Ocena stężenia TNF-α w surowicy dzieci z nieswoistymi zapaleniami jelit

Wstęp
Cytokinami nazywa się hormonopodobne peptydy i niskocząsteczkowe białka wpływające na funkcje komórek i warunkujące ich wzajemne oddziaływanie. Są one wytwarzane głównie przez komórki układu odpornościowego – aktywowane limfocyty i makrofagi. Czynnik martwicy nowotworów a (TNF-α) jest cytokiną o właściwościach immunomodulujących i przeciwnowotworowych. Syntezę i wydzielanie TNF-α, stymulują głównie toksyny bakteryjne w wyniku aktywacji receptorów CD14 i CD11/18 [1, 2]. Głównym czynnikiem indukującym syntezę i uwalnianie TNF-α w makrofagach są lipopolisacharydy błon komórkowych bakterii Gram-ujemnych. Limfocyty T i B po stymulacji wykazują również wzmożoną syntezę i uwalnianie TNF-α. W przebiegu reakcji typu późnego TNF-α jest uwalniany z ziarnistości mastocytów. W komórkach Panetha w jelicie cienkim stwierdzono obecność mRNA dla TNF-α [3–5]. Cytokina ta działa plejotropowo i jest określana jako centralny regulator wielu reakcji biologicznych. Działa prozapalnie i immunoregulatorowo, powoduje wzrost przepuszczalności małych naczyń. Przez pobudzenie komórek T, eozynofili oraz indukcję endotelialnych cząstek adhezyjnych inicjuje ruch krążących komórek zapalnych do tkanek. Czynnik TNF-α bierze udział w patogenezie ostrych stanów zapalnych spowodowanych przez bakterie, tj. wstrząsu endotoksycznego, posocznicy oraz przewlekłych stanów zapalnych, takich jak nieswoiste zapalenia jelit. Odgrywa dużą rolę w powstawaniu wielu objawów klinicznych charakterystycznych dla choroby Leśniowskiego-Crohna oraz wrzodziejącego zapalenia jelita grubego [6–8]. Jelito jest ważnym organem immunologicznym zawierającym sieć komórkową wydzielającą peptydy, białka i inne czynniki obronne. Czynniki genetyczne mogą mieć udział zarówno w zwiększonej penetracji bakterii i ich produktów, jak i zaburzonej śluzówkowej odpowiedzi immunologicznej na te produkty bakteryjne [9, 10].
Cel pracy
Celem pracy była ocena stężenia TNF-α w surowicy dzieci z nieswoistymi zapaleniami jelit oraz próba wykazania związku jego stężenia z wybranymi objawami klinicznymi i mutacją genu NOD2/CARD15.
Materiał i metody
Badaniami objęto 78 dzieci w wieku 4–18 lat (średnia 14 lat), 38 z chorobą Leśniowskiego-Crohna, 40 z wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego. Rozpoznanie choroby ustalono na podstawie kryteriów Porto (badanie podmiotowe, przedmiotowe, badania laboratoryjne, immunologiczne, radiologiczne, endoskopowe górnego i dolnego odcinka przewodu pokarmowego, histopatologiczne). Grupę kontrolną stanowiło 23 dzieci w podobnym przedziale wiekowym z zaburzeniami czynnościowymi przewodu pokarmowego. Charakterystykę kliniczną badanych dzieci przedstawiono w tab. I. Zawartość TNF-α w surowicy oznaczano metodą immunoenzymatyczną (ELISA), wykorzystując zestawy do określania cytokin firmy Bender MedSystems (Austria). Ekstynkcję odczytywano w czytniku do mikropłytek Multiscan RC (Labsystems, Finlandia). Z uzyskanych wartości ekstynkcji obliczono stężenia cytokin w stosunku do krzywej wzorcowej wykonywanej oddzielnie dla każdej serii oznaczeń. Najniższe stężenie oznaczalne w zestawach dla TNF-α wynosiło 3,83 pg/ml. Oznaczenia TNF-α wykonano w Zakładzie Farmakologii Klinicznej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach. Badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Bioetyczną Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach.
