On the use of bilogical parameters in prediction of response to high dose chemotherapy in breast, ovarian and small cell lung cancers

Standardowe postępowanie onkologiczne opiera się na określeniu stadium choroby w czasie rozpoznania. Stadium jest pochodną klasyfikacji TNM [1], która opiera się na badaniach obrazowych (uwidoczniających guz pierwotny i guzy przerzutowe) oraz częściowo inwazyjnych (np. określenie obecności zmian przerzutowych w rozwidleniu tchawicy). Uzupełniające badanie biopsyjne pozwala na ustalenie utkania guza. Pochodną danych opisanych w układzie TNM jest stadium guza. W raku jajnika powszechną klasyfikacją jest podział guzów zaproponowany przez Międzynarodową Federację Ginekologów i Położników (FIGO) [2]. Nie ulega wątpliwości, że umiejscowienie i rozprzestrzenienie guza stanowi kardynalny wskaźnik leczniczy i rokowniczy. Doktryna maksymalnej cytoredukcji prowadzi do wykorzystania wszystkich dostępnych sposobów postępowania onkologicznego, począwszy od chirurgii przez chemioterapię i napromieniowanie do immunoterapii. Rozwój onkologii, który dotyczy nie tylko optymalizacji chemioterapii, ale również leczenia osłonowego (postępowanie przeciwwymiotne, profilaktyka mikrobiologiczna, czynniki wzrostowe) prowadzi do szerszego stosowania chemioterapii również jako postępowania przygotowującego do zabiegu operacyjnego. Guzy względnie operacyjne stają się operacyjnymi przy zadowalającej odpowiedzi na przedoperacyjną chemioterapię. Neoadjuwantowa chemioterapia może być pomocna tylko w przypadkach chemiowrażliwych guzów. Na podstawie doświadczenia można określić guzy mniej i bardziej wrażliwe. Rak drobnokomórkowy płuc jest chemiowrażliwy, rak płaskonabłonkowy ma wyraźnie mniejszą chemiowrażliwość. Odnośnie samego raka drobnokomórkowego istnieje zróżnicowanie chemiowrażliwości, a w grupie nowotworów wywodzących się z utkania neuroendokrynnego występują rakowiaki mniej lub bardziej chemiowrażliwe. Odnośnie raka gruczołu piersiowego czy raka jajnika sytuacja jest bardziej złożona i nie można w sposób prosty przełożyć rozpoznania histopatologicznego na ocenę wrażliwości guza. Onkolog podejmując decyzję leczniczą, powinien skorzystać ze współczesnych metod diagnostycznych, które pozwolą na określenie czynników ryzyka przebiegu choroby i wrażliwości na chemio/radioterapię.

Do dyspozycji pozostają 4 podstawowe elementy diagnostyczne:

∙ ocena wskaźnika proliferacji,

∙ ocena stabilności genetycznej,

∙ ocena podatności na apoptozę,

∙ ocena układu czynników wzrostowych o charakterze para- lub autokrynnym.



Elementy te tworzą konstelację, która ma decydujący wpływ na zachowanie się guza i jego chemiowrażliwość.



WSKAŹNIK PROLIFERACJI


Tradycyjnie stopień złośliwości guza podaje się w klasyfikacji od G0 do G3. Klasyfikacja ta opiera się na cytologicznej i architektonicznej ocenie zróżnicowania komórki oraz na liczbie mitoz. Wykazano, że określona liczba mitoz na standardowy skrawek guza jest wykładnikiem leczniczo-prognostycznym w nowotworach neuroendokrynnych. W raku drobnokomórkowym płuc (doskonale odpowiada on na chemioterapię) wykazano istnienie zależności pomiędzy odsetkiem komórek, które weszły do cyklu wzrostowego a odpowiedzią oraz przeżyciem po wysokodawkowanej chemioterapii wspomaganej przeszczepem komórek hematopoetycznych.



