Plasmid expression vector encoding sFLT-1 receptor (psFLT-1) inhibits angiogenesis and L1 tumour growth

Wprowadzenie: angiogeneza i antyangiogenna terapia genowa
Proces powstawania naczyń krwionośnych – angiogeneza – obok nieprzecenionej funkcji fizjologicznej, obserwowanej np. podczas embriogenezy, gojenia ran, cyklu menstruacyjnego, warunkuje przebieg wielu procesów patologicznych, takich jak wzrost nowotworów i powstawanie przerzutów czy chorób o podłożu reumatycznym [1]. Angiogeneza (ryc. 1.) jest krytycznym procesem wpływającym na wzrost nowotworów, np. przyjmuje się, że guzy lite bez sieci powstających naczyń krwionośnych nie są w stanie przekroczyć wielkości kilku mm³ [2]. Proces angiogenezy nowotworów jest wieloetapowy i złożony, jest wypadkową działania czynników pobudzających i hamujących unaczynnienie (tab. 1.). Należy również podkreślić fakt, że angiogenezę warunkują bezpośrednio interakcje między komórkami nowotworowymi a szeroko rozumianym mikrośrodowiskiem okołonowotworowym [2, 3]. Antyangiogenna terapia genowa jest jedną ze strategii terapeutycznych genowej terapii nowotworów. Zakłada się np., że bezpośredni, doguzowy transfer genów kodujących inhibitory angiogenezy zaburza unaczynienie i może ograniczać wzrost nowotworu [4]. Antyangiogenną terapię genową cechuje: uniwersalność – ma wpływ na różnorodne typy nowotworów; brak objawów klasycznej oporności na cytostatyki; brak efektów ubocznych; hamowanie powstawania nowych naczyń krwionośnych; hamowanie funkcji naczyń już istniejących; hamowanie wzrostu nowotworów i tworzenia przerzutów. Przeważająca część terapii antyangiogennej ukierunkowana jest na blokowanie sygnalizacji głównej cytokiny proangiogennej – naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu (VEGF) [4]. VEGF oddziałuje z komórkami za pomocą receptorów VEGFR-1, VEGFR-2 i VEGFR-3 [5]. Receptory VEGFR-1 i VEGFR-2 posiadają wewnętrzną aktywność kinazy tyrozynowej. Gen VEGFR-1 (FLT-1) koduje nie tylko całą, pełną formę receptora FLT-1, ale również jego rozpuszczalną formę – sFLT-1 (ryc. 2.). sFLT-1 po raz pierwszy opisano i sklonowano u człowieka [6], wkrótce jednak okazało się, iż jego obecność stwierdzono u innych ssaków i kręgowców. Wysoki stopień homologii z ludzkim sFLT-1 (ponad 60 proc.) sugeruje, że sFLT-1 jest molekułą filogenetycznie konserwatywną [7, 8]. sFLT-1 powstaje w wyniku swoistego składania pre-mRNA genu FLT-1. Transkrypt sFLT-1 koduje 6 z 7 N-terminalnych, immunoglobulinopodobnych domen, charakterystycznych dla części zewnątrzkomórkowej receptorów VEGF (ryc. 2.). W mRNA sFLT-1 brak jest natomiast sekwencji kodującej fragment międzybłonowy oraz domenę wewnątrzkomórkową o aktywności kinazy tyrozynowej [6]. sFLT-1 wiąże wszystkie izoformy VEGFA, jest kluczowym regulatorem fizjologicznej i patofizjologicznej angiogenezy [6, 9]. Wykazano, iż wiąże on również inne cytokiny, np. PIGF, VEGFB [9]. Rozpuszczalna forma FLT-1, przez wiązanie naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu i blokowanie natywnych receptorów dla VEGF hamuje powstawanie nowych naczyń krwionośnych, ogranicza wzrost masy nowotworów litych i powstawanie przerzutów [6, 10–16]. sFLT-1 może być również wykorzystany w wielu innych stanach chorobowych determinowanych przez angiogenezę, np. w zapobieganiu wystąpieniu ślepoty pojawiającej się jako powikłanie retinopatii cukrzycowej [17–19]. Wśród mechanizmów oddziaływania sFLT-1 z VEGF i hamowania angiogenezy można wymienić: 1) mechanizm podstawowy, czyli wiązanie sFLT-1 z VEGF poza komórką (np. w naczyniach krwionośnych, jamie otrzewnej); powstaje nieaktywny kompleks; aktywność mitogenna VEGF wobec komórek śródbłonka zostaje zniesiona; 2) sFLT może również wiązać się z natywnymi komórkowymi receptorami FLT-1. Wiążąc się z częścią zewnątrzkomórkową FLT-1 (heterodimer) blokuje autofosforylację receptora i tym samym jego funkcję; 3) sFLT-1 może oddziaływać z formami VEGF związanymi z błoną komórkową (np. VEGF189), utrudniając tym samym interakcje między komórkami śródbłonka i komórkami stromalnymi; 4) sFLT-1 jako białko sekrecyjne może przedostawać się do krążenia ogólnego i wpływać na poziom aktywnego VEGF we krwi [9].
