Plasminogen activator inhibitor type-1 (PAI-1) in tissue extracts of breast cancer

WSTĘP
Inhibitor aktywatorów plazminogenu typu-1 (PAI-1) jest glikoproteiną, hamującą tkankowy (t-PA) i urokinazowy aktywatora plazminogenu (u-PA). Syntetyzowany jest przez komórki śródbłonka, fibroblasty, megakariocyty, hepatocyty, płytki krwi oraz przez komórki nowotworowe [1–3]. PAI-1 może wpływać na migrację komórek nowotworowych poprzez blokowanie ich połączenia z witronektyną, jednym ze składników macierzy zewnątrzkomórkowej [1]. PAI-1, inaktywując u-PA, chroni komórki nowotworowe przed protelizą [4, 5]. Wysokie stężenie PAI-1 często łączy się z niekorzystnym rokowaniem i świadczy o wzroście inwazyjności takich nowotworów, jak rak piersi [6], szyjki macicy [7], żołądka [8] i płuc [9].

CELE PRACY
1. Ocena stężeń PAI-1 w wyciągach tkankowych raka piersi w porównaniu do prawidłowych tkanek gruczołu piersiowego.
2. Analiza stężeń PAI-1 w wyciągach tkankowych raka piersi w zależności od wybranych czynników prognostycznych.
MATERIAŁ I METODYKA
Badaniami objęto 30 kobiet, w wieku 39–81 (średnio 58) lat, chorych na raka piersi. Pacjentki były hospitalizowane i leczone w Centrum Onkologii w Bydgoszczy.
W tab. 1. przedstawiono liczbę badanych chorych w poszczególnych stopniach zaawansowania, opartego na klasyfikacji TNM oraz ocenie zawartości receptorów hormonalnych w tkance nowotworowej.
Fragmenty tkanek uzyskiwano z guza nowotworowego usuniętego wraz z marginesem, względnie całym gruczołem piersiowym podczas zabiegu tumorektomii lub mastektomii. Tkanki stanowiące grupę porównawczą uzyskiwano z tkanki makroskopowo prawidłowej położonej w odległości ok. 2 cm od guza.
Pooperacyjne fragmenty zamrażano w temperaturze -40oC i poddano je homogenizacji za pomocą ciekłego azotu. Stężenie antygenu PAI-1 mierzono metodą immunoenzymatyczną (ELISA), przy użyciu zestawu ImulyseTM (firmy Biopool, Szwecja). Stężenia PAI-1 przeliczano na miligram białka oznaczonego w ekstraktach z tkanek prawidłowych i nowotworowych gruczołu piersiowego. Zgodę na przeprowadzenie badań, otrzymano od Komisji Etyki Badań Naukowych przy Akademii Medycznej w Bydgoszczy.
Normalność rozkładu stężeń PAI-1 sprawdzono testem W Shapiro-Wilka. Do oceny różnic między grupami użyto testu U Manna-Whitneya (dla zmiennych niezależnych) oraz testu Wilcoxona (dla zmiennych zależnych). Do opisu statystycznego zmiennych użyto mediany oraz kwartyla Q1 i Q3. Korelację między badanymi cechami sprawdzono, obliczając współczynnik korelacji Spermana (rs) z wyznaczeniem istotności tego współczynnika. Za istotną statystycznie przyjęto wartość pŁ0,05.

WYNIKI
W tab. 2. i na ryc. przedstawiono stężenia PAI-1 w postaci mediany i kwartyla w wyciągach tkankowych raka piersi w porównaniu do prawidłowych tkanek gruczołu piersiowego.
Jak wynika z danych zamieszczonych w tab. 2., stężenie PAI-1 jest istotnie wyższe w tkance nowotworowej w porównaniu do tkanki prawidłowej (p= 0,01). Tabelę 2. ilustruje rycina, na której można zauważyć duży rozrzut wartości stężeń oraz wyższą medianę PAI-1 w tkance nowotworowej w porównaniu do tkanki prawidłowej.

Stężenia PAI-1 w tkance nowotworowej poddano analizie w zależności od czynników kliniczno-patologicznych stanowiących podstawę oceny zaawansowania i rokowania w raku piersi. Dane te przedstawiono w tab. 3.