Wygodną metodą oceny proporcji komórek będących w cyklu wzrostowym jest barwienie na obecność antygenu Ki67. Wykorzystuje się barwienie immunohistochemiczne. W ostatnich latach wyprodukowano przeciwciała, które umożliwiają barwienie skrawków pochodzących z bloków utrwalonych w formalinie. Można więc wykorzystać ten sam blok tkankowy do rutynowej i immunohistochemicznej analizy guza. W badanym materiale pacjenci, których guzy miały poniżej 20 proc. komórek Ki67 dodatnich, odpowiadali gorzej i przeżycie ich było krótsze w porównaniu do chorych z guzami o wyższym odsetku komórek Ki67+. Barwienie węzłów chłonnych przeciwciałem przeciwko Ki67 uwidacznia prawidłowe Ki67 dodatnie komórki centrów rozmnażania i naciek komórek nowotworowych posiadających na powierzchni antygen Ki67 (fot. 1.).



Naciek może mieć zidentyfikowany nowotworowy charakter z wykorzystaniem równoległego barwienia na obecność neuronowo-specyficznej enolazy (nowotwory neuroendokrynne) lub cytokeratyny (rak gruczołu piersiowego i rak jajnika).



Wysoki odsetek komórek Ki67 w utkaniu raka gruczołu piersiowego może zachęcić do zastosowania wysokodawkowanej chemioterapii. Barwienie w węzłach chłonnych ze zmianami przerzutowymi w raku sutka wyróżnia komórki nowotworowe i oddaje zarazem ich potencjał proliferacyjny (fot. 1.). W raku jajnika wykazano relacje pomiędzy utkaniem histochemicznym a potencjałem proliferacyjnym, ocenionym tym barwieniem. Guzy niezróżnicowane charakteryzują się wyższym odsetkiem komórek Ki67+ niż inne typy histologiczne tego raka [3]. W raku jajnika wykazano zależność pomiędzy dawką chemioterapii a odpowiedzią na leczenie [4, 5]. Stworzyło to racjonalne przesłanki do wykorzystania wysokodawkowanej chemioterapii w tym nowotworze. Stosowany schemat tandemowej wysokodawkowanej chemioterapii ma wyraźny potencjał cytoredukcyjny. Współcześnie badany program wysokodawkowanej chemioterapii (OVCAT) bazuje na wykazanej relacji pomiędzy dawką a odpowiedzią na leczenie. Stwierdzono istnienie związku pomiędzy odsetkiem komórek Ki67 a odpowiedzią na leczenie w raku jajnika, ale zależność ta ma charakter trendu, a nie statystycznie udokumentowanej relacji [6]. Należy wziąć pod uwagę istnienie kolejnego z wymienionych powyżej elementów opisujących guz, a mianowicie wykładnika stabilności genomu



WYKŁADNIK STABILNOŚCI GENOMU


Wygodnym i praktycznym sposobem oceny tej stabilności jest barwienie na obecność białka p53. W normalnych warunkach białko p53 związane jest z inhibitorem, który hamuje jego oddziaływanie z DNA. W czasie podziału komórki dochodzi do fosforylacji seryn w białku p53, co z kolei prowadzi do zmian konformacyjnych uniemożliwiających wiązanie białka p53 do inhibitora. Dochodzi do aktywacji p53. Mutacja w obrębie genu kodującego p53 wiąże się z jądrową (rzadziej cytoplazmatyczną) akumulacją tego białka. Z pewnym przybliżeniem można przyjąć, że wykazana immunohistochemicznie akumulacja białka p53 w komórkach nowotworowych jest wynikiem utraty funkcji białka w następstwie mutacji. Biochemiczne i farmakologiczne analizy pozwoliły na ustalenie udziału białka p53 w indukcji apoptozy, wstrzymaniu podziału komórki i umożliwieniu uruchomienia systemów naprawy DNA. Stąd następstwem utraty funkcji przez białko p53 jest mniejsza stabilność genetyczna komórki (częstsze mutacje), co ułatwia komórce z upośledzonym p53 uzyskanie chemiooporności. W badaniach własnych stwierdza się często dodatnią korelację pomiędzy odsetkiem komórek Ki67+ a p53+. Zależność ta jest wynikiem zarówno utraty przez zmutowane p53 funkcji hamowania proliferacji, jak i faktu, że dzielące się komórki częściej mutują, przez co łatwiej nabywają defekt w genie kodującym p53. Wadliwe genetycznie p53 może stracić swoje właściwości pchnięcia komórki z uszkodzonym genomem do apoptozy. Dlatego komórki z uszkodzonym genem supresorowym p53 mogą przeżyć pomimo uszkodzenia DNA przez chemioterapię, więc relacje pomiędzy wskaźnikiem proliferacji a odpowiedzią na leczenie nie zawsze są czytelne. Wśród komórek Ki67+, które są p53+, może znajdować się wiele chemioopornych.



