Evaluation of the effectiveness of RESAN vaccine in the prophylaxis and treatment of endometriosis – an experimental study in an animal model. Part I

Wstęp

Endometrioza jest przewlekłą, zapalną i estrogenozależną chorobą, która polega na implantacji oraz rozroście gruczołów i podścieliska błony śluzowej macicy poza jamą macicy. W przebiegu choroby dochodzi również do wzrostu wydzielania cytokin prozapalnych, które zmieniają właściwości płynu otrzewnowego oraz do obniżenia apoptozy w endometrium ektopowym [1–3].
Częstość występowania endometriozy w populacji kobiet bez objawów klinicznych wynosi ok. 15–20% [4]. Odsetek ten jest wyższy wśród pacjentek leczonych z powodu niepłodności (30–50%) i u kobiet z dolegliwościami bólowymi w miednicy mniejszej (40–60%) [4, 5]. Jednak na przestrzeni ostatnich 30 lat współczynnik zachorowań nie uległ znacznemu wzrostowi i waha się 2,37–2,49 na 1000 kobiet na rok [6].
Endometrioza stanowi poważny problem społeczny. W ciągu roku 41% chorych na endometriozę zmuszonych jest do zmiany miejsca zatrudnienia. Na zwolnieniu lekarskim, średnio 5 dni w miesiącu, przebywa aż 78% kobiet, głównie z powodu silnych dolegliwości bólowych. Ponadto endometrioza jest przyczyną rozpadu 10% związków partnerskich [6].
Kliniczne objawy endometriozy są bardzo niespecyficzne. Najczęściej zgłaszanymi problemami ginekologicznymi są przewlekłe dolegliwości bólowe, zlokalizowane głównie w miednicy mniejszej (30–50% kobiet), ból związany z cyklem miesiączkowym (60–80%) oraz bolesne współżycie płciowe (25–50%) [7]. Zaburzenia cykliczności miesiączkowania (11–30%), jak również niepłodność (30–50%) należą do częstych objawów związanych z endometriozą [7].
Kierując się doborem sposobu terapii, należy brać pod uwagę 3 zasadnicze założenia:
• leczenie powinno redukować dolegliwości bólowe,
• wydłużać czas nawrotu choroby tak długo, jak to jest tylko możliwe,
• umożliwić zajście w ciążę [6].
Powszechnie uznanymi metodami leczenia endometriozy jest leczenie operacyjne oraz farmakoterapia. Jednak efektywność terapii oraz odsetek nawrotów zmusza do poszukiwania nowych form leczenia [7, 8]. Zespół dr. Ovsienko przeprowadził wstępne badania kliniczne z zastosowaniem szczepionki RESAN w leczeniu endometriozy. Wśród uczestniczących 24 kobiet z rozpoznaną endometriozą miednicy mniejszej, zdiagnozowano dodatkowo u 10 z nich mięśniaki macicy, u 2 zmiany torbielowate w przydatkach o echogenności typowej dla endometriozy. Po zakończeniu doświadczenia zaobserwowano zmniejszenie się wymiarów torbieli endometrialnych oraz mięśniaków macicy. Ponadto poziomy markerów nowotworowych w surowicy krwi – CA-125, CA-19-9, CA-15-3 i CEA uległy istotnemu statystycznie obniżeniu (p<0,05) [9]. Niestety, badania te nie zostały szczegółowo udokumentowane, zaś grupa badana była nieliczna i niejednorodna. Należy zatem uznać, iż wyciąganie poważniejszych wniosków z cytowanych badań nie jest możliwe.

Cel pracy

Celem pracy jest określenie skuteczności szczepionki RESAN, zastosowanej w profilaktyce i leczeniu endometriozy miednicy mniejszej, w badaniu eksperymentalnym na modelu zwierzęcym.