W niniejszej pracy wykorzystano niewirusowy wektor ekspresyjny, kodujący rozpuszczalną formę receptora VEGF (psFLT-1). Celem badań były próby ograniczenia angiogenezy i wzrostu guzów L1 u myszy poprzez zastosowanie genowego preparatu antyangiogennego. Praca dotyczy badań związanych z eksperymentalną terapią nowotworów wykorzystującą metody terapii genowej.
Materiał i metody
Wektor psFLT-1, białko sFLT-1
Procedurę klonowania molekularnego wektora psFLT-1 oraz przebieg otrzymywania białka sFLT-1 z stransfekowanych komórek mysiego mięsaka L1 opisano w poprzednich pracach [20, 21]. Gen sFLT-1 amplifikowano metodą PCR na matrycy cDNA uzyskanego z komórek HUVEC, po czym wklonowano do wektora pSEC (Invitrogen) w miejsca EcoRI i XhoI. Uzyskany konstrukt psFLT-1 klonowano w bakteriach E. coli w obecności ampicyliny i izolowano metodą lizy alkalicznej (Endofree Giga kit, Qiagen). Obecność białka sFLT-1 w mediach hodowlanych znad stransfekowanych komórek L1 oceniano metodą Western blot.
Badania na zwierzętach laboratoryjnych
Do badań wykorzystano myszy Balb/c uzyskane w Zakładzie Genetyki i Hodowli Zwierząt Laboratoryjnych Centrum Onkologii-Instytutu w Warszawie. Każde badanie, opisane poniżej, wykonano 3-krotnie na grupie 14–21 myszy.
Test skórnej angiogenezy
Do badań wykorzystano 6–8-tygodniowe samce myszy Balb/c. Zwierzęta usypiano 3,6-proc. roztworem wodzianu chloralu i golono po obu bokach. Następnie wykonano śródskórne iniekcje wektora angiogennego kodującego VEGF165 (pVEGF) [22] (10 mg DNA/0,1 ml 0,9 proc. NaCl). Do iniekcji kontrolnych wykorzystano pusty wektor pSEC oraz 0,9 proc. roztwór NaCl. Œródskórnie podawano również komórki L1 stransfekowane wektorem pVEGF (5x10⁵). Aby ułatwić wizualizację miejsca wstrzyknięcia, preparaty podbarwiano 0,1-proc. roztworem błękitu trypanu. Po 72 godz. zwierzęta uśpiono preparatem Morbital, a miejsca wstrzyknięcia analizowano pod lupą (32x) – liczono nowe naczynia zgodnie z kryteriami zaproponowanymi przez Sidky’ego i Auerbacha [23].
