Podoplanin expression in malignant ovarian cancer

Wstęp

Rak jajnika jest czwartym co do częstości nowotworem występującym u kobiet. Najczęściej jest diagnozowany u kobiet, które przekroczyły 50. r.ż. Według danych statystycznych, ponad połowa pacjentek z rakiem jajnika ma powyżej 63 lat [1]. Menopauza nie jest jednak uznanym czynnikiem predestynującym do nowotworzenia jajnika. Status menopauzalny nie jest związany z przebiegiem klinicznym nowotworu jajnika. W obydwu grupach klasyfikacja histologiczna i cechy nowotworu są takie same. Wiek został jednak uznany za niezależny czynnik predykcyjny związany z przeżywalnością lub odpowiedzią na leczenie [2]. Środowisko hormonalne, w jakim powstaje guz przed menopauzą i po niej, jest różne [3]. Rozwojowi guza towarzyszy powstawanie nowych naczyń krwionośnych. Badania dotyczące neoangiogenezy układu krwiotwórczego są dobrze udokumentowane, natomiast skąpe są dane dotyczące rozwoju naczyń limfatycznych [4].

Podoplanina, przezbłonowe białko o ciężarze 38 KDa, ulega ekspresji w śródbłonku naczyń limfatycznych, natomiast jest nieobecne w śródbłonku naczyń krwionośnych [5]. W ostatnich latach jej podwyższoną ekspresję zaobserwowano także w komórkach dendrytycznych [6], a także w fibroblastach ogniska przewlekłego zapalenia opłucnej, międzybłoniaku [7] oraz w nowotworach płaskonabłonkowych [8]. Istnieją nieliczne doniesienia na temat roli podoplaniny w raku jajnika. Dumoff i wsp. zaobserwowali jej niską ekspresję w nowotworach narządów płciowych [9], natomiast Schacht i wsp. stwierdzili, iż jest ona szczególnie podwyższona w ziarniszczakach i rozrodczakach [10]. Jej silnie podwyższona ekspresja obserwowana była w jasnokomórkowym raku jajnika [11].

Celem omawianej pracy było określenie ekspresji genu podoplaniny na poziomie mRNA w tkance surowiczego oraz śluzowego gruczolakoraka jajnika.

Materiał i metody

Charakterystyka chorych

Badaniem objęto pacjentki chore na raka jajnika operowane w I Klinice Ginekologii Onkologicznej i Ginekologii Uniwersytetu Medycznego w Lublinie. Badana grupa składała się z 42 pacjentek z surowiczym (26 pacjentek – 69,1%) oraz śluzowym rakiem jajnika (16 pacjentek – 30,9%). Grupę kontrolną stanowiły tkanki jajnika pobrane od 13 kobiet operowanych z innych powodów. W grupie badanej 15 pacjentek było przed menopauzą (35,7%), a 27 po menopauzie (64,3%), w grupie kontrolnej 5 było przed menopauzą (38,4%), a 8 po menopauzie (61,6%). U 20 pacjentek stwierdzono I/II stopień FIGO (International Federation of Gynaecology and Obstetrics) (47,6%), a III/IV – u 22 (52,4%). Stopień zróżnicowania G1 wykazano w 7 guzach (16,6%), G2 w 21 (50%) i G3 w 14 (33,4%). Szczegółowe dane kliniczne przedstawiono w tabeli I.

Tkanki guza były zamrażane w ciekłym azocie i przechowywane do momentu izolacji RNA w –80°C. Izolację RNA wykonywano z zastosowaniem kitu AllPrep

DNA/RNA Isolation Mini Kit firmy Qiagen. 1 µg totalnego RNA przepisywano na cDNA w reakcji odwrotnej transkrypcji z użyciem kitu High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Analizę wykonano z zastosowaniem techniki Real-Time PCR (polymerase chain reaction). Poziom ekspresji mRNA genu podoplaniny został określony z użyciem sondy TaqMan (Assay ID Hs00366764_m1) na aparacie ABI Prism 7900 wg protokołu rekomendowanego przez producenta (Applied Biosystems). Ilościową analizę wykonano z zastosowaniem metody RQ (relative quantification), w której referencję endogenną stanowił gen GAPDH. Badania uzyskały zgodę komisji bioetycznej przy Uniwersytecie Medycznym w Lublinie.

