Polymorphisms in hOGG1 i XRCC1 DNA repair genes in endometrial cancer

Wstęp
W wielu krajach rejestruje się stały wzrost liczby chorych na raka błony śluzowej jamy macicy, w związku z czym choroba ta staje się poważnym problemem diag-nostycznym i terapeutycznym. Rocznie odnotowuje się na świecie 150 tys. nowych zachorowań na raka endometrium (najwyższy wskaźnik zachorowalności we Flandrii, region Varese – 247/100 tys., 21 w USA, 2,7 w Japonii) [1]. W Polsce rejestruje się rocznie ok. 120 tys. nowych zachorowań na nowotwory złośliwe, a z powodu choroby nowotworowej umiera ponad 80 tys. pacjentów, w tym dzieci i osoby młode. Od kilkudziesięciu lat obserwuje się w Polsce stały wzrost zachorowalności na raka błony śluzowej macicy (1963 r. – 4,2/100 tys., 1978 r. – 8,3/100 tys., 1989 r. – 8,5/100 tys., 2004 r. – 13,37/100 tys.), trzecie miejsce po raku piersi – 40,65/100 tys. i płuca 13,88/100 tys. Powstanie raka błony śluzowej jamy macicy jest uwarunkowane synergistycznym oddziaływaniem wielu czynników. Udział niektórych z nich w kancerogenezie został jednoznacznie potwierdzony i uznany przez środowisko medyczne, nad innymi wciąż trwają dyskusje i badania, dostarczające niekiedy rozbieżnych informacji. Określenie roli poszczególnych czynników w etiologii raka endometrium przysparza wiele trudności, przede wszystkim ze względu na ich jednoczesne występowanie u danej pacjentki. Do najczęściej wymienianych czynników ryzyka rozwoju raka trzonu macicy zalicza się czynniki środowiskowe, hiperestrogenizm, otyłość, cukrzycę, nadciśnienie, wiek oraz indywidualne predyspozycje. Utrzymanie integralności genomowego DNA jest warunkiem koniecznym do prawidłowego funkcjonowania komórki. Zaburzenia struktury genomu mogą przyczyniać się do rozwoju wielu nowotworów złośliwych, w tym raka endometrium. Polimorfizm genów naprawczych może wpływać na różnice w sprawności usuwania uszkodzeń materiału genetycznego, a tym samym kształtować podatność na rozwój choroby nowotworowej [2–5]. Dane literaturowe wskazują, że zaburzenia w naprawie DNA są związane z ryzykiem powstania raka endometrium, które może korelować z wariantami polimorficznymi genów naprawy [6]. Zidentyfikowano ponad 130 genów naprawy DNA, w których odkryto wiele polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (ang. single nucleotide polymorphism – SNP) [7, 8]. Aby zdefiniować rolę, jaką mogą odgrywać te warianty w modulowaniu ryzyka wystąpienia raka, należy określić ich znaczenie funkcjonalne. Zmienność w genach naprawy DNA może zostać wykorzystana klinicznie, w tym do oceny ryzyka wystąpienia danego rodzaju raka, jego prewencji i terapii. W pracy analizowano polimorfizm Ser326Cys genu hOGG1 i Arg399Gln genu XRCC1 u chorych na raka endometrium.
