Original article
Low oxygen tension promotes redifferentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes in vitro

Wstęp
Tkanka chrzęstna jest tkanką łączną pełniącą istotne funkcje mechaniczne. Aby wypełniać te funkcje, chrząstka ma wiele unikalnych właściwości – jest twarda, ale elastyczna i wytrzymała [1]. W obrębie stawu tworzy idealnie gładkie powierzchnie, które z niewielką ilością płynu stawowego mogą się przesuwać względem siebie bez uszkodzenia. Dzięki temu może funkcjonować w warunkach dużych obciążeń. W skład chrząstki wchodzą chondrocyty i syntetyzowana przez nie macierz zewnątrzkomórkowa. Ekspresja białek macierzy zewnątrzkomórkowej jest regulowana przez wiele czynników wzrostu, jak również przez czynniki mechaniczne. Związkami, które zapewniają unikalne właściwości chrząstki, są kolageny, proteoglikany i białka niekolagenowe. Spośród kolagenów najistotniejszy jest kolagen typu II [2]. Typ II kolagenu jest głównym białkowym składnikiem chrząstki. Jest syntetyzowany jako cząsteczka prokolagenu składająca się z 3 identycznych łańcuchów a. Istnieją 2 izoformy mRNA kodującego kolagen II. Różnią się obecnością jednego eksonu. Dodatkowy ekson, obecny w mRNA kodującym kolagen typu IIA, jest odpowiedzialny za syntezę domeny, która przypuszczalnie może wiązać czynniki wzrostu. Ten typ kolagenu jest syntetyzowany przez komórki ulegające procesowi chondrogenezy. Istnieją doniesienia świadczące o tym, ze forma IIA ulega ponownej ekspresji w trakcie degradacji chrząstki w przebiegu zwyrodnienia stawów [3]. Dojrzałe chondrocyty wykazują ekspresję kolagenu typu IIB [4]. Włókna kolagenowe są odporne na rozciąganie. Bardzo istotną rolę w utrzymaniu odpowiednich właściwości mechanicznych chrząstki pełnią proteoglikany, które nadają sprężystość tej tkance dzięki zdolności wiązania wody. Głównym proteoglikanem chrząstki jest agrekan. Nieodwracalna degradacja chrząstki stawowej obserwowana w przebiegu wielu chorób reumatycznych jest jedną z najistotniejszych przyczyn prowadzących do zniszczenia stawu. Na tym etapie jedynym rozwiązaniem umożliwiającym funkcjonowanie stawu jest wstawienie endoprotezy. Mimo że techniki endoprotezoplastyki są ciągle ulepszane, trwają poszukiwania innych możliwości odbudowy struktury chrząstki. Wśród nich bardzo dużo uwagi poświęcono próbom regeneracji chrząstki z użyciem autologicznych chondrocytów, które po namnożeniu in vitro i osadzeniu w biodegradowalnym nośniku (rusztowaniu) można byłoby wszczepić do uszkodzonych stawów [5]. Jednym z problemów takiej strategii jest fakt, że chondrocyty hodowane w standardowych warunkach in vitro (jedna warstwa komórek, 37^oC, 5% CO₂ i 21% O₂) ulegają odróżnicowaniu: przestają produkować kolagen typu II, a zaczynają produkować kolagen typu I [6]. Tkanka wytworzona z tak odróżnicowanych komórek, które zachowują się jak fibroblasty, może znacznie odbiegać swoimi właściwościami od funkcjonalnej, zdrowej chrząstki stawowej. W tej sytuacji istnieje potrzeba opracowania takich warunków hodowli chondrocytów in vitro, które umożliwią ich namnożenie z zachowaniem cech charakterystycznych dla dojrzałych, zróżnicowanych chondrocytów.

Materiał i metody
Chrząstka stawowa była pobierana od pacjentów (n=5) chorujących na reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) w trakcie operacji wstawienia endoprotezy stawu kolanowego. Chondrocyty były izolowane z chrząstki podczas trawienia enzymatycznego z udziałem kolagenazy, hialuronidazy i trypsyny wg standardowych metod i hodowane in vitro. W trakcie pierwszego pasażu komórki były hodowane w podłożu zawierającym DMEM, 4 500 mg/l glukozy, 5% surowicy wołowej, antybiotyki (penicylinę, streptomycynę i amfoterycynę), w atmosferze zawierającej 5% CO₂ i 21% O₂. Podczas drugiego pasażu komórki były hodowane (w takim samym podłożu) w środowisku: 5% CO₂ i 21% O₂ lub 5% CO₂ i 5% O₂. Komórki hodowane w atmosferze o obniżonej zawartości tlenu były także poddawane cyklicznym zmianom ciśnienia atmosferycznego (30 min 1 atm, 30 min 2 atm). Po upływie 7 dni komórki były trypsynizowane, zbierane, liczone, a ich żywotność była sprawdzana przy użyciu błękitu trypanu. Całkowite RNA było izolowane z użyciem trizolu. Ekspresja genów kodujących GAPDH, agrekan, kolagen IIA, kolagen IIB i kolagen I była oceniana przy użyciu półilościowej metody RT-PCR. Ekspresja genu kodującego białko uczestniczące w podtrzymywaniu podstawowych funkcji komórek (house keeping gene) GAPDH stanowiła kontrolę ilości izolowanego RNA i podstawę do obliczania relatywnej ekspresji badanych genów. Analiza statystyczna była wykonana za pomocą testu t-Studenta. Wartości p<0,05 uznawano za istotne statystycznie.