Wyniki

Ekspresja podoplaniny

Ekspresja genu podoplaniny na poziomie mRNA została zaobserwowana we wszystkich badanych guzach jajnika. Była ona istotnie niższa (p < 0,001) w grupie pacjentek z rakiem jajnika (RQ = 4,46) w porównaniu z grupą kontrolną (RQ = 13,03) (tab. IIA., ryc. 1.). Rak surowiczy wykazywał wyższą ekspresję podoplaniny (RQ = 5,37) w porównaniu z rakiem śluzowym (RQ = 3,55). Nie była to jednak różnica istotna statystycznie (p = 0,784) (ryc. 2.). Nie zaobserwowano różnic w ekspresji badanego genu ze względu na status menopauzalny (ryc. 1., tab. IIB.). Ekspresja podoplaniny, zarówno w grupie kobiet przed menopauzą, jak i po menopauzie (tab. IIB. i IIC.), była równie istotnie niska (p < 0,001) w obydwu badanych typach histologicznych guza (przed menopauzą rak surowiczy: RQ kontrola vs grupa badana: 12,07 vs 4,26; rak śluzowy: RQ kontrola vs grupa badana: 12,07 vs 2,82; po menopauzie rak surowiczy: RQ kontrola vs grupa badana: 13,99 vs 6,49; rak śluzowy: RQ kontrola vs grupa badana: 13,99 vs 4,29) (ryc. 1. i 2.). Nie wykazano istotnej różnicy statystycznej w ekspresji podoplaniny w odniesieniu do stopnia zaawansowania (FIGO) nowotworu (p = 0,442) czy też dojrzałości guza (p = 0,593) (tab. I).

Analiza statystyczna

Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej, stosując oprogramowanie SPSS ver 14 (test Manna-Whitneya). Za znamienny statystycznie poziom istotności w omawianych analizach przyjęto p < 0,05.

Dyskusja

W przeprowadzonych badaniach wykazano ekspresję genu podoplaniny na poziomie mRNA we wszystkich 42 tkankach raka jajnika. Była ona istotnie statystycznie niższa w porównaniu z grupą kontrolną (p < 0,001). Uzyskane wyniki mogą sugerować zaangażowanie tego genu w nowotworzenie jajnika. W literaturze dostępne są jedynie nieliczne doniesienia na temat roli podoplaniny w raku jajnika. Silna ekspresja tego genu była obserwowana w rozrodczaku jajnika i w ziarniszczakach, podczas gdy pozostawała niewykrywalna w nabłonkowych nowotworach jajnika [10]. Schacht i wsp. uzyskali wyniki na podstawie badań immunohistochemicznych. Zostały one przeprowadzone na małej grupie chorych (5 przypadków nabłonkowego raka jajnika) [10]. W badaniach na 78 przypadkach raka jajnika Oe i wsp. potwierdzili niską ekspresję podoplaniny na poziomie białka [11]. W raku surowiczym była ona obecna w 36,8%, w endometrioidalnym w 33,3% i w śluzowym w 15% przypadków. Wśród przebadanych przez Oe i wsp. nabłonkowych raków jajnika podwyższoną ekspresję podoplaniny zanotowano w znaczącym odsetku (54%) jedynie w raku jasnokomórkowym. Przedstawione przez nas wyniki dotyczą dwóch podtypów histologicznych guza jajnika (surowiczego i śluzowego). Nie zanotowano między nimi istotnych różnic w ekspresji podoplaniny na poziomie mRNA, choć była ona nieznacznie wyższa w raku surowiczym. Obserwowana przez autorów niniejszej pracy, Oe [11] oraz Schachta i wsp. [10] niska ekspresja podoplaniny może być zatem charakterystyczna dla nabłonkowego raka jajnika. Skorelowanie poziomu jej ekspresji z danymi klinicznymi, takimi jak odpowiedź na chemioterapię, czas przeżycia i obecność przerzutów do węzłów chłonnych, mogłaby wyjaśnić potencjalną funkcję tego genu w nowotworzeniu jajnika.

Dotychczasowe badania nad rolą podoplaniny w karcynogenezie narządów rodnych skorelowały jej niską ekspresję z progresją raka, obecnością przerzutów do węzłów chłonnych, nawrotem choroby i niekorzystną diagnozą, szczególnie w raku endometrium, wysoko zaawansowanym płaskonabłonkowym raku szyjki macicy oraz płaskonabłonkowym raku płuc [9, 12–14]. Niska ekspresja podoplaniny w raku jajnika, uznanego markera limfangiogenezy, może świadczyć, iż do przerzutowania tego nowotworu dochodzi na innej drodze, bez udziału naczyń limfatycznych. Do podobnych wniosków doszli Sundar i wsp., badając rolę genów (m.in. Lyve-1) zaangażowanych w limfangiogenezę [15]. Nie zanotowano także różnic w ekspresji podoplaniny w odniesieniu do FIGO, stopnia dojrzałości guza czy też statusu menopauzalnego. Ekspresja podoplaniny nie wydaje się zatem regulowana hormonalnie i jej wpływ na nowotworzenie jajnika może być niezależny od statusu menopauzalnego.