Stężenia PAI-1 nie różniły się statystycznie istotnie w obydwu grupach wiekowych, w grupie bez przerzutów (N-) i z przerzutami do węzłów chłonnych (N+) oraz w grupie bez receptorów (PgR-) i z obecnymi receptorami progesteronowymi (PgR+). Mediana stężenia PAI-1 była natomiast statystycznie istotnie wyższa w grupie guzów o większym zaawansowaniu, tj. T2 w porównaniu do T1 oraz w grupie o gorszym rokowaniu, tzn. bez obecnych receptorów estrogenowych (grupa ER-). Dodatkowo przeprowadzono analizę korelacji między stężeniem PAI-1 a wielkością guza. Wykazano istotną statystycznie, dodatnią korelację między tymi wielkościami (Rs=0,4, p=0,03).

OMÓWIENIE WYNIKÓW I DYSKUSJA
Na początku lat 90. XX w. rozpoczęto badania nad powiązaniem zmian w poziomach stężeń aktywatorów i inhibitorów fibrynolizy w tkankach raka piersi z rokowaniem ocenianym na podstawie całkowitego czasu przeżycia (OS – overall survival) i czasu przeżycia wolnego od wznowy (DFS – disease free Survival) [6, 10, 11].
Mimo że nie uzyskano potwierdzenia przydatności czynników układu fibrynolizy jako czynników predykcyjnych [12], to wzrost stężenia niektórych z nich, np. PAI-1 i u-PA, u pacjentek bez zajętych węzłów chłonnych, może być uznany za dodatkowy niepomyślny czynnik rokowniczy. Tę grupę chorych powinno się więc kwalifikować do włączenia agresywnego leczenia uzupełniającego [13–17].
W pracy przeprowadzono pomiary stężenia PAI-1 w tkance nowotworowej raka piersi i tkance makroskopowo prawidłowej, pobranej z obrzeża guza. Przedstawione w tab. 2. i na ryc. wyniki wykazują znamiennie wyższe stężenie tego parametru w guzie w porównaniu do tkanki prawidłowej (p=0,01). W dostępnym piśmiennictwie nie znaleziono prac, omawiających podobne porównania, a uzyskane dane dotyczą jedynie nowotworów innych narządów. Osmak i wsp. stwierdzili w tkankach raka macicy znacznie wyższe stężenie PAI-1 w stosunku do prawidłowych tkanek tego narządu [18]. Podobne zależności obserwowali Salden i wsp. w niedrobnokomórkowym raku płuca oraz Baker i wsp. w raku jelita grubego [9, 19].
W następnym etapie pracy oceniono stężenia PAI-1 w tkankach nowotworowych w zależności od wybranych czynników rokowniczych w raku piersi (tab. 3.).
W kategorii wieku nie uzyskano statystycznie istotnej różnicy między grupą do i powyżej 55. roku życia. Podobnie znamiennej różnicy między grupami wiekowymi nie obserwowano w badaniach Rha i wsp. [20] oraz Knoop i wsp. [21].
Następnym czynnikiem rokowniczym, wziętym pod uwagę, była wielkość guza. Mediany stężeń były istotnie statystycznie wyższe u pacjentek z mniej korzystnym rokowaniem, tj. w grupie z guzami o zaawansowaniu T2 w porównaniu do grupy z guzami T1. Potwierdzeniem wpływu wielkości guza na stężenie PAI-1 jest wykazana przez nas dodatnia, istotna korelacja miedzy rozmiarem guza a stężeniem tego parametru. Nasze wyniki są zgodne z większością danych z piśmiennictwa. W pracy opublikowanej w 1998 r. Knoop i wsp. oceniali zależność stężenia PAI-1 od wielkości guza u 400 pacjentek. Stwierdzili oni dodatnią korelację między obydwoma parametrami [21]. W badaniach prospektywnych Kim i wsp. ocenili grupę pacjentek bez zajętych węzłów chłonnych, u których jedyną cechą wpływającą istotnie na stężenie PAI-1 był rozmiar guza pierwotnego [16].
Następnym czynnikiem w naszych badaniach porównawczych był stan węzłów chłonnych pod względem obecności lub braku przerzutów. W grupie z obecnymi przerzutami obserwowano nieznamiennie wyższe stężenia PAI-1. Podobne wyniki uzyskali Rha i wsp. [20]. Sumiyoshi i wsp. wykazali, że stężenia te są istotnie wyższe u chorych z przerzutami do węzłów [22]. Knoop i wsp. stwierdzili korelację między wzrastającym stężeniem PAI-1 a liczbą zajętych węzłów [21].
W prowadzonych badaniach stwierdzono statystycznie istotnie wyższe stężenie PAI-1 w grupie bez obecnych receptorów estrogenowych w porównaniu do tkanek guza je posiadających. Natomiast nie wykazano tych różnic w zależności od obecności receptorów progesteronowych. Wyniki naszych badań są zgodne z obserwacjami Knoop i wsp. oraz Rha i wsp. [21, 20]. Natomiast Harbeck i wsp. udowodnili ujemną, istotną korelację między stężeniem PAI-1 a stężeniami zarówno receptorów estrogenowych, jak i progesteronowych [14].