Wyniki
Bez względu na zastosowane warunki hodowli komórki wykazywały 90–95% żywotność, ich morfologia nie ulegała zmianom, a szybkości proliferacji była porównywalna (ryc. 1.). Chondrocyty hodowane w warunkach obniżonego stężenia tlenu (5%) wykazywały niższą ekspresję syntezy mRNA dla kolagenu I (p<0,05) (ryc. 2.), co sugeruje ponowne różnicowanie się tych komórek w kierunku dojrzałych, funkcjonalnych chondrocytów. Dodatkowa mechaniczna stymulacja, z zastosowaniem cyklicznie zmieniającego się ciśnienia atmosferycznego w granicach 1–2 atm, powodowała powrót ekspresji kolagenu I do stanu obserwowanego dla normalnego stężenia tlenu (21%), charakterystycznego dla odróżnicowanych chondrocytów (ryc. 2.). Ekspresja mRNA dla kolagenu IIA zwiększała się podczas hodowli chondrocytów w 5% O₂ (p<0,04) w kierunku bardziej zróżnicowanych chondrocytów, natomiast w komórkach hodowanych w 5% tlenie oraz dodatkowo w warunkach zmiennego ciśnienia obserwowano obniżenie produkcji mRNA dla kolagenu IIA (p<0,05) (ryc. 3.). Wpływ zmiennego ciśnienia wywierał więc negatywne działanie na chondrocyty hodowane w warunkach niskiego tlenu. Ekspresja kolagenu IIB zwiększała się w środowisku zawierającym 5% tlenu (p=0,05) (ryc. 4.). Dodatkowa stymulacja w warunkach zmiennego ciśnienia atmosferycznego nie doprowadzała do istotnych zmian produkcji kolagenu IIB. Zaobserwowano również tendencję do podwyższenia ekspresji mRNA dla agrekanu przez chondrocyty hodowane w warunkach niskiego stężenia tlenu, choć bez osiągnięcia istotności statystycznej (p<0,1). W tym przypadku nie obserwowano dodatkowego wpływu mechanicznej stymulacji (ryc. 5.).
Dyskusja
Przedstawione badania stanowią część prowadzonych prób określenia takich warunków hodowli in vitro chondrocytów, które zapewniłyby proliferację tych komórek z jednoczesnym zachowaniem produkcji charakterystycznych dla nich białek tworzących macierz zewnątrzkomórkową. Chrząstka jest tkanką pozbawioną naczyń krwionośnych. Gradient stężenia tlenu waha się od 10% (na powierzchni chrząstki) do 1% (w głębszych warstwach chrząstki) [7]. W związku z tym faktem komórki chrząstki, chondrocyty, przystosowały się do funkcjonowania w warunkach hipoksji. Szczególnie istotna jest rola czynnika transkrypcyjnego HIF-1α. Odgrywa on kluczową rolę w modyfikowaniu ekspresji genów w warunkach obniżonego stężenia tlenu. W chondrocytach odpowiada za regulację ekspresji genów związanych z procesem glikolizy i produkcji białek macierzy zewnątrzkomórkowej [8]. Próby hodowli chondrocytów w standardowych warunkach tlenu (21%) prowadzą do ich wcześniejszego starzenia, zmiany ekspresji genów, a co za tym idzie – utraty funkcji [9]. W licznych pracach przeprowadzonych na chondrocytach wyizolowanych z chrząstek zwierzęcych pokazano, że komórki te hodowane w warunkach obniżonego stężenia tlenu ponownie się różnicują [7, 10]. Obserwuje się wzrost ekspresji kolagenu II i agrekanu, przy jednoczesnym obniżeniu ekspresji kolagenu I. Podobne wyniki zaobserwowano, badając chondrocyty wyizolowane z ludzkiej chrząstki pobranej z nosa [11] czy stawu kolanowego [12]. Brak jest doniesień opisujących reakcję chondrocytów wyizolowanych z chrząstki stawowej pacjentów chorujących na RZS na obniżone stężenie tlenu. W przebiegu tej choroby chrząstka jest narażona na działanie zwiększonego stężenia cytokin prozapalnych. Udowodniono, że te substancje powodują zahamowanie syntezy białek macierzy zewnątrzkomórkowej przy jednoczesnym nasileniu syntezy enzymów degradujących chrząstkę [13]. Dodatkowo w stawie objętym procesem zapalnym dochodzi do patologicznego obniżenia stężenia tlenu [14]. Dlatego autorzy postanowili zbadać reakcję chondrocytów wyizolowanych z chrząstki stawowej pobranej od pacjentów chorujących na RZS na obniżone stężenie tlenu. Wyniki przedstawione w tej pracy wyraŸnie wskazują, że obniżenie stężenia tlenu podczas hodowli powoduje wzrost