Wnioski

Obniżona ekspresja podoplaniny jest charakterystyczna dla surowiczego i śluzowego raka jajnika.

Praca została sfinansowana z grantu KBN N N407 172434.

Praca powstała z wykorzystaniem sprzętu zakupionego w ramach projektu „Wyposażenie innowacyjnych laboratoriów prowadzących badania nad nowymi lekami stosowanymi w terapii chorób cywilizacyjnych i nowotworowych” w ramach Programu Operacyjnego Rozwój Polski Wschodniej 2007–2013, Osi priorytetowej I Nowoczesna Gospodarka, Działania I.3 Wspieranie Innowacji.

Piśmiennictwo

1. Sankaranarayanan R, Ferlay J. Worldwide burden of gynaecological cancer: the size of the problem. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol 2006; 20: 207-25.

2. Pectasides D, Fountzilas G, Aravantinos G, et al. Epithelial ovarian car­cinoma in younger vs older women: is age an independent prognostic factor? The Hellenic Oncology Cooperative Group experience. Int J Gyne­col Cancer 2007; 17: 1003-10.

3. Vo C, Carney ME. Ovarian cancer hormonal and environmental risk effect. Obstet Gynecol Clin North Am 2007; 34: 687-700.

4. Nagahashi M, Ramachandran S, Rashid OM, Takabe K. Lympha­ngio­genesis: a new player in cancer progression. World J Gastroenterol 2010; 16: 4003-12.

5. Raica M, Cimpean AM, Ribatti D. The role of podoplanin in tumor progression and metastasis. Anticancer Res 2008; 28: 2997-3006.

6. Yu H, Gibson JA, Pinkus GS, Hornick JL. Podoplanin (D2-40) is a novel marker for follicular dendritic cell tumors. Am J Clin Pathol 2007; 128: 776-82.

7. Müller AM, Franke FE, Müller KM. D2-40: a reliable marker in the diagno­sis of pleural mesothelioma. Pathobiology 2006; 73: 50-4.

8. Kato Y, Kaneko M, Sata M, et al. Enhanced expression of Aggrus (T1alpha/ podoplanin), a platelet-aggregation-inducing factor in lung squamous cell carcinoma. Tumour Biol 2005; 26: 195-200.

9. Dumoff KL, Chu CS, Harris EE, et al. Low podoplanin expression in pre­treatment biopsy material predicts poor prognosis in advanced-stage squamous cell carcinoma of the uterine cervix treated by primary radiation. Mod Pathol 2006; 19: 708-16.

10. Schacht V, Dadras SS, Johnson LA, et al. Up-regulation of the lymphatic marker podoplanin, a mucin-type transmembrane glycoprotein, in human squamous cell carcinomas and germ cell tumors. Am J Pathol 2005; 166: 913-21.

11. Oe S, Hasegawa K, Nagase S, et al. Expression of podoplanin in epithe­lial ovarian carcinomas and its potential as a marker for clear cell ade­nocarcinoma. Int J Gynecol Pathol 2010; 29: 405-10.

12. Kawamura L, Carvalho FM, Alves BG, et al. Association between intra­tumoral lymphatic microvessel density (LMVD) and clinicopathologic features in endometrial cancer: a retrospective cohort study. World J Surg Oncol 2010; 8: 89.

13. Ito T, Ishii G, Nagai K, et al. Low podoplanin expression of tumor cells predicts poor prognosis in pathological stage IB squamous cell carcinoma of the lung, tissue microarray analysis of 136 patients using 24 antibodies. Lung Cancer 2009; 63: 418-24.

14. Suzuki H, Onimaru M, Koga T, et al. High podoplanin expression in cancer cells predicts lower incidence of nodal metastasis in patients with lung squamous cell carcinoma. Pathol Res Pract 2011; 207: 111-5.

15. Sundar SS, Zhang H, Brown P, et al. Role of lymphangiogenesis in epi­thelial ovarian cancer. Br J Cancer 2006; 94: 1650-7.