Kilku autorów przeprowadziło badania, które polegały na ocenie DFS i OS, zależnie od stężenia PAI-1. Pacjentki z wyższym niż 11 ng/mg białka stężeniem PAI-1 wykazywały wzrost ryzyka wznowy miejscowej i skrócenie całkowitego czasu przeżycia [21, 23].
Harbeck i wsp. także potwierdzili istotny wpływ poziomu PAI-1 na czas do wznowy procesu chorobowego i czas całkowitego przeżycia. U pacjentek z węzłami wolnymi od przerzutów, stężenie PAI-1 było bardzo silnym czynnikiem prognostycznym dla DFS [24].

WNIOSKI
1. W wyciągach tkankowych raka piersi stwierdzono istotnie wyższe stężenie PAI-1 w porównaniu do prawidłowej tkanki gruczołu piersiowego, co potwierdza możliwość udziału tego czynnika w procesie nowotworzenia raka piersi.
2. W zależności od czynników prognostycznych obserwowano istotnie wyższe stężenia PAI-1 w guzach o gorszym rokowaniu, tj. o zaawansowaniu T2 i w grupie bez obecnych receptorów estrogenowych.
PIŚMIENNICTWO
1. Andreasen PA, Kjoller L, Christensen L, Duffy MJ. The urokinase – type plasminogen activator system in cancer metastasis: a review. Int J Cancer 1997; 72: 1-22.
2. Buo L, Bjornland K, Karlsrud TS, et al. Expression and release of plasminogen activators, their inhibitors and receptor by human tumor cell lines. Anticancer Res 1994; 14 (6B): 2445-51.
3. De Vries TJ, van Mujien GNP, Ruiter DJ. The plasminogen activation system in tumor invasion and metastasis. Path Res Pract 1996; 192: 718-33.
4. Blasi F, Stoppelli MP. Proteases and cancer invasion: from belief to certainty AACR meeting on proteases and protease inhibitors in cancer. Nyborg, Denmark, 14-18 June 1998. Biochem Biophys Acta 1998; 1423: 35-44.
5. Mignatti MP, Rifkin DB. Biology and biochemistry of proteinases in tumor invasion. Physiol Rev 1993; 73: 161-95.
6. GroĆndahl-Hansen J, Christensen IJ, Rosenquist Ch, et al. High levels of urokinase – type plasminogen activator and its inhibitor PAI-1 in cytosolic extracts of breast carcinomas are associated is poor prognosis. Cancer Res 1993; 53: 2513-21.
7. Daneri-Navarro A, Macias-Lopez G, Oceguera Villanueva A, et al. Urokinase-type plasminogen activator and plasminogen activator inhibitors (PAI-1 and PAI-2) in extracts of invasive cervical carcinoma and precursor lesions. Eur J Cancer 1998; 34: 566-9.
8. Ho CH, Chao Y, Lee SD, et al. Diagnostic and prognostic values of plasma levels of fibrinolytic markers in gastric cancer. Thromb Res 1998; 91: 23-7.
9. Salden M, Splinter TA, Peters HA, et al. The urokinase-type activator plasminogen system in resected non small-cell lung cancer. Rotterdam Oncology Thoracic Study Group. Ann Oncol 2000; 11: 327-32.
10. Harbeck N, Thomssen C, Berger U, et al. Invasion marker PAI-1 remains a strong prognostic factor after long term follow-up both for primary breast cancer and following first relapse. Breast Cancer Res Treat 1999; 54: 147-57.
