Platelet hemostasis and endothelial status in postmenopausal women with some risk factors for coronary heart disease – the impact of hormonal therapy and anti-thrombotic prophylaxis

Wstęp
W okresie menopauzy kobiety częściej zaczynają zapadać na schorzenia układu krążenia, w tym na chorobę wieńcową serca (ang. coronary heart disease – CHD). Główne przyczyny, to zmiany w profilu lipidowym, zwolnienie przepływu krwi, zmiany w krzepnięciu i fibrynolizie, uszkodzenie ściany naczyniowej w wyniku procesów flebo- i aterosklerozy [1, 2]. Śródbłonek naczyniowy (endotelium) oraz płytki krwi to bardzo ważne elementy hemostazy: - uszkodzenie śródbłonka, np. w wyniku miażdżycy, wzbudza kaskadę krzepnięcia, powodując kontakt osocza z czynnikiem tkankowym (ang. tissue factor – TF) oraz aktywację czynnika XII na ujemnie naładowanych powierzchniach (np. na kolagenie ściany naczynia wieńcowego odsłoniętym w wyniku pęknięcia blaszki miażdżycowej); - również płytki krwi, biorące udział zarówno w wytwarzaniu czopa hemostatycznego (adhezja płytek do ściany naczynia w miejscu jej uszkodzenia z następową ich aktywacją i agregacją), jak i w hemostazie wtórnej (w wyniku aktywacji na powierzchni płytek pojawiają się ujemnie naładowane fosfolipidy, stanowiące miejsce do aktywacji procesu krzepnięcia w mechanizmie wewnątrzpochodnym, a z ziarnistości płytek uwalniany jest V czynnik krzepnięcia), mogą być przyczyną powikłań zakrzepowo-zatorowych, w tym ostrych epizodów wieńcowych [3, 4]. Uszkodzenie ściany naczynia (w tym śródbłonka) i wytworzenie blaszki miażdżycowej jest morfologicznym podłożem CHD. Uszkodzić śródbłonek mogą: podwyższony poziom katecholamin, nikotyna, infekcje wirusowe, cukrzyca, nadciśnienie tętnicze, kompleksy immunologiczne. Istotne znaczenie dla rozwoju miażdżycy ma także zaburzony w metabolizm lipoprotein. Obecnie uważa się jednak, że główną rolę w procesie rozwoju miażdżycy tętnic odgrywa zapalenie. W uszkodzonych w wyniku procesu zapalnego komórkach śródbłonka zostaje uruchomiony szereg proaterogennych i prozakrzepowych przemian, niekorzystnie wpływających na hemostazę. Przemiany te to m.in. synteza i ekspresja TF, uwalnianie czynnika aktywującego płytki – PAF, tłumienie ekspresji trombomoduliny, uwalnianie PAI-1 oraz zahamowanie syntezy t-PA, ekspozycja integryn i selektyn na powierzchni komórek endotelium, co ma znaczenie w powstawaniu mnogich mikrozakrzepów w naczyniach [5, 6]. Wpływ terapii hormonalnej (ang. hormone therapy – HT) na CHD nie jest do końca wyjaśniony. Z jednej strony wiele badań donosi, że estrogeny korzystnie wpływają na stan naczyń (np. zwiększają produkcję NO, powodują spadek VEGF, zmniejszają stężenie białek adhezyjnych), a stosowanie HT łączy się z redukcją ryzyka CHD – nawet o 40% [7]. Z drugiej strony, w takich badaniach, jak HERS, czy WHI doustna HT (ang. oral HT – oHT) nie sprawdziła się jako prewencja wtórna CHD, lub też zwiększyła ryzyko zawału serca w grupie kobiet po 60. roku życia (zwraca się uwagę na znoszenie beneficjalnej roli estrogenów przez progestageny) [8, 9]. Czy kobiety w okresie menopauzy mogą jednak odnieść korzyści naczyniowe ze stosowania HT szczególnie, gdy mają już czynniki ryzyka rozwoju CHD, a ich naczynia wieńcowe nie są jeszcze zmienione miażdżycowo i czy terapia ta jest dla nich bezpieczna? Celem obecnego badania była ocena wpływu, jaki HT i niskie dawki ASA wywierają na parametry określające stan śródbłonka naczyniowego i hemostazę płytkową w grupie kobiet menopauzalnych, obciążonych czynnikami ryzyka CHD.