Kandydatem na guza chemiowrażliwego są nowotwory o wysokim odsetku komórek Ki67+, a p53-. Pacjentki z zaawansowanym rakiem jajnika, które mają wysoką akumulację p53 charakteryzują się krótszym przeżyciem w porównaniu z chorymi bez akumulacji tego białka przy zastosowaniu tej samej standardowej chemioterapii pooperacyjnej [6]. Chore z zaawansowanym rakiem jajnika, z wysokim Ki67 i p53 raczej źle odpowiadają na chemioterapię. Białko supresorowe (p53) decyduje o apoptozie komórek z uszkodzonym genomem. W komórkach ustrojowych znajdują się białka, które czynią je opornymi na apoptozę. Zabezpieczają one przeżycie komórek pamięci immunologicznej, reprezentuje je białko bcl-2. Komórka nowotworowa może również skorzystać z tego systemu zabezpieczenia przed apoptozą (przewaga przeżycia komórek chłoniaków produkujących to białko). W raku jajnika stwierdza się ekspresję genu bcl-2, która jest ujemnie skorelowana z ekspresją genu Ki67. Jest to sytuacja nowotworowa, w której (podobnie jak w chłoniakach) ekspansja guza zależy bądź od potencjału proliferacyjnego, bądź od oporności na apoptozę. Własne obserwacje raka jajnika [7] potwierdzają z pracę Gorczycy i wsp. [8], którzy wykazali ujemną korelację pomiędzy immunohistochemicznie określoną obecnością białek p53 i bcl-2 i ujemną korelacją pomiędzy bcl-2 i Ki67 w raku gruczołu piersiowego. Mamy więc do dyspozycji panel barwień immunohistochemicznych, który przybliża biologię nowotworu odnośnie proliferacji, stabilności genomu i podatności na apoptozę.



Guz rośnie i tworzy przerzuty w określonej sytuacji tkankowej. Do ekspansji guza potrzebne są sygnały aktywujące wewnątrzkomórkowe układy zależne od kinazy tyrozynowej. Enzym ten jest zwornikiem szeregu dróg przekazywania sygnałów proliferacyjnych [9].



CZYNNIKI WZROSTOWE


W interakcji pomiędzy czynnikiem wzrostowym a komórką istotny jest:

∙ poziom czynnika wzrostowego,

∙ receptor dla tego czynnika,

∙ przewodzenie sygnału do komórki.



Czynniki wzrostowe mogą być produkowane przez komórkę nowotworową (autokrynne) lub przez komórki zasiedlające środowisko guza (parakrynne). Komórki raka jajnika produkują IL-6 [3]. Sprawą nadal otwartą jest, czy interleukina jest czynnikiem wzrostowym raka jajnika i jaka jest relacja pomiędzy potencjałem produkcji tej cytokiny, a przeżyciem. Na razie IL-6 i jej białko odczytowe CRP mogą służyć jako element diagnostyczny w przypadkach raka jajnika.



Receptor dla EGF odgrywa niewątpliwie rolę w ekspansji raka gruczołu piersiowego. Fizjologicznie na powierzchni komórki znajduje się rodzina receptorów HER o zróżnicowanym powinowactwie do EGF lub mniej poznanych innych ligandów. Interesujący i ważny klinicznie w raku gruczołu piersiowego jest receptor HER2/neu. Nie ma on swojego dobrze określonego ligandu, natomiast pełni rolę koreceptora dla ligandów reagujących (HER1, HER3), wzmacniając przekazywanie sygnału. W raku gruczołu piersiowego mamy do czynienia z wariantem charakteryzującym się nadprodukcją Her2/neu. Jest to często związane z multiplikacją genu kodującego ten receptor. Następstwem nadprodukcji białka HER2 jest jego czytelna obecność w barwieniu immunohistochemicznym (fot. 3.). Chorych z rakiem gruczołu piersiowego można podzielić na HER2+ i HER2-. Okazało się, że ma to znaczenie w rokowaniu przebiegu choroby. Pacjenci HER2+ mają gorzej odpowiadać na standardową chemioterapię, natomiast dobrze odpowiadają na antracykliny [10]. Ogólnie rzecz biorąc, raki HER2 charakteryzują się gorszym przebiegiem. HER2/neu jako koreceptor dla receptorów czynników wzrostowych ułatwia przekazywanie sygnałów. Wdrożenie do kliniki człowieka leku blokującego receptor, wyrównuje szanse chorych z nadprodukcją HER2/neu przy zastosowaniu odpowiedniego leczenia. Zwykle kojarzy się lek blokujący HER2/neu ze standardowo stosowanymi preparatami, do których również należą paclitaxel i karboplatyna [11, 12].