Materiały i metody

Pacjentki
Badaniom poddano kobiety (n=150) w wieku 55–82 lat (średnia wieku ± SD 68,8±6,68 roku), u których stwierdzono raka endometrium. Materiał do badań w postaci próbek krwi pobranej na cytrynian został uzyskany od każdej pacjentki. Wszystkie nowotwory sklasyfikowano wg kryteriów ustalonych przez FIGO (International Federation of Gynaecology and Obstetrics). Grupę kontrolną stanowiły kobiety (n=129), u których nie stwierdzono występowania choroby nowotworowej. Izolowanie DNA Krew pobierano na EDTA jako antykoagulant. DNA izolowano z krwi przy użyciu zestawu QIAamp (Qiagen, Hilden, Niemcy) zgodnie z zaleceniem producenta. W procedurze tej przeprowadzano lizę komórek krwi, a białka jądrowe usuwano poprzez trawienie proteinazą K. Uzyskane próbki DNA przechowywano w temp. –20°C. Analiza polimorfizmu Ser326Cys genu hOGG1 Do badań polimorficznych wariantów wybranych genów naprawy DNA stosowano metodę PCR-RFLP (ang. polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism). Polega ona na powieleniu wybranego fragmentu genu zawierającego miejsce polimorficzne w łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) i poddaniu uzyskanego produktu inkubacji z odpowiednio dobraną endonukleazą restrykcyjną, rozpoznającą specyficzną sekwencję w jednym z wariantów polimorficznych badanego genu. Zawierający ją produkt PCR zostaje przecięty na fragmenty, natomiast drugi wariant pozostaje integralny. Polimorfizm Ser326Cys genu hOGG1 był określany poprzez reakcję PCR-RFLP ze starterami o następujących sekwencjach: 5’GGAAGGTGCTTGGGGAAT3’, 5’ACTGTCACTAGTCTCACCAG3’. Reakcja PCR przeprowadzona była w termocyklerze Perkin-Elmer/Gene Amp, PCR System 2400 thermal cycler. Mieszanina reakcyjna (25 µl) składała się z 5 ng genomowego DNA, 0,2 mmol każdego ze starterów (ARK Scientific GmbH Biosystems, Darmstad, Germany), 2,5 mM MgCl2, 1 mM dNTP i 1 j.m. polimerazy Taq (Qiagen GmbH, Hilden, Germany). Warunki reakcji PCR były następujące: • 95°C – 5 min (denaturacja wstępna), • 95°C – 30 s, • 57°C – 30 s, • 72°C – 1 min, • 2→3→4 × 35 cykli, • 72°C – 7 min (dokończenie syntezy). Po trawieniu enzymem restrykcyjnym SatI przez 2 godz. w temp. 37°C amplifikowane fragmenty DNA rozdzielane były w 7-procentowym żelu poliakryloamidowym i po barwieniu bromkiem etydyny obserwowane w świetle UV. Każda próbka przypisywana była do jednego z trzech genotypów: Ser/Ser, Ser/Cys lub Cys/Cys. Analiza polimorfizmu Arg399Gln genu XRCC1 Polimorfizm Arg399Gln genu XRCC1 był określany przez reakcję PCR-RFLP ze starterami o następujących sekwencjach: 5’CAAGTACAGCCAGGTCCTAG3’ 5’CCTTCCCTCATCTGGAGTAC3’. Reakcja PCR przeprowadzona była w termocyklerze Perkin-Elmer/Gene Amp, PCR System 2400 thermal cycler. Mieszanina reakcyjna (25 ml) składała się z 5 ng genomowego DNA, 0,2 mmol każdego ze starterów (ARK Scientific GmbH Biosystems, Darmstad, Germany), 2,5 mM MgCl2, 1 mM dNTP i 1 j.m. polimerazy Taq (Qiagen GmbH, Hilden, Germany). Warunki reakcji PCR były następujące: • 95°C – 5 min, • 95°C – 20 s, • 58°C – 20 s, • 72°C – 20 s, • 2→3→4 × 35 cykli, • 72°C – 3 min. Po trawieniu enzymem restrykcyjnym BcnI przez 2 godz. w temp. 37°C amplifikowane fragmenty DNA rozdzielane były w 7-procentowym żelu poliakryloamidowym i po barwieniu bromkiem etydyny obserwowane w świetle UV. Każda próbka przypisywana była do jednego z trzech genotypów – Arg/Arg, Arg/Gln lub Gln/Gln. Analiza statystyczna Rejestrowana liczba każdego z genotypów była porównywana z liczbą oczekiwaną na podstawie prawa Hardy’ego-Weinberga z użyciem testu c2. Istotność różnic pomiędzy częstościami występowania alleli i genotypów dla poszczególnych grup oceniana była testem c2; p<0,05 było określane jako wynik statystycznie znaczący.
Wyniki
W tab. I przedstawiono rozkład genotypów polimorfizmu Ser326Cys genu hOGG1 w grupie chorych na raka endometrium i w grupie kontrolnej. Oba rozkłady nie różniły się znacząco (p>0,05) od rozkładu przewidywanego przez prawo Hardy’ego-Weinberga. Nie stwierdzono różnic w częstościach występowania alleli Ser i Cys pomiędzy pacjentami i kontrolą. W tab. II zaprezentowano rozkład genotypów Arg399Gln genu XRCC1 w grupie chorych na raka endometrium i w grupie kontrolnej. Oba rozkłady nie różniły się znacząco (p>0,05) od rozkładu przewidywanego przez prawo Hardy’ego-Weinberga. Nie stwierdzono różnic w częstościach występowania alleli Arg i Gln pomiędzy pacjentami i kontrolą. Nie było statystycznie istotnych różnic pomiędzy rozkładami genotypów w grupach o różnym stopniu zaawansowania nowotworu a rozkładem przewidywanym przez prawo Hardy’ego-Weinberga (p>0,05). Nie stwierdzono różnic w częstościach alleli Ser i Cys oraz Arg i Gln pomiędzy badanymi grupami (p>0,05).