Materiał i metody

Materiał do badań doświadczalnych stanowiło 58 dojrzałych szczurzyc szczepu Wistar. Na przeprowadzenie badań uzyskano zgodę lokalnej Komisji Etycznej ds. Doświadczeń na Zwierzętach w Poznaniu. Biorący udział w eksperymencie mieli zezwolenia indywidualne. Eksperyment przeprowadzono zgodnie z zaleceniami Ministerstwa Edukacji i Szkolnictwa Wyższego z 1959 r., a także Światowej deklaracji UNESCO odnośnie praw zwierząt z Paryża, z roku 1978.
Zwierzęta przebywały w Katedrze i Zakładzie Toksykologii Uniwersytetu Medycznego im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu. Szczury mieszkały w plastikowych klatkach, w pomieszczeniu o stałej temperaturze (21°C) i wilgotności, z ciągłym dostępem do paszy i wody pitnej. Ich znormalizowana dieta zawierała 24% białka i była taka sama dla wszystkich zwierząt.
W składzie szczepionki RESAN znajdują sie kompleksy molekuł uzyskanych z ksenogenicznych tkanek zwierzęcych, m.in. glikoproteiny, peptydy i fragmenty węglowodanów z więcej niż 40 różnych substancji. Dokładny skład szczepionki jest chroniony patentem RB numer 542883. Szczepionka ta występuje pod postacią krystalicznego proszku (200 mg), który należy uzupełnić 0,9-procentową solą fizjologiczną do objętości 1 ml [9].
Zwierzęta w wieku ok. 4 mies. i o wadze 200–300 g zostały podzielone na 3 grupy. W grupie I (n=24), na 3 mies. przed przystąpieniem do wszczepienia endometriozy, podano profilaktycznie szczepionkę. W grupie II (n=24), po usunięciu ognisk endometriozy z otrzewnej ściennej jamy brzusznej, podano RESAN w celach leczniczych. Grupę III stanowiła grupa kontrolna, której nie podano szczepionki, a po przecięciu rogu macicy i założeniu szwów hemostatycznych, wolne końce pozostawiono w jamie otrzewnowej (ang. sham operation). Podczas wszystkich operacji zwierzęta znieczulano pentobarbitalem dootrzewnowo, w dawce 60 mg/kg masy ciała.
Pierwszy etap badań polegał na podaniu szczepionki 24 szczurom, na 3 mies. przed planowanym wszczepieniem endometriozy (grupa I). W drugim etapie eksperymentu wszczepiono fragmenty endometrium do otrzewnej 48 szczurów (24 uprzednio zaszczepionym z grupy I i 24 z grupy II, którym wcześniej nie podano immunoprofilaktyki). Zabiegi przeprowadzano w warunkach czystych, ale nie ściśle sterylnych. Sierść na brzuchu szczurzyc ogolono. Po przemyciu pola operacyjnego roztworem hibitanu, otwierano jamę brzuszną w linii pośrodkowej przedniej na długości ok. 4 cm. W czasie pierwszego otwarcia jamy brzusznej, po uwidocznieniu prawego rogu macicy i podwiązaniu naczyń macicznych, wycięto segment prawego rogu macicy o długości 4 cm. Następnie zaopatrzono hemostatycznie pozostałe brzegi macicy. Po umieszczeniu uzyskanego wycinka w roztworze soli fizjologicznej, błonę śluzową oddzielono od mięśnia macicy. Uzyskano fragment endometrium o wymiarach 4 × 4 mm, który naszyto na otrzewną ścienną po stronie prawej powłoki brzusznej za pomocą szwów nylonowych 6-0. Wszczepienia dokonano u pierwszych 24 zaszczepionych szczurów i u 24 zwierząt, którym szczepionki RESAN wcześniej nie podano. W grupie III, u pozostałych 10 szczurów, po podwiązaniu naczyń, prawy róg macicy został przecięty, a wolne końce pozostawiono po zaopatrzeniu szwami hemostatycznymi. Na otrzewną założono szew nylonowy, tak jak w przypadku wszczepienia endometrium. Jama brzuszna została zamknięta szwem ciągłym 1-0 (Dexon). Do oddzielania błony śluzowej od błony mięśniowej macicy i podczas wszczepiania ektopowego endometrium użyto techniki mikrochirurgicznej.
Etap trzeci polegał na usunięciu wszczepionych implantów endometrium. W pierwszej kolejności oceniano, czy doszło do rozwoju endometriozy. Po wykonaniu dokumentacji fotograficznej i uwolnieniu ewentualnych zrostów, pobrano materiał do badania histologicznego z okolicy otrzewnej ściennej strony prawej powłoki brzusznej z miejsca, gdzie uprzednio wszczepiono endometrium ektopowe. Następnie uwidoczniono i wycięto lewy róg macicy, po wcześniejszym podwiązaniu naczyń macicznych. Jama brzuszna została zamknięta szwem ciągłym 1-0 (Dexon). Równocześnie zwierzętom, które wcześniej nie zostały zaszczepione, podano RESAN (grupa II). Ostatni, IV etap badań przeprowadzono po kolejnych 3 mies. Po otwarciu jamy brzusznej oceniano, czy nie ma ognisk przetrwałej endometriozy i po wykonaniu dokumentacji fotograficznej pobrano materiał do badania histologicznego.
Usunięte podczas kolejnych etapów eksperymentu, ogniska endometriozy utrwalono w 4-procentowej zbuforowanej formalinie, skrojono na mikrotomie, a następnie w sposób typowy przeprowadzono barwienie hematoksyliną i eozyną. Ocenę histologiczną w mikroskopie świetlnym wykonano w sposób ślepy (osoba oceniająca nie wiedziała, z której grupy pochodzi materiał), poszukując gruczołów endometrialnych oraz elementów podścieliska endometrium z makrofagami obładowanymi hemosyderyną. Wszystkie preparaty dodatnie skonsultowano z drugim histopatologiem.
Otrzymane wyniki poddano analizie statystycznej przy użyciu jednostronnego testu Fishera dla zdarzeń losowych za pomocą programu Statistica 7.1. Za poziom istotności statystycznej przyjęto wartość p<0,05.