W skład środowiska guza wchodzą komórki zapalne i immunologicznie kompetentne. Ich obecność może być wspomagana przez produkowane przez guz cytokiny (np. IL-6) lub cytokiny produkowane przez komórki podścieliska. Efektem tego jest obecność limfocytów, które jak się okazało, nie są gromadzone w sposób przypadkowy, a charakteryzują się określonym fenotypem (np. komórki pamięci immunologicznej CD45RO z markerami aktywacji HLA-DR i CD28) lub repertuarze receptora TCRβ. Komórki te, zasiedlając guz, mogą pełnić funkcję nadzoru antynowotworowego. Aktywacja układu odpornościowego może mieć swoje miejsce przy zastosowaniu przeszczepów allogenicznych komórek hematopoetycznych w guzach litych (np. rak gruczołu piersiowego). Po przeszczepie allogenicznym, który warunkuje chemioterapia i immunosupresja, pojawiają się klony o aktywności przeciwko biorcy, a wśród nich o aktywności przeciwko komórkom spełniającym kryteria komórki nowotworowej. W materiale własnym pacjenci, którzy cieszyli się wieloletnim przeżyciem po wysokodawkowanej chemioterapii w raku drobnokomórkowym płuc, mieli profil fenotypowy limfocytów krwi obwodowej jak po allogenicznym przeszczepie szpiku. Obserwacje te otwierają nowe pole działania, w którym wysokodawkowa chemioterapia wspomagana jest indukcją reakcji o charakterze przeciwnowotworowego nadzoru immunologicznego.

Podsumowując przedstawione powyżej dane w oparciu o badania własne (rak jajnika) oraz badania Menard S. i wsp. [13] (rak gruczołu piersiowego), na podstawie wykazanych analogii można wydzielić 2 odrębne ramy fenotypowe tych guzów (tab. 1., tab. 2.).



Przeprowadzone przez Menard S. i wsp. badania wykazały, że chorych z guzami o fenotypie 1 cechuje większa agresywność procesu nowotworowego. Wyraża się to dużą częstością wczesnych wznów przy niskim ryzyku późnej wznowy, w odróżnieniu od chorych z fenotypem 2, u których wykazano większą częstość późnych wznów choroby.



W fazie analizy klinicznej istnieją 2 możliwości rozwojowe:

∙ stosowanie powtarzanej wysokodawkowanej chemioterapii – potrójna HD chemioterapia [14, 15],

∙ chemioterapia (standardowa lub wysokodawkowana) wspomagana immunoterapią (Herceptyna – rak sutka; przeciwciało anty CD20 – chłoniaki B o niskim stopniu złośliwości).

Wykorzystanie ww. elementów opisu biologii guza powinno stanowić przesłankę racjonalizującą wybór sposobu leczenia i ocenę jego efektywności.


PIŚMIENNICTWO

1. Spiessl B, Beahrs O, Hermanek P i wsp. (red.). Atlas TNM. Sanmedica, Warszawa 1994.

2. Shepherd JH. Revised FIGO staging for gynaecological cancer. Brit J Obstet Gynaecol 1989; 96: 889-92.

3. Kryczek I, Gryboś M, Karabon L, Klimczak A, Lange A. IL-6 production in ovarian carcinoma is associated with histiotype and biological characteristics of the tumour and influences local immunity. Br J Cancer 2000; 82 (3): 621-8.