Materiał i metoda
W badaniu wzięło udział 68 kobiet menopauzalnych, z czego do opracowania statystycznego zakwalifikowano ostatecznie 61 kobiet: 45 kobiet stanowiło grupę badaną, pozostałe zaś utworzyły grupę kontrolną. Grupa badana charakteryzowała się następującymi parametrami wyjściowymi: średni wiek – 55,29 lat; wiek menopauzalny – 65,26 mies.; BMI – 26,57 kg/m²; WHI – 0,82; cholesterol 229 mg/dl; trójglicerydy – 106 mg/dl; podwyższonymi poziomami PAI-1. Palenie papierosów i HA – 26 % pacjentek. Kobiety biorące udział w badaniu miały 2 lub więcej z powyższych czynników ryzyka dla CHD, w tym palenie papierosów, nadciśnienie tętnicze, otyłość typu brzusznego, hipecholesterolemię, hipertrójglicerydemię. U wszystkich kobiet przed rozpoczęciem leczenia (T0) wykonano badanie ginekologiczne, połączone z badaniem palpacyjnym sutków, mammografię, przezpochwową ultrasonografię narządów rodnych (ocena grubości endometrium, ocena przepływów naczyniowych w tętnicach macicznych – PI, RI, S/D), we krwi oznaczano glukozę na czczo, leukocytozę, poziom CRP, OB, stężenia AlAt, AspAt, bilirubiny. Wskazaniami do zastosowania HT w grupie badanej były nasilone objawy zespołu klimakterycznego, (głównie) pod postacią silnych i częstych uderzeń gorąca i towarzyszących im zlewnych potów. Długość stosowania terapii – 3 mies. Wśród badanej grupy kobiet wyróżniono: G1 (n=22), gdzie zastosowano tHT w postaci plastrów, złożoną z 17β-estradiolu (E2) w dawce 50 µg/dobę oraz octanu noretysteronu (NETA) w dawce 170 µg/dobę) oraz G2 (n=23), gdzie poza ww. tHT (50 µg E2 + 170 µg NETA) zastosowano niskie dawki kwasu acetylosalicylowego (ASA) – 30 mg/dobę. Terapię stosowano przez 3 mies. Grupę kontrolną (K) (n=16) stanowiły miesiączkujące kobiety w okresie premenopauzy. Charakterystykę badanych grup przedstawia tab. I. W osoczu i krwi każdej z pacjentek oznaczano 2-krotnie, na początku badania (T0) i po 3 mies. (T3) następujące parametry, charakteryzujące stan śródbłonka i hemostazę płytkową: u-PAR, endotelina-1, E-selektyna, GP IIb/IIIa. Przy pomocy metody immunoenzymatycznej (ELISA) oznaczano 3 pierwsze z ww. parametrów, stosując następujące zestawy odczynników: Human sE-selectin ELISA Kit (BIOSOURCE INTERNATIONAL), Endothelin-1 Biotrak ELISA System (Amersham Biosciences) i IMUBIND^® Total uPAR ELISA Kit (American Diagnostica inc). Krew do badań pobierano do probówek zawierających heparynę, następnie wirowano 2 000 x g przez 10 min w 4°C w celu uzyskania ludzkiego osocza. Osocze przechowywano w temp. -20°C. Poziom białek w każdej z prób badanych oznaczano w dwóch powtórzeniach. Przebieg oznaczeń prowadzono ściśle wg zaleceń i procedur producentów. W każdym teście płytki opłaszczone I przeciwciałami skierowanymi przeciwko badanym białkom inkubowano z próbkami nierozcieńczonego osocza i po odpłukaniu nadmiaru białek dodawano II przeciwciała skoniugowane z peroksydazą chrzanu (HRP), która wraz z substratem dawała barwny produkt. Intensywność barwy odczytywano przy odpowiedniej długości fali w spektrofotometrze Wallac Victor (Perkin Elmer). Natomiast przy użyciu cytometrii przepływowej oznaczano GP IIb/IIIa. Krew pobierano igłą (18G x 1 1/2’’) do plastikowej probówki zawierającej ACD (w końcowym stężeniu antykoagulant kwas cytrynowy/cytrynian sodu/glukoza: krew w stosunku 1:7 o/o) z żyły przedramieniowej. Do analizy ekspresji aktywnej formy ludzkiego receptora GPIIb-IIIa – po 10-krotnym rozcieńczeniu krwi roztworem PBS – dodawano przeciwciała: PAC-1 (znakowane FITC, Becton Dickinson). Ponadto do każdej próbki dodawano przeciwciała skierowane przeciwko ludzkiej podjednostce GPIIIa (znakowane PerCP, Becton Dickinson) w celu bramkowania płytek w pełnej krwi. Po 20 min utrwalano próbki 10-krotnie rozcieńczonym roztworem CellFix (Becton Dickinson) i inkubowano 2 godz. w ciemności w temperaturze pokojowej. Równolegle przeprowadzano kontrolę fluorescencji niespecyficznego wiązania znakowanych izotypowych immunoglobulin G1 myszy. Fluorescencję 2 000–5 000 płytek mierzono przy użyciu FACSCalibur Instrument (Becton Dickinson) i analizowano w Lysis II software.