11. Jänicke F, Schmitt M, Pache L, et al. Urokinase (uPA) and its inhibitor PAI-1 are strong, independent prognostic factors in node-negative breast cancer. Breast Cancer Res Treat 1993; 195-208.
12. Pierga JY, Lainé Bidron C, Beuzeboc P, et al. Plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) is not related to response to neoadjuvant chemotherapy in breast cancer. Br J Cancer 1997; 76: 537-40.
13. Billgren AM, Rutqvist LE, Johansson H, et al. The role of cathepsin D and PAI-1 in primary invasive breast cancer as
prognosticators and predictors of treatment benefit with adjuvant tamoxifen. Eur J Cancer 2000; 36: 1374-80.
14. Harbeck N, Berger U, Kruger A, et al. Prognostic impact of proteolytic factors (urokinase type plasminogen activator, plasminogen activator inhibitor 1 and cathepsins D, B and L) in primary breast cancer reflects effects of adjuvant systemic therapy. Clin Cancer Res 2001; 7: 2757-64.
15. Jänicke F, Prechtl, Thomssen C. Randomized adjuvant chemotherapy trial in high-risk, lymph node-negative brest cancer patients identified by urokinase-type plasminogen activator and plasminogen activator inhibitor type 1.
J Natl Cancer Inst 2001; 93: 913-20.
16. Kim JS, Shiba E, Kobayashi T, et al. Prognostic impact of urokinase-type plasminogen activator (PA), PA inhibitor type-1 and tissue type PA antigen levels in node-negative breast cancer: a prospective study on multicenter basis. Clin Cancer Res 1998; 4: 177-82.
17. Look MP, van-Putten WL, Duffy MJ, et al. Pooled analysis of prognostic impact of urokinase-type plasminogen activator and its inhibitor PAI-1 in 8377 breast cancer patients. J Natl Cancer Inst 2002; 94: 116-28.
18. Osmak M, Babic D, Abramic M, et al. Plasminogen activator inhibitor type 2: potential prognostic factor for endometrial carcinomas. Neoplasma 2001; 48: 462-7.
19. Baker EA, Bergin FG, Leaper DJ. Plasminogen activator system, vascular endothelial growth factor and colorectal cancer progression. Mol Pathol 2000; 53: 307-12.
20. Rha SY, Yang WI, Gong SJ, et al. Correlation of tissue and blood plasminogen activation system in breast cancer. Cancer Lett 2000; 150: 137-45.
21. Knoop AS, Andreasen PA, Andersen JA, et al. Prognostic significance of UPA and PAI-1 in primary breast cancer. Br J Cancer 1998; 77: 932-40.
22. Sumiyoshi K, Baba S, Sakaguchi S, et al. Increase in levels of plasminogen activator and type-1 plasminogen activator inhibitor in human breast cancer: possible roles in tumor progression and metastasis. Thromb Res 1991; 63: 59-71.
23. Fersis N, Krainick U, Frise H, et al. Prognostic value of plasminogen activator inhibitor type 1 and 2 in primary breast cancer. Eur J Cancer 1998; 34: 23-29.
24. Harbeck N, Alt U, Berger U, et al. Long-term follow-up confirms prognostic impact of PAI-1 and cathepsin D and L in primary breast cancer. Int
J Biol Markers 2000; 15: 79-83.
ADRES DO KORESPONDENCJI
lek. Elżbieta Pietrusińska
Dział Radioterapii
Centrum Onkologii
ul. Romanowskiej 2
85-796 Bydgoszcz