Test angiogenezy matrigelowej
Do badań wykorzystano 6–8-tygodniowe myszy Balb/c (samce) i komórki mysiego mięsaka L1 oraz L1 stransfekowane wektorem pVEGF [22]. Komórki hodowano w pożywce Eagle’a z dodatkiem 10 proc. bydlęcej surowicy i antybiotyków (ampicylina/streptomycyna) w standardowych warunkach. Komórki zawieszano w 0,9 proc. NaCl i mieszano z matrigelem (Becton Dickinson) 1:1. Zwierzęta usypiano 3,6-proc. roztworem wodzianu chloralu, po czym wykonywano podskórne iniekcje mieszaniny matrigelowo-komórkowej do myszy (2 podania, po 6x10⁵ komórek w 0,25 ml mieszaniny). Po 8 dniach myszy usypiano preparatem Morbital, wypreparowywano matrigele, które następnie ważono i rozpuszczano w odczynniku Drabkina (Sigma). Próby inkubowano w 4oC przez 24 godz., okazjonalnie worteksując, odwirowano (5 min, 10 000 rpm, w 4ºC), a następnie mierzono absorbancję przy 540 nm wobec próby odczynnikowej. Z wykonanej wcześniej krzywej kalibracyjnej odczytano zawartość hemoglobiny w badanych próbach. Zawartość hemoglobiny podano w przeliczono na 1 g masy matrigelowej [g/g].
Iniekcja dootrzewnowa komórek nowotworowych
W badaniach wykorzystano 6–8-tygodniowe myszy Balb/c obu płci. Zwierzęta usypiano 3,6-proc. roztworem wodzianu chloralu, a następnie wykonano dootrzewnową (ip) iniekcję komórek nowotworowych linii L1 lub badanych transfektantów zawieszonych w 0,9-proc. roztworze NaCl w ilości 1-5x10⁵. Wielkość powstającego wysięku oznaczano średnio co 3 dni, ważąc ciała zwierząt. Określano średni czas przeżycia zwierząt poddanych badaniom.

Iniekcja podskórna komórek nowotworowych
Do badań wykorzystano 6–8-tygodniowe myszy Balb/c obu płci. Zwierzęta usypiano 3,6-proc. roztworem wodzianu chloralu, a następnie wykonano podskórną iniekcję 1-3x10⁵/mysz komórek nietransfekowanych L1 zawieszonych w 0,9-proc. roztworze NaCl lub komórek L1 stransfekowanych badanymi preparatami genowymi. W części badań, po osiągnięciu przez guz L1 wymiaru 1–3 mm średnicy, zwierzęta otrzymywały doguzowo preparat antyangiogenny psFLT-1 3 razy w tyg. (30 mg pDNA/0,1 ml 0,9 proc. NaCl). Wpływ wektora na wzrost nowotworu oceniano średnio co 3 dni, mierząc wielkość guza za pomocą suwmiarki. Objętość guzów określano według zależności: objętość guza [mm³] = (wymiar mniejszy)² x (wymiar większy) x 0,52.
Statystyczna analiza wyników
Wyniki badań opracowano statystycznie poprzez wyliczenie wartości średnich oraz odchyleń standardowych. Oceny wpływu psFLT-1 na badane procesy dokonano za pomocą analizy wariancji ANOVA, testu Cochran-Coxa oraz t-Studenta dla zmiennych niezależnych. Wartość p<0,01 przyjmowano za znamienną statystycznie. Analizy wpływu preparatów na przeżycie zwierząt dokonano metodą Kaplana-Meiera. Do obliczeń wykorzystano program Statistika 5,0.
Wyniki
W badaniach wykorzystano sklonowany wcześniej [20] wektor ekspresyjny kodujący rozpuszczalną formę receptora VEGF – sFLT-1. Schematyczną mapę wektora przedstawiono na ryc. 3. Konstrukt psFLT-1 jest plazmidowym, niewirusowym wektorem, eksprymującym gen sFLT-1 pod transkrypcyjną kontrolą promotora cmv. Białko sFLT-1 jest efektywnie wydzielane poza transfekowane komórki dzięki obecności immunoglobulinowej sekwencji sekrecyjnej Igk poprzedzającej w kasecie ekspresyjnej gen sFLT-1 (ryc. 3.).
Wpływ psFLT-1 na proces angiogenezy in vivo
Tabela 2. oraz ryc. 4. i 5. przedstawiają wyniki badań oceniających wpływ konstruktu psFLT-1 na proces angiogenezy in vivo. Badania wskazują, że wektor psFLT-1 hamuje angiogenezę indukowaną przez naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostu (transfekcje pVEGF165) zarówno w teście angiogenezy skórnej, jak i matrigelowej. Badania wykazały, że sFLT-1 wywiera efekt systemowy – po domięśniowym wprowadzeniu wektora psFLT-1 obserwowano zahamowanie angiogenezy skórnej i matrigelowej.