Wyniki

Nie wszystkie zwierzęta pomyślnie zniosły operację i okres pooperacyjny. Z powodu powikłań okołooperacyjnych zwierzęta nr 12. i 30. oddano do utylizacji.
Rozpoznanie endometriozy przedstawiono na ryc. 1.–4.
Podczas III etapu doświadczenia, w ocenie mikroskopowej fragmentów otrzewnej uzyskanych z miejsca, gdzie uprzednio wszczepiono implanty, potwierdzono endometriozę w jednym przypadku w grupie I i u 16 zwierząt w grupie II. W grupie III nie stwierdzono wykładników endometriozy w ocenie histopatologicznej. Podczas ostatniego otwarcia jamy brzusznej (w IV etapie eksperymentu), 3 mies. po uprzednim wycięciu ognisk ektopowych, nie stwierdzono cech o charakterze endometriozy zarówno w badaniu makroskopowym, jak i mikroskopowym u żadnego ze zwierząt.

Obecność zrostów
W III etapie doświadczenia uwidocznione zrosty wokół implantu (występujące samodzielnie i w łączności ze zrostami w linii cięcia) występowały u 3 i 14 zwierząt, odpowiednio w grupie I i II. Nie stwierdzono ich u żadnego szczura w grupie kontrolnej. W IV etapie doświadczenia zrosty w miejscu, gdzie uprzednio usunięto endometriozę występowały tylko u 3 zwierząt w grupie II.
Procentowe porównanie występowania endometriozy i obecności zrostów tkankowych w badanych grupach, III i IV etapu doświadczenia, przedstawiono w tab. I.