ekspresji kolagenu II i agrekanu oraz obniżenie syntezy kolagenu I. Wyniki doświadczeń potwierdziły naszą hipotezę, że hodowle chondrocytów w warunkach in vitro powinno się prowadzić w warunkach obniżonego stężenia tlenu. Mechaniczny stres powoduje obniżenie syntezy białek macierzy zewnątrzkomórkowej charakterystycznych dla chondrocytów, co jest zgodne z obserwacjami innych autorów [9]. Z tych powodów zastosowanie dodatkowych zmian fluktuacji ciśnienia atmosferycznego nie wydaje się wskazane. Na dodatkową uwagę zasługuje fakt, że w hodowanych przez nas chondrocytach występuje kolagen IIA, charakterystyczny dla niedojrzałych komórek chrząstki. Świadczy to o tym, że chondrocyty odróżnicowane podczas hodowli w jednej warstwie (monolayer) nie różnicują się całkowicie pod wpływem obniżenia stężenia tlenu. Nie jest wykluczone, że proces ten wymaga zapewnienia chondrocytom odpowiedniego przestrzennego zorganizowania hodowli w strukturach wielowarstwowych (tzw. hodowla w 3D) [15]. Badania, których celem jest zweryfikowanie tej hipotezy, są obecnie w toku.
Wnioski
Ponowne zróżnicowanie odróżnicowanych chondrocytów pochodzących od pacjentów chorujących na RZS jest częściowo możliwe, jeżeli komórki są hodowane w atmosferze zawierającej 5% O₂. Na tym etapie hodowli dodatkowa mechaniczna stymulacja nie jest konieczna.
Praca naukowa finansowana ze środków Komitetu Badań Naukowych w latach 2003–2005 jako projekt badawczy.
Piśmiennictwo
1. Tallheden T, Bengtsson C, Brantsing C, et al. Proliferation and differentiation potential of chondrocytes from osteoarthritic. Arthritis Res 2005; 7: R560-8. 2. Eyre D. Collagen of articular cartilage. Arthritis Res 2002; 4: 30-5. 3. Gouttenoire J, Valcourt U, Ronziere MC, et al. Modulation of collagen synthesis in normal and osteoarthritic cartilage. Biorheology 2004; 41: 535-42. 4. Nah HD, Pacifici M, Gerstenfeld LC, et al. Transient chondrogenic phase in the intramembranous pathway during normal skeletal development. J Bone Miner Res 2000; 15: 522-33. 5. Meyer U, Buchter A, Wiesmann HP, et al. Current strategies for articular cartilage repair. Eur Cell Mater 2005; 9: 23-32. 6. Goessler UR, Bieback K, Bugert P, et al. Human chondrocytes differentially express matrix modulators during in vitro expansion for tissue engineering. Int J Mol Med 2005; 16: 509-15. 7. Grimshaw MJ, Mason RM. Bovine articular chondrocyte function in vitro depends upon oxygen tension. Osteoarthritis Cartilage 2000; 8: 386-92. 8. Pfander D, Cramer T, Schipani E, et al. HIF-1alpha controls extracellular matrix synthesis by epiphyseal chondrocytes. J Cell Sci 2003; 116: 1819-26. 9. Martin JA, Brown TD, Heiner AD, et al. Chondrocyte senescence, joint loading and osteoarthritis. Clin Orthop Relat Res 2004; (427 Suppl): S96-103. 10. Grimshaw MJ, Mason RM. Modulation of bovine articular chondrocyte gene expression in vitro by oxygen tension. Osteoarthritis Cartilage 2001; 9: 357-64. 11. Malda J, van Blitterswijk CA, van Geffen M, et al. Low oxygen tension stimulates the redifferentiation of dedifferentiated adult human nasal chondrocytes. Osteoarthritis Cartilage 2004; 12: 306-13. 12. Murphy CL, Polak JM. Control of human articular chondrocyte differentiation by reduced oxygen tension. J Cell Physiol 2004; 1999:451-9. 13. Fraser A, Fearon U, Billinghurst RC, et al. Turnover of type II collagen and aggrecan in cartilage matrix at the onset of inflammatory arthritis in humans: relationship to mediators of systemic and local inflammation. Arthritis Rheum 2003; 48: 3085-95. 14. Hitchon CA, El-Gabalawy HS. Oxidation in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 2003; 48: 3085-95. 15. Domm C, Schunke M, Steinhagen J, et al. Influence of various alginate brands on the redifferentiation of dedifferentiated bovine articular chondrocytes in alginate bead culture under high and low oxygen tension. Tissue Eng 2004; 10: 1796-805.