Metody analizy statystycznej
Ponieważ rozkład większości zmiennych różnił się istotnie od rozkładu normalnego (test Kołmogorowa-Smirnowa, p<0,05), do ich opisu stosowano medianę (zakres), a do weryfikacji hipotez – testy nieparametryczne. Różnice między podgrupami w odniesieniu do zmiennych numerycznych weryfikowano z użyciem testu U Manna-Whitneya. W przypadku występowania więcej niż dwóch podgrup w pierwszym etapie stosowano test Kruskala-Wallisa. Jeżeli wartość p w tym teście wynosiła <0,05, w dalszej części podgrupy porównywano parami z zastosowaniem testu U Manna-Whitneya. Zależności między dwoma zmiennymi numerycznymi weryfikowano z zastosowaniem testu korelacji rang Spearmana.
Wyniki
Stężenie TNF-α w grupie dzieci z chorobą Leśniowskiego-Crohna było znamiennie statystycznie wyższe w porównaniu ze stężeniami u dzieci z wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego i w grupie kontrolnej (tab. II). W analizie statystycznej badano związek TNF-α z aktywnością choroby i stanem odżywienia badanych dzieci. Nie stwierdzono znamiennie statystycznych różnic TNF-α w zależności od stanu odżywienia i przebiegu choroby w badanych grupach dzieci (tab. III). Nie potwierdzono związku między obecnością poszczególnych mutacji genu NOD2/CARD15 ze stężeniem TNF-α w badanych grupach. Również w analizie stężenia TNF-α u wszystkich dzieci z co najmniej jedną mutacją genu NOD2/CARD15 (R702W, G908R i L1007fs) nie wykazano znamiennych statystycznie różnic (tab. IV).
Omówienie
Czynnik TNF-α jest wydzielany w błonie śluzowej przewodu pokarmowego i stanowi ważny mediator zapalenia w nieswoistych zapaleniach jelit. Badania dotyczące jego stężeń w przebiegu nieswoistych zapaleń jelit zarówno w surowicy chorych, jak i w zmienionej zapalnie błonie śluzowej jelit są niejednoznaczne. W badaniach własnych wykazano znamiennie statystycznie wyższe stężenia TNF-α w surowicy dzieci z chorobą Leśniowskiego-Crohna w porównaniu z pozostałymi grupami badanych. Podobne wyniki przedstawił Murch. Również w jego badaniach stężenie TNF-α było podwyższone, przede wszystkim w okresach zaostrzenia choroby, w porównaniu z okresami remisji. MacDonald stwierdził wysokie stężenie TNF-α w błonie śluzowej jelit związane z nasileniem zmian zapalnych, które jednak nie korelowało ze stężeniem w surowicy. Również Olson wykazał wysoką ekspresję TNF-α w bioptatach błony śluzowej jelit u dzieci z nieswoistymi zapaleniami jelit [11, 12]. W przebiegu nieswoistych zapaleń jelit cytokina ta może być odpowiedzialna za wiele objawów klinicznych: • gorączkę – jest endogennym pirogenem wywołującym wzrost temperatury, bezpośrednio wpływając na neurony podwzgórza i pośrednio przez indukuję wydzielania interleukiny 1 (IL-1), • zapalenie stawów – wywołuje apoptozę chondrocytów chrząstki wzrostowej i hamuje ich proliferację, • wyniszczenie – wywiera potencjalnie kataboliczny efekt na komórki tłuszczowe (hamuje aktywację lipazy lipoproteiny) i mięśniowe, skutkując lipolizą i glikogenolizą, znacznie wpływa na metabolizm kolagenu, a także jest odpowiedzialna za brak łaknienia (efekt anorektyczny) i wpływa na wzrost katabolizmu białkowego, • niedobór wzrostu – obniża insulinowy czynnik wzrostu 1 (ang. insulin like growth factor 1 – IGF-1) przez redukcję ekspresji receptorów hormonu wzrostu GH w hepatocytach; razem z