Dyskusja

Endometrioza jest przewlekłą chorobą, w przebiegu której dochodzi do rozrostu gruczołów i podścieliska błony śluzowej macicy poza jamą macicy. Dotyczy głównie kobiet w wieku rozrodczym, ograniczając ich płodność i powodując obniżenie jakości życia. Brak jednolitych poglądów na temat jej etiopatogenezy powoduje trudności terapeutyczne i wysokie odsetki nawrotów choroby. Omówione powyżej badanie kliniczne zespołu dr. Ovsienko [9] oraz brak jednoznacznych dowodów naukowych i doniesień literaturowych odnośnie preparatu RESAN było jednym z ważniejszych powodów, które skłoniły autorów do podjęcia niniejszej pracy. Zastosowanie preparatu na modelu zwierzęcym może okazać się przełomowym momentem do oceny skuteczności działania tej szczepionki. Dlatego niezwykle interesująca wydaje się być zarówno ewentualna skuteczność RESAN w leczeniu endometriozy, jak i w profilaktyce choroby.
Z wcześniejszych badań na zwierzęcym modelu endometriozy wynika, że w stałych warunkach (bez podawania jakichkolwiek leków) można spodziewać się rozwoju implantów aż u 75–100% zwierząt [10, 11]. Od wielu lat trwają badania nad zastosowaniem szczepionek w profilaktyce endometriozy. W badaniu eksperymentalnym z randomizacją, z podwójnie ślepą próbą, Gul i wsp. [12] zastosowali szczepionkę przeciwko gruźlicy (BCG) w zapobieganiu implantacji i rozwoju endometriozy u szczurów rasy Wistar (185–215 g). Na 3 tyg. przed wszczepieniem endometrium w tęczówkę oka całej grupy badanej (n=40), połowie zwierząt (n=20) podano szczepionkę BCG. Po 6 tyg. obserwacji otrzymane wyniki jednoznacznie wskazywały na skuteczność takiego sposobu profilaktyki. Endometrioza rozwinęła się tylko u 5 (25%) zaszczepionych szczurów i aż u 17 (85%) zwierząt z grupy kontrolnej. W badaniu potwierdzono obecność podścieliska i gruczołów endometrialnych, wzmożonego rysunku naczyniowego, jak również makrofagów obładowanych złogami hemosyderyny na przedniej ścianie tęczówki oka [12]. W innym badaniu z randomizacją, z podwójnie ślepą próbą, Itil i wsp. [13] podawali 0,1 ml szczepionki BCG dojrzałym płciowo szczurzycom rasy Wistar (190–200 g). Cztery tyg. po zaszczepieniu, po usunięciu prawego rogu i wypreparowaniu błony śluzowej macicy, tkankę ektopową naszyto po obu stronach otrzewnej jamy brzusznej. Po kolejnych 8 tyg. badanie zakończono pobraniem do oceny histopatologicznej wszczepów tkankowych. Istotny statystycznie wzrost endometriozy zaobserwowano u 27,8% zaszczepionych i 67,6% szczurów z grupy kontrolnej (p=0,01) [13]. Podsumowując przytoczone badania, można sądzić, że immunostymulacja szczepionką przeciw gruźlicy, zastosowana w zapobieganiu rozwoju endometriozy w doświadczeniach na zwierzętach, przyczyniła się do znacznego ograniczenia wzrostów endometrium ektopowego.
W przeprowadzonym badaniu eksperymentalnym na zwierzętach zaobserwowano zahamowanie wzrostu ektopowych fragmentów na otrzewnej powłoki brzusznej u prawie wszystkich zwierząt (grupa I), u których zastosowano szczepionkę RESAN w profilaktyce endometriozy. W ocenie mikroskopowej fragmentów otrzewnej uzyskanych z miejsca, gdzie uprzednio wszczepiono implanty, potwierdzono endometriozę tylko w 1 przypadku (4,4%). W grupie II, po wszczepieniu implantu tkankowego, a przed podaniem preparatu RESAN jako środka leczniczego, rozrost endometriozy uzyskano aż u 16 zwierząt (70%). W IV etapie badania, po wcześniejszym wycięciu endometriozy i terapeutycznym podaniu szczepionki, nawrotu choroby nie uzyskano u żadnego szczura. Cienkie i przezroczyste zrosty występowały głównie tam, gdzie po wycięciu zmiany potwierdzano obecność endometriozy. Badania histopatologiczne wykazały, że wszczepiony do jamy otrzewnowej fragment endometrium zawiera podścielisko i gruczoły endometrialne, jak również makrofagi obładowane złogami hemosyderyny. W niniejszym badaniu nie stosowano żadnych innych leków – zarówno przed, jak i po operacji – oprócz szczepionki RESAN, które w jakikolwiek sposób wpływałyby na przyjmowanie się i rozwój transplantów.
Porównując odsetek pozytywnych wszczepień endometriozy pomiędzy doświadczeniami Gul i wsp. [12] vs Itil i wsp. [13] vs niniejsze badanie (25 vs 27,8 vs 4,4%), uzyskano znaczną rozbieżność w wynikach badań. Szczepionka BCG (Bacillus Calmette-Guerin) jest atenuowanym szczepem prątka bydlęcego gruźlicy zaadaptowanym do celów profilaktyki pierwotnej przeciwko gruźlicy. Jej immunostymulujące właściwości wynikają z tego, że po wprowadzeniu do organizmu, za pośrednictwem monocytów i makrofagów, pobudzona zostaje komórkowa odpowiedź immunologiczna [14]. Należy jednak pamiętać, że w takim przypadku mamy do czynienia z immunoprofilaktyką preparatem bakteryjnym. W doświadczeniu autorów niniejszej pracy szczepionka RESAN składa się z mieszaniny glikoprotein, peptydów i fragmentów węglowodanów więcej niż 40 różnych substancji uzyskanych z tkanek zwierzęcych, które imitują antygeny endometrium i ognisk endometriozy. Można zatem przypuszczać, że szczepionka RESAN w korzystniejszy sposób wpłynęła na przywrócenie pierwotnej równowagi Th1/Th2, a zatem spowodowała silniejsze pobudzenie odpowiedzi komórkowej, prowadzącej do odrzucenia wszczepionych fragmentów endometrium.
Przeniesienie przedstawionych badań do działań klinicznych musi być ostrożne. Zastosowany przez autorów niniejszej pracy w doświadczeniu eksperymentalnym na modelu zwierzęcym preparat RESAN może okazać się przełomowym momentem dla rozwoju dalszych badań nad skutecznością immunoprofilaktyki endometriozy. Można również przypuszczać, że nowoczesne leczenie będzie opierało się na modulowaniu odpowiedzi immunologicznej, niezależnie od tego czy szczepionka będzie stosowana w monoterapii, czy w leczeniu skojarzonym.