Metody statystyczne
- Dla parametrów wyrażonych w skali przedziałowej (ciągłych) podano minimum i maksimum, obliczono średnią, medianę, odchylenie standardowe, standardowy błąd średniej i współczynnik zmienności. Sprawdzono normalność rozkładów testem Shapiro-Wilka. - Porównanie grup (próby niezależne) Porównanie średnich między grupami w przypadku nieodrzucenia hipotezy o normalności rozkładu na poziomie istotności p=0,05 wykonano testem t-Studenta dla prób niezależnych, a w przypadku odrzucenia hipotezy o normalności rozkładów stosowano nieparametryczny test U Manna Whitney’a. w Porównanie grup (próby zależne) Porównanie średnich między grupami w przypadku nieodrzucenia hipotezy o normalności rozkładu na poziomie istotności p=0,05 wykonano testem t-Studenta dla prób zależnych, a w przypadku odrzucenia hipotezy o normalności rozkładów stosowano nieparametryczny test rangowanych znaków Wilcoxona. - Dla parametrów wyrażonych w skali nominalnej zbadano strukturę i częstości występowania danych klas. Porównania między grupami, oraz badanie zależności przeprowadzono testem c2 (chi kwadrat). Jeśli warunki stosowania testu c2 nie były spełnione, to w przypadku tablicy czteropolowej porównanie dwóch częstości, jak i badanie zależności wykonano testem dokładnym Fishera.
Wyniki
3-miesięczna terapia, zarówno w postaci tHT w G1, jak i tHT+ASA w G2 nie miała wpływu na poziomy GP IIb/IIIa, E-selektyny, ET-1 i u-PAR kobiet po menopauzie. Spośród badanych parametrów, na początku badania (T0) obydwie grupy kobiet pomenopauzalnych różniły się od grupy kontrolnej (K) poziomami GP IIb/IIIa – w G1 i G2 były one statystycznie wyższe niż w grupie kontrolnej (premenopauzalnej). Zjawiska tego nie obserwowano na końcu badania (T3). Uzyskane wyniki przedstawione zostały w tab. II–IV.