Wpływ wektora psFLT-1 na wzrost guzów
nowotworowych L1
W pracy wykonano wiele badań oceniających wpływ wektora psFLT-1 na wzrost guzów L1 (podskórnych i otrzewnowych) i czas przeżycia zwierząt. Do badań wykorzystano zarówno preparat psFLT-1, jak i komórki L1 stransfekowane psFLT-1, wydzielające białko sFLT-1, co potwierdzono we wcześniejszych pracach [20, 21]. Wyniki doświadczeń przedstawiono na ryc. 6.–10. Badania wskazują, że guzy wywodzące się ze stransfekowanych psFLT-1 komórek L1 charakteryzują się, znamiennie statystycznie, ograniczonym wzrostem w porównaniu z nietransfekowanymi komórkami L1 (ryc. 6.). Konstrukt antyangiogenny psFLT-1, podany zwierzętom domięśniowo (ryc. 7.–8.), również efektywnie wydłuża czas przeżycia zwierząt dootrzewnowo zaszczepionych komórkami L1. Podawanie medium hodowlanego bogatego w białko sFLT-1 również ogranicza ip wzrost L1 i wydłuża czas życia zwierząt. Wyniki doświadczeń na zwierzętach potwierdzają wcześniejsze obserwacje [21] wskazujące, że sFLT-1 jest swoistym inhibitorem angiogenezy indukowanej przez VEGF. Zaszczepianie zwierząt, np. mieszaniną komórek (1:1) stransfekowanych wektorem proangiogennym pVEGF i antyangiogennym psFLT-1 (ryc. 10.) znamiennie statystycznie wydłuża czas przeżycia zwierząt, zaś wektor pVEGF podany myszom śródskórnie nie indukuje angiogenezy, jeśli myszy wcześniej zaszczepiono domięśniowo (tab. 2.) lub również śródskórnie wektorem psFLT-1.
Dyskusja
Białko sFLT-1 jest fizjologicznym, negatywnym regulatorem procesów angiogennych [6–9]. Wykazano, że pełni ono funkcję regulacyjną w czasie tworzenia naczyń krwionośnych w okresie embrionalnym. W czasie ciąży szczególnie trofoblast silnie eksprymuje sFLT-1 wpływając na funkcje biologiczne VEGF (angiogeneza, przepuszczalność naczyń) [7]. Schemat domenowej budowy sFLT-1 przedstawia ryc. 2. Badania wskazują, że w wiązaniu VEGF biorą udział przede wszystkim dwie pierwsze pętle immunoglobulinopodobne nr 1 i 2 [9], choć wiadomo również, iż domena nr 3 warunkuje wysokie powinowactwo receptora do ligandów, zaś domena nr 4 jest niezbędna do dimeryzacji receptora [9]. Wykazano, że oddziaływania między VEGF a pierwszymi domenami sFLT-1 mają charakter hydrofobowy, przy czym wskazuje się, że powinowactwo rekombinowanych form sFLT-1 do VEGF jest znacznie wyższe niż form VEGFR-2. Klonowanie wektorów kodujących formy receptora FLT-1, różne niż trzydomenowa postać natywnego receptora FLT-1, ma na celu konstruowanie skutecznych narzędzi do prób terapii genowej, np. chorób nowotworowych [6, 9]. Badania eksperymentalne, jak również pierwsze próby kliniczne antyangiogennej terapii genowej, wykorzystujące konstrukty genowe psFLT-1 wskazują, że kodowane białka poprzez hamowanie angiogenezy ograniczają wzrost guzów nowotworowych [10–16, 20]. Jak pokazują ryc. 4. i 5. oraz tab. 2. sFLT-1 blokuje proces angiogenezy. W