WPROWADZENIE DO METODYKI BADAŃ IMMUNOPATOLOGICZNYCH
Badania histopatologiczne, w części przypadków uzupełnione o techniki immunohistochemiczne, stanowią podstawę diagnostyki większości chorób skóry. Materiałem do badań są utrwalone chemicznie wycinki skóry, co powoduje uszkodzenie antygenów i immunoglobulin, uniemożliwiając wykrywanie zjawisk immunologicznych. Wprowadzenie do diagnostyki mikroskopowej metody immunofluorescencji wykorzystującej nieutrwalone chemicznie zamrożone wycinki stworzyło podwaliny nowoczesnej immunopatologii. Te same preparaty można badać również technikami o wyższej rozdzielczości, takimi jak mikroskopia konfokalna czy immunomikroskopia elektronowa. Metody te są używane w wybranych, trudnych diagnostycznie przypadkach. Technikę immunofluorescencji można również wykorzystywać do wykrywania przeciwciał krążących (metoda pośredniej immunofluorescencji). Oprócz badań oceniających morfologię i ultrastrukturę tkanek, stosuje się również metody umożliwiające charakterystykę biochemiczną autoprzeciwciał krążących (metoda podwójnej immunodyfuzji, metoda ELISA, western blot, radioimmunoprecypitacja). Postęp badań molekularnych pozwolił na otrzymywanie metodami inżynierii genetycznej pełnych antygenów lub ich wybranych epitopów, co znacznie poszerzyło możliwości diagnostyczne w chorobach skóry.
Materiałem do badań immunopatologicznych są nieutrwalone chemicznie wycinki tkankowe, w których wykrywa się zjawiska immunologiczne zachodzące w skórze, oraz surowice, w których poszukuje się autoprzeciwciał krążących.
BADANIA TKANKOWE
Metoda immunofluorescencji bezpośredniej
Metoda immunofluorescencji bezpośredniej (ang. direct immunofluorescence – DIF) jest podstawową techniką immunopatologiczną polegającą na wykrywaniu w wycinkach pobranych od chorego ludzkich immunoglobulin związanych in vivo za pomocą immunosurowic zwierzęcych znakowanych fluorochromami. Ma ona podstawowe znaczenie w diagnostyce autoimmunologicznych chorób pęcherzowych (ryc. A, B), a także jest przydatna w diagnostyce tocznia rumieniowatego (ang. lupus band test), liszaja płaskiego, przewlekłego nadżerkowego zapalenia jamy ustnej, plamicy hiperergicznej oraz porfirii skórnej późnej.
Immunomikroskopia elektronowa bezpośrednia
Immunomikroskopia elektronowa bezpośrednia, ze względu na czasochłonność metody, nie jest wykorzystywana rutynowo, natomiast może mieć znaczenie rozstrzygające w trudnych diagnostycznie przypadkach.
BADANIA SUROWIC
Metoda immunofluorescencji pośredniej
Metoda immunofluorescencji pośredniej (ang. indirect immunofluorescence – IIF) jest podstawową techniką immunopatologiczną służącą do wykrywania w surowicach pacjentów autoprzeciwciał krążących. W metodzie tej w pierwszym etapie wykorzystuje się skrawki prawidłowej tkanki (standardowo przełyk człowieka), jako tzw. substrat antygenowy do reakcji z przeciwciałami, a w drugim etapie przeciwciała te wykrywa się podobnie jak w metodzie DIF. Metoda IIF jest badaniem zarówno jakościowym (jak DIF), jak i ilościowym, ponieważ reakcje przeprowadza się, używając wielu rozcieńczeń badanych surowic (1 : 10, 1 : 20 itd.), co pozwala na określenie miana stwierdzanych przeciwciał (ostatnie dodatnie rozcieńczenie). Stosując metodę IIF, wykrywa się różne przeciwciała: pęcherzycowe, przeciwciała skierowane przeciwko błonie podstawnej, przeciwciała przeciwjądrowe (ang. antinuclear antibody – ANA), przeciwciała skierowane przeciw endomysium mięśni gładkich (ryc. C) i inne.