4. Lange A. Chemioterapia dużymi dawkami, wspomagana przeszczepem komórek macierzystych układu krwiotwórczego w zaawansowanej postaci raka jajnika. W: Rak jajnika. J. Markowska (red). Springer PWN, Warszawa 1997: 129-37.

5. Lange A. Chemioterapia wysokimi dawkami z przeszczepianiem komórek hematopoetycznych w leczeniu nowotworów litych. W: Chemioterapia onkologiczna dorosłych i dzieci. G. Madej (red). PZWL, Warszawa 1999; rozdz. 14, 289-97.

6. Gryboś M. Opis właściwości raka jajnika w odniesieniu do efektywności chemioterapii i relacji guz – układ odpornościowy (rozprawa habilitacyjna). Akademia Medyczna we Wrocławiu, Wrocław 1997.

7. Kryczek I. Relacja pomiędzy ekspresją proto-onkogenów (bcl-2, erbb2) a poziomem konstytutywnie produkowanej przez komórki raka jajnika IL-6 w odniesieniu do aktywności proliferacyjnej guza. (rozprawa doktorska). Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN, Wrocław 2000.

8. Gorczyca W, Markiewski M, Kram A, Tuziak T, Domagała W. Immunohistochemical analysis of bcl-2 and p53 expression in breast carcinomas: their correlation with Ki-67 growth fraction. Virchows Arch 1995; 426 (3) 229-33.

9. Cobleigh MA, Vogel CL, Tripathy D, Robert NJ, Scholl S, Fehrenbacher L, Wolter JM, Paton V, Shak S, Lieberman G, Slamon DJ Bishop J. Molecular themes in oncogenesis. Cell 1991; 64: 235.

10. Allred DC, Clark GM, Tandon AK, Molina R, Tormey DC, Osborne CK, Gilchrist KW, Mansour EG, Abeloff M, Eudey L, et al. HER-2/neu in node-negative breast cancer: prognostic significance of overexpression influenced by the presence of in situ carcinoma. J Clin Oncol 1992; Apr 10 (4): 599-605.

11. Multinational study of the efficacy and safety of humanized anti-HER2 monoclonal antibody in women who have HER2-overexpressing metastatic breast cancer that has progressed after chemotherapy for metastatic disease. J Clin Oncol 1999; Sep 17 (9): 2639-48.

12. Pegram MD, Lipton A, Hayes DF, Weber BL, Baselga JM, Tripathy D, Baly D, Baughman SA, Twaddell T, Glaspy JA, Slamon DJ. Phase II study of receptor-enhanced chemosensitivity using recombinant humanized anti-p185HER2/neu monoclonal antibody plus cisplatin in patients with HER2/neu-overexpressing metastatic breast cancer refractory to chemotherapy treatment. J Clin Oncol 1998; Aug 16 (8): 2659-71.

13. Ménard S, Casalini P, Tomasic G, et al. Pathobiologic identification of two distinct breast carcinoma subsets with diverging clinical behaviors. Breast Cancer Res Treat 1999; May 55 (2): 169-77.

14. Leyvraz S, Perey L, Rosti G, Lange A, Pampallona S, Humblet Y, Bosquee L, Pasini F, Marangolo M. Multiple courses of high-dose Ifosfamide, Carboplatin and Etoposide with peripheral blood progenitor cells and filgrastim for small cell lung cancer: a feasibility study from the European Group for Blood and Marrow Transplantation. J Clin Oncology, November 1999; 3531.

15. Lange A, Kołodziej J, Tomeczko J, Toporski J, Sędzimirska M, Jaźwiec B, Bocheńska J, Mróz E, Bielecka E, Wąs A, Glejzer O, Tomaszewska-Toporska B, Jagas A, Żukowska B, Spaltenstein A, Bieranowska D, Klimczak A. Aggressive chemotherapy with autologous bone marrow transplantation in small cell lung carcinoma. Arch Immunol Ther Exp 1991; 39: 431-39.



ADRES DO KORESPONDENCJI

prof. dr hab. n. med. Andrzej Lange

Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej

Polskiej Akademii Nauk

ul. Rudolfa Weigla 12

53-114 Wrocław

tel. (071) 373 22 74 w. 236

fax (071) 373 25 87

e-mail: lange@immuno.iitd.pan.wroc.pl