przedstawionych badaniach do indukcji angiogenezy wykorzystano konstrukt kodujący jedną z najsilniejszych cytokin proangiogennych – naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostu (VEGF). Wykazano, że sFLT-1 znosi proangiogenną sygnalizację VEGF. Uzyskane wyniki są zgodne z wcześniej opublikowanymi obserwacjami, opisującymi, że w warunkach in vitro sFLT-1 utrudnia migrację komórek nowotworowych L1 stransfekowanych genem VEGF pozostając bez wpływu na zachowanie komórek stransfekowanych np. genem fibroblastycznego czynnika wzrostu (FGF-2) [21]. Wydłużenie czasu życia i niezauważalna ilość wysięku u zwierząt z nadekspresją sFLT w porównaniu z grupą zwierząt L1 i L1/pVEGF (ryc. 7.–10.) wskazują, że obecny w płynie wysiękowym VEGF może być skutecznie blokowany przez białko sFLT. Hasumi i wsp. [11] wykazali, że sFLT hamuje rozrost raka jajnika i tworzenie wysięku. Badacze, wykorzystując komórki raka jajnika transfekowane wcześniej genem Salt, wykazali, że np. objętość wysięku, liczba komórek nowotworowych, były zdecydowanie niższe w tej grupie niż w grupie kontrolnej. Hoshida i wsp. [15] oraz Takayama i wsp. [16] dowodzą, że sFLT może również hamować rozwój guzów litych. W niniejszej pracy (ryc. 6.) wykazano, że transfektanty L1/psFLT rozwijają u zwierząt guzy nowotworowe zdecydowanie wolniej niż komórki nietransfekowane. Wcześniej również wykazano, że guzy L1 poddane bezpośrednim iniekcjom psFLT-1 wzrastają wolniej niż kontrolne [20], choć efekt terapeutyczny był mniej znamienny niż w przypadku guzów wywodzących się z hodowlanych transfektantów L1/psFLT. Takie obserwacje nie są jednak zaskoczeniem, bowiem powszechnie wiadomo, że skuteczność terapii genowej determinowana jest przede wszystkim, jak dotychczas, przez wydajny transfer genów i ich efektywną ekspresję. System stransfekowanych komórek nowotworowych ma charakter przede wszystkim eksperymentalny – dostarcza ważnych informacji, czy preparat genowy wywołuje efekt biologiczny i w jakim stopniu efekt ten jest zależny od stopnia transfekcji komórek. W aspekcie wykorzystania niewirusowych wektorów antyangiogennych w klinice, niezbędna jest staranna selekcja pacjentów, którzy mogą być leczeni preparatami genowymi. W przypadku preparatów niewirusowych ważna jest np. lokalizacja guza nowotworowego, która pozwala na nieobciążające pacjenta proste zabiegi kliniczne umożliwiające zarówno prowadzenie terapii (iniekcje wektora), jak i bezpośrednią ocenę jej skuteczności. Przedstawiony w niniejszej pracy konstrukt psFLT-1 jest obecnie wykorzystywany w prowadzonej w Centrum Onkologii-Instytucie w Warszawie próbie klinicznej antyangiogennej terapii genowej pacjentek chorych na raka sromu [24].


Podziękowania
Autorzy dziękują dr Monice Gos za pomoc w statystycznym opracowaniu wyników
Praca finansowana częściowo z grantu KBN 2 P05E 07126. .