Dyskusja
Białkowe składniki macierzy zewnątrzkomórkowej (kolagen, fibronektyna, laminina, czynnik von Willebranda – vWF) odsłonięte, np. w wyniku pęknięcia blaszki miażdżycowej są rozpoznawane przez swoiste receptory adhezyjne płytek krwi (np. kompleks glikoprotein błony płytkowej GPIb-IX-V, czy receptor GPVI). Skutkiem tego płytki przylegają do miejsc o uszkodzonym śródbłonku, gdzie ulegają rozpostarciu. Następstwem adhezji płytek jest ich aktywacja, z uwalnianiem szeregu biologicznie aktywnych substancji w postaci, np. ADP, który aktywuje dalsze płytki. W końcowej fazie aktywacji na powierzchni płytek pojawiają się receptory, które wiążąc fibrynogen, powodują agregację płytek krwi. Receptorem takim jest glikoproteina IIb/IIIa, białko należące do rodziny adhezyjnych receptorów integrynowych. GP IIb/IIIa występuje tylko w płytkach krwi, gdzie po przejściu w stan aktywny podlega zmianom konformacyjnym i wiąże wysokocząsteczkowe białka (głównie fibrynogen). Dochodzi dzięki temu do agregacji płytek (fibrynogen spina płytki) i tworzenia zakrzepu w świetle naczynia, co z jednej strony hamuje krwawienie, z drugiej zaś może indukować rozwój zakrzepicy [10]. Zastosowana terapia nie wpłynęła na poziom GP IIb/IIIa, zaś wyższe poziomy GP IIb/IIIa w G1 i G2 mogą świadczyć o niekorzystnych, prozakrzepowych zmianach zachodzących w hemostazie pomenopauzalnej. Endotelina-1 (ET-1), produkowana przez komórki śródbłonka, jest bardzo silnym wazokonstriktorem. Badania na modelach zwierzęcych sugerują, że wzrost ciśnienia tętniczego w okresie pomenopauzalnym może być po części zależny od ET-1 oraz jej receptora ET (A) R, przy czym estrogeny modulują ekspresję tego receptora [11, 12]. Krótkoterminowa, dowieńcowa podaż 17β-E2 u 20 kobiet po menopauzie z CHD zmniejszyła poziomy ET-1 w naczyniach wieńcowych. Nie było wzrostu odpowiedzi naczyniowo-ruchowych na substancję P (SP) po podaniu E2, co sugeruje, że wpływ estrogenów na wieńcowy wyrzut acetylocholiny może być specyficznym, a nie uogólnionym oddziaływaniem na wieńcową reaktywność naczyń [13]. Obniżenie ET-1 pod wpływem HT nie jest stwierdzane przez wszystkich badaczy [14, 15]. Na przykład przezskórna HT (17β-E2 50 mcg/d + NETA 250 mcg/d) zastosowana u 30 kobiet menopauzalnych z objawami klimakterycznymi spowodowała w ciągu 6 miesięcy: w trakcie I fazy (sam E2) wzrost ok. 20% produkcji prostacykliny F1alfa (mierzono jej metabolit – 6-keto-pochodną), dodanie zaś NETA (w II fazie cyklu leczniczego) eliminowało powyższe działanie E2. Brak było wpływu ww. HT na poziom ET-1 [16]. Wydaje się więc, że wpływ HT na poziomy ET-1 nie ma pierwszorzędowego znaczenia w protekcyjnym wpływie tej terapii na zaburzenia sercowo-naczyniowe kobiet menopauzalnych. Spadku ET-1 nie odnotowano również w obecnym badaniu. Selektyny są rodziną białek, biorących zasadniczy udział w reakcji zapalnej organizmu. Występują one na powierzchni leukocytów, aktywowanych płytkach krwi, na komórkach endotelium. E-selektyna jest białkiem adhezyjnym, którego ekspresja pojawia się na zmienionych zapalnie komórkach śródbłonka jako odpowiedź na działanie prozapalnych cytokin [17]. Np. przyłączenie czynnika płytkowego 4 (ang. platelet factor 4: PF4) – chemokiny o aterogennych właściwościach, wydzielanej przez aktywowane płytki krwi – do LRP (ang. lipoprotein receptor-related protein) indukuje w komórkach śródbłonka, poprzez aktywację jądrowego czynnika-κkB (ang. nuclear factor – κB: NF-κB), syntezę mRNA E-selektyny, co daje efekt ostateczny w zwiększonej jej ekspresji na powierzchni śródbłonka [18]. Podstawową funkcją E-selektyny jest jej udział w przejściu leukocytów z etapu toczenia się do ścisłej adhezji po aktywacji komórki [19]. W modelu zapalnym miażdżycy E-selektyna jest uważana za ważny czynnik tworzenia blaszki miażdżycowej, a jej ekspresja jest obecna na zmienionym miażdżycowo śródbłonku, w szczególności, gdy stwierdzana jest obecność podśródbłonkowych nacieków leukocytarnych [20]. Po 6 miesiącach tHT złożona z 17β-estradiolu (50 mcg/dzień) i NETA (0,125 mg/dobę) spowodowała u kobiet pomenopauzalnych spadek poziomów E-selektyny, a także ACE, cholesterolu, LDL, HDL3, apolipoproteiny A i B oraz insuliny. Doszło również do spadku czynnika VII, PAI-1, wzrostu D-dimerów, spadku F1+2 (brak było zmian w stężeniu metaloproteinazy-2 i wielkości cząsteczki LDL) [21]. W naszym badaniu spadku stężenia E-selektyny nie zaobserwowano. Przyczyną mógł być zbyt krótki (3 mies.) okres leczenia hormonalnego. Również poziomy receptora dla urokinazowego aktywatora plazminogenu (uPAR) nie uległy w obecnym badaniu zmianie pod wpływem 3 mies. tHT. uPAR wraz z LRP jest niezbędny do oczyszczania osocza z kompleksów uPA/PAI-1. W przypadku nieobecności kompleksów uPA/PAI-1, cząsteczki uPAR są rozmieszczone w błonie komórkowej w sposób przypadkowy, natomiast pojawienie się uPA/PAI-1 powoduje łączenie się uPAR i LRP w kompleksy oraz ich redystrybucję. Kompleksy uPAR-LRP ulegają następnie endocytozie i są składowane we wczesnych endosomach. Bezpośrednie łączenie się uPAR z LRP za pomocą domeny D3 jest niezbędne dla klirensu cząsteczek uPAR związanych z kompleksami uPA/PAI-1 [22]. uPAR jest także kluczową molekułą w regulowaniu pozakomórkowej proteolizy przez plazminogen, bierze również udział w procesach angiogenezy i inwazji nowotworów [23]. Terapia hormonalna okresu menopauzalnego w różnoraki sposób oddziałuje na hemostazę, a to wpływa z kolei na ryzyko CHD. Liczne badania dotyczące tego problemu donoszą zarówno o jej pozytywnym (np. spadek VCAM-1, ICAM-1, sTM, vWF, korzystne zmiany w fibrynolizie – spadek PAI-1, czy profilu lipidowym), jak i – odwrotnie – o niekorzystnym wpływie (np. wzrost białka C-reaktywnego, spadek AT III, spadek TFPI) na poszczególne elementy hemostazy, często też są wzajemnie ze sobą sprzeczne [24–26]. Wpływ tej terapii na hamowanie procesów miażdżycowych kobiet w okresie menopauzalnym, i pośrednio rozwój i przebieg CHD, jest – jak się wydaje – zależny przede wszystkim od: 1. wieku kobiety, w jakim rozpoczyna się leczenie (im wcześniej, tym lepiej), 2. długości leczenia hormonalnego (nie za krótko i nie za długo, niezbędne minimum), 3. typu HT (droga podania hormonów, ich dawka i skład biochemiczny) oraz 4. od obecności dodatkowych czynników ryzyka zakrzepowo-zatorowego, np. od rozwiniętej już miażdżycy tętnic. W tym kontekście tHT wydaje się być dobrą, bezpieczną opcją w leczeniu wielu dolegliwości okresu klimakterium.
Wnioski
1. 3-miesięczna tHT zastosowana w grupie kobiet menopauzalnych obciążonych czynnikami ryzyka CHD nie miała wpływu na stan śródbłonka naczyniowego i hemostazę płytek krwi. 2. Stosowanie niskich dawek ASA, jako profilaktyki przeciwzakrzepowej dla tHT u kobiet po menopauzie nie jest wskazane. 3. Po menopauzie dochodzi do niekorzystnych zmian w hemostazie płytkowej.
