioksygenaza indolaminy jest wewnątrzkomórkowym enzymem inicjującym katabolizm tryptofanu (TRP) [8]. Immunosupresyjne działanie IDO po raz pierwszy udokumentowali Munn i wsp., wykazując protekcyjną rolę tego enzymu w odrzuceniu alogenicznego płodu u myszy [9]. Późniejsze badania dotyczyły roli IDO w patogenezie chorób nowotworowych. Wydzielana przez komórki nowotworowe IDO blokuje proliferację aloreaktywnych limfocytów T i komórek NK poprzez lokalne uszczuplenie zasobów tryptofanu i produkcję jego toksycznego metabolitu – kynureniny [5, 10, 11]. Limfocyty T i komórki NK (natural killer) są szczególnie wrażliwe na ubytek tryptofanu. Jego brak powoduje zahamowanie ich proliferacji oraz blokadę cyklu komórkowego w fazie G1 [9]. Na podstawie tych obserwacji wysnuto teorię, że ekspresja IDO może wyciszać lokalną odpowiedź immunologiczną poprzez blokowanie limfocytów T i komórek NK. Duże zainteresowanie badaczy wywołało wykazanie obecności IDO w prezentujących antygen komórkach dendrytycznych (dendritic cells – DCs). Udowodniono, że DCs z ekspresją IDO hamują odpowiedź immunologiczną na antygen nowotworowy [12].

Badania potwierdzają aktywność IDO w różnych ludzkich nowotworach: raku żołądka, trzustki, prostaty i odbytu [5]. W raku jajnika wykazano zależność pomiędzy silną ekspresją IDO a progresją choroby i krótszym czasem przeżycia [13, 14].

Cel pracy

Celem pracy była ocena ekspresji IDO na poziomie mRNA w tkance surowiczego oraz endometrioidalnego raka jajnika.

Materiał i metody

Badaniami objęto grupę 40 kobiet, leczonych operacyjnie w I Katedrze i Klinice Ginekologii Onkologicznej i Ginekologii Uniwersytetu Medycznego w Lublinie z powodu raka jajnika w II lub III stopniu zaawansowania wg FIGO (International Federation of Gynecology and Obstetrics). Histopatologiczna ocena wykazała obecność: raka surowiczego w 23 przypadkach i raka endometrioidalnego w 17 przypadkach. U badanych pacjentek stwierdzono nowotwór w stopniu zróżnicowania wg Światowej Organizacji Zdrowia (World Health Organization - WHO): G2 (n = 18) oraz G3 (n = 22). Grupę referencyjną stanowiły tkanki jajnika pobrane od 12 pacjentek, operowanych z innych wskazań niż patologia jajnika. W grupie badanej 15 pacjentek było przed menopauzą, a 25 po menopauzie, w grupie referencyjnej 5 było przed menopauzą, a 7 po menopauzie.

Tkanki guza zamrażano w ciekłym azocie i przechowywano do momentu izolacji mRNA w –80°C. Izolację RNA wykonywano z zastosowaniem odczynnika Tri Reagent zgodnie z instrukcją producenta. Jeden mikrogram totalnego RNA przepisywano na cDNA w reakcji odwrotnej transkrypcji z użyciem kitu High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Analizę wykonano z zastosowaniem techniki Real-Time PCR (polymerase chain reaction). Poziom ekspresji mRNA 2,3-dioksygenazy indolaminy został określony z użyciem sondy TaqMan (Assay ID Hs00984148_m1) na aparacie 7900 HT Fast-Real Time PCR Systems wg protokołu rekomendowanego przez producenta (Applied Biosystems). Ilościową analizę wykonano z zastosowaniem metody RQ (relative quantification), w której referencję endogenną stanowił gen GAPDH.

Wyniki

Uzyskane wyniki przedstawiono w tabelach I, II oraz na rycinie 1.

Ekspresja IDO na poziomie mRNA występowała we wszystkich badanych guzach jajnika. Była ona znamiennie wyższa (p < 0,05) w grupie pacjentek z rakiem jajnika (RQ = 0,171) w porównaniu z grupą kontrolną (RQ = 0,040). Rak surowiczy wykazywał istotnie wyższą ekspresję IDO (RQ = 0,319) w porównaniu z rakiem endometrioidalnym (RQ = 0,091); p = 0,02. W obu badanych typach histologicznych guza nie wykazano różnicy istotnej statystycznie w ekspresji IDO w odniesieniu do stopnia zróżnicowania histologicznego raka jajnika (w raku surowiczym p = 0,352, w raku endometrioidalnym p = 0,141). Nie zaobserwowano także różnic w ekspresji badanego enzymu w odniesieniu do stopnia zaawansowania klinicznego raka jajnika oraz statusu menopauzalnego. Ekspresja IDO zarówno w grupie kobiet przed menopauzą (RQ = 0,319), jak i po menopauzie (RQ = 0,117) była istotnie wyższa (p < 0,05) w obydwu typach histologicznych guza z porównaniu z grupą referencyjną.