W szczególnych przypadkach stosuje się inne substraty (np. przełyk świnki morskiej, pęcherz moczowy szczura – patrz część szczegółowa). Obecnie do wykrywania ANA coraz częściej rutynowo stosuje się komórki Hep 2 (ryc. D), natomiast przeciwciała przeciw natywnemu DNA wykrywa się na komórkach wiciowca Crithidium lucillae. Technikę IIF wykorzystuje się ponadto do diagnostyki genodermatoz.
Metoda immunoblotu
Metoda immunoblotu (ang. western immunoblot – WIB) umożliwia biochemiczną charakterystykę antygenu rozpoznawanego przez autoprzeciwciała. Potencjalnie jest czulsza od metody IIF, jednak nie pozwala na wykrywanie antygenów (białek) w stanie natywnym na skutek wynikającej z preparatyki denaturacji białek. Z tego powodu niektóre surowice mogą być dodatnie w metodzie IIF, a ujemne w metodzie WIB i odwrotnie. Jednoczesne wykonywanie badań obiema metodami nie tylko zwiększa czułość wykrywania autoprzeciwciał, ale także umożliwia ich różnicowanie. Metoda WIB jest techniką skomplikowaną i nie mogłaby być stosowana w rutynowej diagnostyce immunopatologicznej, dlatego od kilku lat uruchomiono produkcję komercjalnie dostępnych tzw. kitów laboratoryjnych, w postaci gotowych pasków nitrocelulozowych z już naniesionymi antygenami (np. testy Euroline), które coraz częściej są wykorzystywane w badaniach rutynowych.
Radioimmunoprecypitacja
Zasada metody radioimmunoprecypitacji (RIP) jest podobna do WIB, z tą zasadniczą różnicą, że reakcja przeciwciał z rozpuszczalnymi antygenami zachodzi przed denaturacją białek i elektroforezą. Metoda ta – w przeciwieństwie do WIB – pozwala na ocenę natywnych antygenów. Do wykrywania produktów reakcji immunologicznej stosuje się izotopy, a nie enzymy jak w WIB, co zwiększa czułość metody RIP, ale utrudnia jej stosowanie w rutynowej diagnostyce. Obecnie tylko nieliczne laboratoria immunopatologiczne posługują się rutynowo tą metodą.
Immunodyfuzja
Jest to metoda wykorzystywana do identyfikacji ANA. Surowice od chorych nanosi się do przygotowanych w żelu agarowym otworów i bada wobec ekstraktu grasiczego zawierającego rozpuszczalne antygeny jądrowe (ang. extractable nuclear antygen – ENA) w stanie natywnym. Przeciwciała obecne w surowicy dyfundują w żelu i – napotykając dyfundujące z otworu centralnego antygeny jądrowe – precypitują (tj. tworzą nierozpuszczalne kompleksy antygen–przeciwciało), co jest widoczne w postaci linii. Pojawienie się linii świadczy o obecności w surowicy przeciwciał. Aby dokonać ich identyfikacji, stosuje się, obok surowicy badanej, surowicę kontrolną zawierającą zidentyfikowane przeciwciała (metoda podwójnej immunodyfuzji, ang. double immunodiffusion – DID) i ocenia się zgodność linii precypitacyjnych surowic badanych z surowicami kontrolnymi (ryc. E).
Metoda ELISA
Metoda ELISA (ang. enzyme-linked immunoabsorbent test) umożliwia wykrywanie i identyfikację przeciwciał oraz wymaga stosowania wysoko oczyszczonych antygenów, co stanowi pewne ograniczenie w stosowaniu jej w rutynowej diagnostyce immunopatologicznej. Wartość diagnostyczna tej metody systematycznie się zwiększa i obecnie jest ona rutynowo stosowana (komercjalnie dostępne kity) w większości laboratoriów na świecie do diagnostyki pęcherzycy, różnych postaci pemfigoidu, choroby Duhringa, enteropatii glutenozależnej oraz do identyfikacji niektórych antygenów jądrowych, np. antygenu centromerowego CENP-B. Wyniki podaje się w formie indeksu, który określa się zgodnie z zaleceniami producenta testu.
Opracowali:
prof. dr hab. n. med. Maria Błaszczyk
prof. dr hab. n. med. Cezary Kowalewski