IL-1 może wywołać stan oporności IGF-1 systemowo lub na poziomie chrząstki wzrostowej [13, 14]. U badanych przez autorów niniejszej pracy dzieci nie występowała zależność stężenia TNF-α w surowicy z aktywnością choroby. Ze względu na rolę, jaką odgrywa TNF-α w procesach zapalnych i jego udział w etiopatogenezie niedożywienia u dzieci z nieswoistymi zapaleniami jelit, autorzy przeprowadzili analizę związku stężenia TNF-α ze stanem odżywienia, która jednak nie dała wyniku pozytywnego. Podobne wyniki uzyskał Hyams. Nie zaobserwował korelacji stężenia TNF-α ze stanem odżywienia oraz z aktywnością choroby u dzieci z chorobą Leśniowskiego-Crohna [15–17]. W patogenezie tej choroby mutacje genu NOD2/CARD15 ściśle wiążą się z wydzielaniem cytokin prozapalnych, głównie TNF-α. Gen NOD2/CARD15 jest składową wrodzonego układu immunologicznego, regulującego odpowiedź na patogeny bakteryjne. Ponadto koduje wewnątrzkomórkowe czynniki ważne w odpowiedzi zapalnej na peptydoglikany bakteryjne. Produkt genu NOD2/CARD15 aktywuje transkrypcję czynnika jądrowego NFkb po stymulacji przez lipopolisacharydy ściany komórkowej bakterii. W komórkach niepobudzonych kompleks NFkb łączy się z inhibitorem. Aktywne bodźce przez lipopolisacharydy i TNF-α indukują fosforylację, prowadząc do proteolitycznego rozkładu inhibitora NFkb. Uwolniony kompleks ulega przemieszczeniu do jądra komórkowego, gdzie inicjuje transkrypcję genów prozapalnych. Mutacja genu NOD2/CARD15, której skutkiem jest obniżenie aktywacji NFkb w monocytach, makrofagach lub komórkach dendrytycznych (po ekspozycji na produkty bakteryjne) może powodować napływ różnych cytokin prozapalnych i innych czynników zaburzających homeostazę mikrośrodowiska jelitowego [18–20]. Regulacja odpowiedzi immunologicznej na antygeny jelitowe pozwala zrozumieć patogenezę choroby Leśniowskiego-Crohna. Głównym mechanizmem patogenetycznym w tym przypadku jest odpowiedź immunologiczna komórek Th1 uwalniających duże liczby interferonów IFN-g i TNF-α. Stężenie cytokin, które powodują różnicowanie komórek Th do Th1, głównie IL-12 i IL-18, jest znacznie podwyższone w błonie śluzowej osób z chorobą Leśniowskiego-Crohna. Komórki T w prawidłowej blaszce właściwej błony śluzowej jelita pochodzą z kępek Peyera i ulegają apoptozie. W chorobie Leśniowskiego-Crohna są one odporne na apoptozę, akumulują się i są przyczyną zapalenia oraz uszkodzenia tkanek. Błona śluzowa jelita pacjentów z chorobą Leśniowskiego-Crohna zawiera małą liczbę cytokin zapobiegających apoptozie IL-2, IL-6, IL-12, IL-15, IL-18 [21–23]. W badaniu autorzy nie stwierdzili różnic w zakresie stężenia TNF-α w zależności od obecności poszczególnych mutacji genu NOD2/CARD15. Halme i wsp. wykazali natomiast związek mutacji L1007fs z małym wydzielaniem cząstek TNF w monocytach krwi obwodowej pacjentów z chorobą Leśniowskiego-Crohna [24]. Wydaje się, że konieczne są dalsze badania związku mutacji genu NOD2/CARD15 z wydzialaniem TNF-α u chorych z nieswoistymi zapaleniami jelit.
Wnioski
Wykazano wyższe stężenie TNF-α u dzieci z chorobą Leśniowskiego-Crohna. Nie stwierdzono jednak związku z występowaniem objawów klinicznych oraz mutacją genu NOD2/CARD15 u badanych dzieci. Praca została sfinansowana z projektu badawczego Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego nr 0881/PO5/2005/29.