Piśmiennictwo
1. Kontos CD, Annex BH. Angiogenesis. Curr Atheroscler Rep 1999; 1: 165-71. 2. Szala S, Radzikowski C. Podłoże molekularne angiogenezy nowotworów. Nowotwory 1997; 47: 1-19. 3. Wojtukiewicz MZ, Sierko E, Rak J. Contribution of the hemostatic system to angiogenesis in cancer. Semin Thromb Hemost 2004; 30: 5-20. 4. Malecki M, Kolsut P, Proczka R. Angiogenic and antiangiogenic gene therapy. Gene Ther 2005; 12 (Suppl): S159-S169. 5. Ferrara N, Gerber HP, LeCouter J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med 2003; 9: 669-76. 6. Kendall RL, Thomas KA. Inhibition of vascular endothelial cell growth factor activity by an endogenously encoded soluble receptor. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90: 10705-9. 7. Yamaguchi S, Iwata K, Shibuya M. Soluble Flt-1 (soluble VEGFR-1), a potent natural antiangiogenic molecule in mammals, is phylogenetically conserved in avians. Biochem Biophys Res Commun 2002; 291: 554-9. 8. Shibuya M. Vascular endothelial growth factor receptor family genes: when did the three genes phylogenetically segregate? Biol Chem 2002; 383: 1573-9. 9. Hornig CH, Weich HA. Soluble VEGF receptors. Angiogenesis 1999; 3: 33-9. 10. Mahasreshti PJ, Navarro JG, Kataram M, et al. Adenovirus-mediated soluble FLT-1 gene therapy for ovarian carcinoma. Clin Cancer Res 2001; 7: 2057-66. 11. Hasumi Y, Mizukami H, Urabe M, et al. Soluble FLT-1 expression suppresses carcinomatous ascites in nude mice bearing ovarian cancer. Cancer Res 2002; 62: 2019-23. 12. Boocock CA, Charnock-Jones DS, Sharkey AM, McLaren J, Barker PJ, Wright KA, Twentyman PR, Smith SK. Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors flt and KDR in ovarian carcinoma. J Natl Cancer Inst 1995; 87: 506-16. 13. Mori A, Arii S, Furutani M, et al. Soluble Flt-1 gene therapy for peritoneal metastases using HVJ-cationic liposomes. Gene Ther 2000; 7: 1027-33. 14. Yang W, Arii S, Mori A, et al. sFlt-1 gene-transfected fibroblasts: a wound-specific gene therapy inhibits local cancer recurrence. Cancer Res 2001; 61: 7840-5. 15. Hoshida T, Sunamura M, Duda DG, et al. Gene therapy for pancreatic cancer using an adenovirus vector encoding soluble flt-1 vascular endothelial growth factor receptor. Pancreas 2002; 25: 111-21. 16. Takayama K, Ueno H, Nakanishi Y, Sakamoto T, Inoue K, Shimizu K, Oohashi H, Hara N. Suppression of tumor angiogenesis and growth by gene transfer of a soluble form of vascular endothelial growth factor receptor into a remote organ. Cancer Res 2000; 60: 2169-77. 17. Bainbridge JW, Mistry A, De Alwis M, Paleolog E, Baker A, Thrasher AJ, Ali RR. Inhibition of retinal neovascularisation by gene transfer of soluble VEGF receptor sFlt-1. Gene Ther 2002; 9: 320-6. 18. Gehlbach P, Demetriades AM, Yamamoto S, et al. Periocular gene transfer of sFlt-1 suppresses ocular neovascularization and vascular endothelial growth factor-induced breakdown of the blood-retinal barrier. Hum Gene Ther 2003; 14: 129-41. 19. Lai YK, Shen WY, Brankov M, Lai CM, Constable IJ, Rakoczy PE. Potential long-term inhibition of ocular neovascularisation by recombinant adeno-associated virus-mediated secretion gene therapy. Gene Ther 2002; 9: 804-13. 20. Malecki M, Jastrzębski Z, Przybyszewska M, Proczka R, Janik P. Antiangiogenic gene therapy: application of soluble FLT-1 receptor. Adv Clin Exp Med 2004; 13: 227-33. 21. Malecki M, Trembacz H, Szaniawska B, Przybyszewska M, Janik P. Vascular endothelial growth factor and soluble FLT-1 receptor interactions and biological implications. Oncol Rep 2005; 14: 1565-9. 22. Malecki M, Przybyszewska M, Janik P. In vitro and in vivo study of the expression vector encoding vascular endothelial growth factor. Arch Immunol Ther Exp 2001; 49: 243-6. 23. Sidky YA, Auerbach R. Lymphocyte-induced angiogenesis: a quantitative and sensitive assay of the graft-vs.-host reaction. J Exp Med 1975; 141: 1084-100. 24. Panek G, Gawrychowski K, Bidziński M, Krynicki R, Małecki M. Przypadek skutecznego zastosowania plazmidowego wektora ekspresyjnego psFLT i chemio-radioterapii do leczenia zaawansowanego miejscowo raka sromu. Przegląd Menopauzalny 2005; 4: 17-21.
Adres do korespondencji
dr n. med. Maciej Małecki
Zakład Biologii Komórki
Centrum Onkologii-Instytut im. Marii Skłodowskiej-Curie
ul. Roentgena 5
02-781 Warszawa
tel. +48 22 546 26 21
e-mail: mahan@poczta.wp.pl