Wnioski

1. Badana szczepionka jest skuteczną formą immunoprofilaktyki endometriozy w modelu zwierzęcym.
2. Immunoterapia skojarzona z leczeniem chirurgicznym jest skuteczną formą leczenia endometriozy u zwierząt laboratoryjnych.

Piśmiennictwo

1. Mounsey A, Wilgus A, Slawson D. Diagnosis and management of endometriosis. Am Fam Physician 2006; 74: 594-600.
2. Harada T, Iwabe T, Terakawa N. Role of cytokines in endometriosis. Fertil Steril 2001; 76: 1-10.
3. Szymanowski K. Ocena ekspresji wybranych integryn, metaloproteinaz, cytokin oraz nasilenia apoptozy w błonie śluzowej jamy macicy u kobiet z endometriozą małego stopnia. Seminaria z medycyny perinatalnej. Tom XI. Ośrodek Wydawnictw Naukowych, Poznań 2004; 7-80.
4. Kyama CM, Debrock S, Mwenda JM, et al. Potential involvement of the immune system in the development of endometriosis. Reprod Biol Endocrinol 2003; 1: 123-32.
5. Matarese G, De Placido G, Nikas Y, et al. Pathogenesis of endometriosis: natural immunity dysfunction or autoimmune disease? Trends Mol Med 2003; 9: 223-8.
6. Barton-Smith P, Ballard K, Kent ASH. Endometriosis: a general review and rationale for surgical therapy. Rev Gynaecol Perinat Pract 2006; 6: 168-76.
7. Giudice LC, Kao LC. Endometriosis. Lancet 2004; 364: 1789-99.
8. Jakiel G, Robak-Chołubek D, Tkaczuk-Włach J. Endometrioza. Prz Menopauz 2006; 2: 126-9.
9. www.anticancer.net/resan
10. Jędrzejczak P, Szymanowski K, Skrzypczak J, et al. Eksperymentalny model endometriozy u szczurów. Gin Pol 1990; 61: 387-91.
11. Szymanowski K, Florek E, Mikołajczyk M, et al. Integrin pattern in rats endometrium after endometriosis induction. Pol J Gynaecol Invest 2002; 5: 293-8.
12. Gul A, Yasar T, Ugras S. BCG vaccination to prevent implantation of endometriosis: an experimental study in rats. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2001; 98: 209-12.
13. Itil IM, Cirpan T, Akercan F, et al. Effect of BCG vaccine on peritoneal endometriotic implants in a rat model of endometriosis. Aust N Z J Obstet Gynaecol 2006; 46: 38-41.
14. Lasek W. Immunomodulacja. W: Immunologia. Gołąb J (red.). Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2006; 483.
15. Parazzini F. Adhesions and pain in women with first diagnosis of endometriosis: results from a cross-sectional study. J Minimal Invasive Gynecol 2006; 13: 49-54.