Dyskusja

W prezentowanej pracy wykazano ekspresję IDO na poziomie mRNA we wszystkich 40 tkankach raka jajnika. Była ona istotnie wyższa w porównaniu z grupą kontrolną (p < 0,005). W naszych badaniach nie zanotowano różnic w ekspresji IDO w odniesieniu do statusu menopauzalnego. Ekspresja IDO prawdopodobnie nie jest regulowana hormonalnie, a jego udział w progresji raka jajnika nie zależy od statusu menopauzalnego. Przedstawione przez autorów niniejszej pracy wyniki dotyczą dwóch typów histologicznych raka jajnika (surowiczego i endometrioidalnego). Ciekawą obserwacją wydaje się istotnie wyższa ekspresja IDO w raku surowiczym w porównaniu z rakiem endometrioidalnym. Stwierdzono także wyższą ekspresję IDO u pacjentów z III stopniem zaawansowania klinicznego raka jajnika. Można więc przypuszczać, że progresji i rozsiewowi nowotworu towarzyszy silniejsza inhibicja odpowiedzi immunologicznej w następstwie wyższej ekspresji IDO. Wyniki przeprowadzonych badań są zgodne z obserwacjami Okamoto i wsp., którzy po raz pierwszy wykazali obecność IDO u chorych na raka jajnika, opornych na leczenie paklitakselem. Silna ekspresja IDO była obserwowana w zmianach nowotworowych u pacjentów z III–IV stopniem zaawansowania klinicznego surowiczego raka jajnika [15]. Wyraźną korelację między ekspresją IDO a krótszym czasem przeżycia u chorych z zaawansowanym surowiczym rakiem jajnika (nie z innymi typami histologicznymi) potwierdziły badania Takao i wsp. [16]. Inaba i wsp. uzyskali wyniki na podstawie analizy immunohistochemicznej. W badaniach 60 przypadków raka jajnika, wysoka ekspresja IDO obecna była u chorych z III–IV stopniem zaawansowania klinicznego (70%) i wyraźnie korelowała z niskim odsetkiem limfocytów T CD8+ infiltrujących guz oraz krótszym czasem przeżycia. Odmiennie niż w badaniach Takao i wsp., korelacja ta obserwowana była we wszystkich histologicznych typach raka jajnika [17]. Immunosupresyjne działanie IDO potwierdzają doniesienia Nonaka i wsp. [18]. Badacze ci wykazali, że ludzkie komórki raka jajnika ze wzmożoną ekspresją IDO blokują funkcję komórek NK, co prowadzi do wzrostu guza. Do podobnych wniosków dotyczących roli IDO w indukcji tolerancji immunologicznej doszli Qian i wsp. Zwiększonej ekspresja IDO w komórkach raka jajnika towarzyszyła mniejsza proliferacja limfocytów T in vitro [19]. Z przedstawionych danych wynika, że IDO indukuje tolerancję immunologiczną w mikrośrodowisku guza. Ekspresję IDO wykazuje ponad połowa pacjentów dotkniętych nowotworami ginekologicznymi w III i IV stopniu zaawansowania klinicznego, co jest skorelowane z krótszym czasem przeżycia. W świetle powyższych badań, ciekawym wydaje się dokonanie wieloczynnikowej analizy na większej liczbie pacjentów, mającej na celu stwierdzenie, czy IDO może stanowić czynniki prognostyczny tylko dla surowiczego raka jajnika czy także dla pozostałych typów histologicznych.

Wnioski

Nowotwory jajnika różniące się budową histologiczną wykazują zróżnicowaną ekspresję IDO.



Przeprowadzone badania były finansowane z grantu: KBN N N407038537 oraz zadania badawczego MNsd 125/12 i MNsd 126/12. Praca powstała z wykorzystaniem sprzętu zakupionego w ramach projektu: „Wyposażenie innowacyjnych laboratoriów prowadzących badania nad nowymi lekami stosowanymi w terapii chorób cywilizacyjnych i nowotworowych” w ramach Programu Operacyjnego Rozwój Polski Wschodniej 2007–2013, Osi priorytetowej I Nowoczesna Gospodarka, Działania I.3 Wspieranie Innowacji.