Piśmiennictwo
1. Łopaciuk S. Zakrzepy i zatory. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2002. 2. Stachowiak G, Połać I, Jędrzejczyk S, et al. Postmenopausal status, coagulation and fibrinolysis. Pol J Gynaecol Invest 2001; 3: 97-100. 3. Vane JR, Anggard EE, Botting RM. Regulatory functions of the vascular endothelium. N Engl J Med 1990; 323 (1): 27-36. 4. Colman RW, Hirsh J, Marder VJ, et al. Hemostasis and thrombosis: basic principles and clinical practice. Lippincolt, Philadelphia 1987. 5. Levi M, ten Cate H, van der Poll T, et al. Pathogenesis of disseminated intravascular coagulation in sepsis. JAMA 1993; 270 (8): 975-9. 6. Ware JA, Heistad DD. Seminars in medicine of the Beth Israel Hospital, Boston. Platelet-endothelium interactions. N Engl J Med 1993; 328 (9): 628-35. 7. Lowe GD. Hormone replacement therapy: prothrombotic vs. protective effects. Pathophysiol Haemost Thromb 2002; 32 (5-6): 329-32. 8. Hulley S, Grady D, Bush T, et al. Randomized trial of estrogen plus progestin for secondary prevention of coronary heart disease in postmenopausal women. Heart and Estrogen/progestin Replacement Study (HERS) Research Group. JAMA 1998; 280 (7): 605-13. 9. Larkin M. Ups and downs for HRT and heart disease. Lancet 2000; 355: 1338. 10. Cierniewski CS. Leki przeciwpłytkowe – blokery płytkowego receptora fibrynogenu. Pol Przeg Kardiol 2000; 2: 105-10. 11. Yanes LL, Romero DG, Cucchiarelli VE, et al. Role of endothelin in mediating postmenopausal hypertension in a rat model. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2005; 288 (1): R229-33. 12. Regitz-Zagrosek V. Cardiovascular disease in postmenopausal women. Climacteric 2003; 6 Suppl. 3: 13-20. 13. Webb CM, Ghatei MA, McNeill JG, et al. 17beta-estradiol decreases endothelin-1 levels in the coronary circulation of postmenopausal women with coronary artery disease. Circulation 2000; 102 (14): 1617-22. 14. Gambacciani M, Monteleone P, Vitale C, et al. Dydrogesterone does not reverse the effects of estradiol on endothelium-dependant vasodilation in postmenopausal women: a randomised clinical trial. Maturitas 2002; 43 (2): 117-23. 15. Cagnacci A, Tarquini R, Perfetto F, et al. Endothelin-1 and nitric oxide levels are related to cardiovascular risk factors but are not modified by estradiol replacement in healthy postmenopausal women. A cross-sectional and a randomized cross-over study. Maturitas 2003; 44 (2): 117-24. 16. Mikkola T, Viinikka L, Ylikorkala O. Administration of transdermal estrogen without progestin increases the capacity of plasma and serum to stimulate prostacyclin production in human vascular endothelial cells. Fertil Steril 2000; 73 (1): 72-4. 17. Bevilacqua MP, Stengelin S, Gimbrone MA Jr, et al. Endothelial leukocyte adhesion molecule 1: an inducible receptor for neutrophils related to complement regulatory proteins and lectins. Science 1989; 243 (4895): 1160-5. 18. Yu G, Rux AH, Ma P, et al. Endothelial expression of E-selectin is induced by the platelet-specific chemokine platelet factor 4 through LRP in an NF-kappaB-dependent manner. Blood 2005; 105 (9): 3545-51. 19. Ley K, Allietta M, Bullard DC, et al. Importance of E-selectin for firm leukocyte adhesion in vivo. Circ Res 1998; 83 (3): 287-94.
20. van der Wal AC, Das PK, Tigges AJ, et al. Adhesion molecules on the endothelium and mononuclear cells in human atherosclerotic lesions. Am J Pathol 1992; 141 (6): 1427-33. 21. Stevenson JC, Oladipo A, Manassiev N, et al. Randomized trial of effect of transdermal continuous combined hormone replacement therapy on cardiovascular risk markers. Br J Haematol 2004; 124: 802-8. 22. Czekay RP, Kuemmel TA, Orlando RA, et al. Direct binding of occupied urokinase receptor (uPAR) to LDL receptor-related protein is required for endocytosis of uPAR and regulation of cell surface urokinase activity. Mol Biol Cell 2001; 12 (5): 1467-79. 23. Postovit LM, Adams MA, Lash GE, et al. Oxygen-mediated regulation of tumor cell invasiveness. Involvement of a nitric oxide signaling pathway. J Biol Chem 2002; 277 (38): 35730-7. 24. Falco C, Tormo G, Estelles A, et al. Fibrinolysis and lipoprotein (a) in women with coronary artery disease. Influence of hormone replacement therapy. Haematologica 2001; 86 (1): 92-8. 25. Seljeflot I, Arnesen H, Hofstad AE, et al. Reduced expression of endothelial cell markers after long-term transdermal hormone replacement therapy in women with coronary artery disease. Thromb Haemost 2000; 83 (6): 944-8. 26. Lowe GD, Upton MN, Rumley A, et al. Different effects of oral and transdermal hormone replacement therapies on factor IX, APC resistance, t-PA, PAI and C-reactive protein-a cross-sectional population survey. Thromb Haemost 2001; 86 (2): 550-6. Powyższa praca powstała ze środków Komitetu Badań Naukowych – Grant KBN nr 3 P05E 162 23.