Piśmiennictwo
1. Jędrzejczak WW. Komórki, cytokiny, receptory i choroby. W: Cytokiny. Zastosowanie kliniczne. Jędrzejczak WW, Podolak-Dawidziak M (red). Volumed, Wrocław 1997; 33-51. 2. Robak T. Biologia i farmakologia cytokin. Wydawnictwo Naukowe PWN, Waszawa-Łódź 1995. 3. Hale KK, Smith CG, Baker SL i wsp. Mutlifunctional regulation of the biological effects of TNF-αlpha by the soluble type and type II TNF receptors. Cytokine 1995; 7: 26-38. 4. Bischoff SC, Lorentz A, Schwengberg S i wsp. Mast cells an important cellular source of tumour necrosis factor alpha in human intestinal tissue. Gut 1999; 44: 643-52. 5. Wershil BK. Immune mediators and cytokines in gastrointrestinal inflammation. Curr Opin Gastroenterol 1992; 8: 975-82. 6. Rabinovici R, Renz J, Esser KM i wsp. Serum tumor necrosis factor-alpha profile in trauma patients. J Trauma 1993; 35: 698-702. 7. Gogos CA, Drosou E, Bassaris HP, Skoutelis A. Pro-versus anti-inflammatory cytokine profile in patients with severe sepsis a marker for prognosis and future therapeutic options. J Infect Dis 2000; 181: 176-80. 8. MacLindon ME, Mahida. Pro-inflammatory cytokines in inflammatory bowel disease. Aliment Pharmacol Ther 1996; 10: 72-4. 9. Yuan Q, Walker WA. Innate immunity of the gut: mucosal defense in health and disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2004; 38: 463-73. 10. Shanahan F. Crohn`s disease. Lancet 2002; 359: 62-9. 11. Olson AD, Ayass M, Chensue S. Tumor necrosis factor and IL-1beta expression in pediatric patients with inflammatory bowel disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr 1993; 16: 241-6. 12. MacDonald TT, Hutchings P, Choy MY i wsp. Tumor necrosis factor-alpfa and interferon-gamma production measured at the single cell level in normal and inflamed human intestine. Clin Exp Immunol 1990; 81: 301-5. 13. Ballinger AB, Camacho-Hübner C, Croft NM. Growth failure and intestinal inflammation. Q J Med 2001; 94: 121-5. 14. Wong SC, Macrae VE, McGrogan P, Ahmed SF. The role of pro-inflammatory cytokines in inflammatory bowel disease growth retardation. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2006; 43: 144-55. 15. Resta-Lenert S, Barrett KE. Probiotics and commensals reverse TNF-αlfa and IFN-gamma induced dysfunction in human intestinal epithelial cells. Gastroenterology 2006; 130: 731-46. 16. Murch SH, Lamkin VA, Savage MO i wsp. Serum concentrations of tumor necrosis factor alfa in childhood chronic inflammatory bowel disease. Gut 1991; 32: 913-7. 17. Hyams JS, Treem WR, Eddy E i wsp. Tumor necrosis factor – alfa not elevated in children with inflammatory bowel disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr 1991; 12: 233-6. 18. Chamaillard M, Philpott D, Girardin SE i wsp. Gene-environment interaction modulated by allelic heterogeneity in inflammatory disease. PNAS 2003; 100: 3455-60. 19. Inohara N, Nunez G. The NOD: a signaling module that regulates apoptosis and host defense against pathogens. Oncogene 2001; 20: 6473-81. 20. Gutierrez O, Pipaon C, Inohara N i wsp. Induction of Nod2 in myelomonocytic and intestinal epithelial cells via nuclear factor-kB activation. J Biol Chem 2002; 277: 41701-5. 21. MacDonald TT, Path FR, DiSabatino A i wsp. Immunopathogenesis of Crohn’s disease. J Parent Enter Nutr 2005; 29: 118-25. 22. Blumberg RS, Saubermann LJ, Strober W. Animal models of mucosal inflammation and their relation to human inflammatory bowel disease. Curr Opin Immunol 1999; 11: 648-56. 23. MacDonald TT, Monteleone G, Pender SL. Recent developments in the immunology of inflammatory bowel disease. Scand J Immunol 2000; 51: 2-9. 24. Halme L, Turumen U, Paavola-Sakki P i wsp. CARD15 frameshift mutation in patietns with Crohn disease is associated with immune dysregulation. Scand J Gastroenterol 2004; 12: 1243-9.