Piśmiennictwo

1. McGuire III WP, Markman M. Primary ovarian cancer chemotherapy: current standards of care. Br J Cancer 2003; 89 Suppl. S3-8.

2. Marzec-Kotarska B, Kotarski J, Cybulski M, et al. Ekspresja genu podoplani­ny w złośliwych nowotworach jajnika. Prz Menopauz 2011; 12: 102-5.

3. Pectasides D, Fountzilas G, Aravantinos G, et al. Epithelial ovarian carcinoma in younger vs older women: is age an independent prognostic factor? The Hellenic Oncology Cooperative Group experience. Int J Gynecol Cancer 2007; 17: 1003-10.

4. Vo C, Carney ME. Ovarian cancer hormonal and environmental risk effect. Obstet Gynecol Clin North Am 2007; 34: 687-700.

5. Uytlenhove C, Pilotte L, Theatev I, et al. Evidence for a tumoral immune resistance mechanism based on tryptophan degradation by indoleami­ne 2,3-dioksygenase . Nat Med 2003; 9: 1269-74.

6. Wertel I, Polak G, Barczyński B, et al. Subpopulacje komórek dendrytycznych krwi obwodowej w przebiegu chemioterapii raka jajnika. Ginekol Pol 2007; 78: 768-71.

7. Whiteside TI. Immune suppression in cancer: effects on immune cells, mechanism and future therapeutic intervention. Semin Cancer Biol 2006; 16: 3-15.

8. Muller AJ, DuHadaway JB, Donover PS, et al. Inhibition of indoleamine 2,3-dioksygenase an immunomodulatory target of the cancer suppression gene Bin1, potentiates cancer chemotherapy. Nat Med 2005; 11: 312-9.

9. Munn DH, Zhou M, Attwood JT, et al. Prevention of allogenic fatal rejection by tryptophan catabolism. Science 1998; 281: 1191-3.

10. Frumento G, Rotondo R, Tonetti M, et al. Tryptophan-derived catabolites are responsible for inhibition of T and natural killer cell proliferation induced by indoleamine 2,3-dioxygenase. J Exp Med 2002; 196: 459-68.

11. Della Chiesa M, Carlomagno S, Frumento G, et al. The tryptophan catabolite L-kynurenine inhibits the surface expression of NKp46- and NKG2D-activating receptors and regulates NK-cell function. Blood 2006; 108: 4118-25.

12. Munn DH, Sharma MD, Hou D, et al. Expression of indoleamine 2,3-dioxygenase by plasmacytoid dendritic cells in tumor-draining lymph nodes. J Clin Invest 2004; 114: 280-90.

13. Inaba T, Ino K, Kajiyama H, et al. Indoleamine 2,3-dioxygenase expression predicts impaired survival of invasive cervical cancer patients treated with radical hysterectomy. Gynecol Oncol 2010; 117: 423-8.

14. Ino K, Yoshida N, Kajiyama H, et al. Indoleamine 2,3-dioxygenase is a novel prognostic indicator for endometrial cancer. Br J Cancer 2006; 95: 1555-61.

15. Okamoto A, Nikaido T, Ochiai K, et al. Indoleamine 2,3-dioxygenase serves as a marker of poor prognosis in gene expression profiles of serous ovarian cancer cells. Clin Cancer Res 2005; 11: 6030-9.

16. Takao M, Okamoto A, Nikaido T, et al. Increased synthesis of indoleami­ne-2,3-dioxygenase protein is positively associated with impaired survival in patients with serous-type, but not with other types of, ovarian cancer. Oncol Rep 2007; 17: 1333-9.

17. Inaba T, Ino K, Kajiyama H, et al. Role of the immunosuppressive enzyme indoleamine 2,3-dioxygenase in the progression of ovarian carcinoma. Gynecol Oncol 2009; 115: 185-92.

18. Nonaka H, Saga Y, Fujiwara H, et al. Indoleamine 2,3-dioxygenase promotes peritoneal dissemination of ovarian cancer through inhibition of natural killer cell function and angiogenesis promotion. Int J Oncol 2011; 38: 113-20.

19. Qian F, Villella J, Wallace PK, et al. Efficacy of levo-1-methyl tryptophan and dextro-1-methyl tryptophan in reversing indoleamine-2,3-dioxygenase-mediated arrest of T-cell proliferation in human epithelial ovarian cancer. Cancer Res 2009; 69: 5498-504.