Dyskusja
Gen hOGG1 (8-oxoguanine glycosylase) koduje glikozylazę 8-oksoguaniny, białka uczestniczącego w szlaku naprawy DNA BER. Znajduje się na chromosomie 3 (3p26.2), zajmuje 16,68 kpz. Gen hOGG1 zawiera 8 eksonów, ostatni z nich występuje tylko w części transkryptów [9]. Gen OGG1 ma kilka miejsc polimorficznych [10]. Tranzycja C1245G (ekson 7 genu) powoduje podstawienie w pozycji 326 łańcucha polipeptydowego hOGG1 seryny cysteiną. Według niektórych badań nie wpływa ono na aktywność katalityczną enzymu (nie zaobserwowano różnic pomiędzy wariantami), jednak wg innych wariant 326Ser wykazuje znacząco większą zdolność naprawy uszkodzeń DNA niż 326Cys [11, 12]. Polimorfizm ten ma znaczenie epidemiologiczne, ponieważ obecność dwóch alleli 326Cys zwiększa ryzyko rozwoju kilku typów nowotworów [4, 10]. Gen XRCC1 (X-ray repair crosscomplementing group 1) koduje białko uczestniczące w szlaku naprawy DNA BER. Położony jest w chromosomie 19 (19q13.2), zajmuje ok. 31,9 kpz i zawiera 17 eksonów [13]. Ulega on ekspresji na wysokim poziomie i w różnych tkankach. Transkrypty podlegają alternatywnemu składaniu, przez co XRCC1 może kodować nawet 16 białek. Dotychczas stwierdzono istnienie 37 miejsc polimorficznych w obrębie genu XRCC1, 14 z nich powoduje zmianę kodowanego aminokwasu, a 4 występują w populacji z częstością 3% lub większą [14]. Trzy z nich (Arg194Trp, Arg280His i Arg399Gln) przebadano pod względem epidemiologicznym [4]. Allel 194Trp występuje w grupach kontrolnych badań epidemiologicznych z częstością 0,06–0,35 [4]. Według wyników uzyskanych w większości z nich już w układzie heterozygotycznym zmniejsza on ryzyko rozwoju nowotworów wielu typów, m.in. piersi, płuc i pęcherza [5, 15, 16]. Polimorfizm w pozycji 399 (ekson 10) związany jest z podstawieniem Arg→Gln w domenie BRCT I, wiążącej polimerazę poli (ADP-rybozy). W populacjach osób bez nowotworów (grupy kontrolne badań epidemiologicznych) częstość występowania allelu 399Gln wynosi 0,14–0,39. Polimorfizm ten może mieć wpływ na ryzyko rozwoju choroby nowotworowej, powodując zarówno jego wzrost, jak i spadek, w zależności od typu i lokalizacji raka [4]. Stwierdzono korelację między obecnością allelu 399Gln a poziomem uszkodzeń DNA i mutacji, jednak wg badań efektywności naprawy pęknięć jednoniciowych oba warianty cechuje zbliżona sprawność, polimorfizm Arg399Gln może więc mieć niewielki wpływ na domenę BRCT I i funkcjonowanie XRCC1 [17]. W przedstawionym w niniejszej pracy badaniu nie stwierdzono związku pomiędzy polimorfizmami Ser326Cys genu hOGG1 i Arg399Gln genu XRCC1 a rozwojem raka trzonu macicy. Wyniki sugerują, że polimorfizmy mogą nie być bezpośrednio związane z występowaniem i rozwojem raka endometrium, jednakże konieczne są badania większej populacji dla potwierdzenia tego przypuszczenia.
Piśmiennictwo
1. Inoue M, Okayama A, Fujita M, et al. A case-control study on risk factors for uterine endometrial cancer in Japan. Jpn J Cancer Res 1994; 85: 346-50. 2. Shia J, Ellis NA, Klimstra DS. The utility of immunohistochemical detection of DNA mismatch repair gene proteins. Virchows Arch 2004; 445: 431-41. 3. Shen MR, Jones IM, Mohrenweiser H. Nonconservative amino acid substitution variants exist at polymorphic frequency in DNA repair genes in healthy humans. Cancer Res 1998; 58: 604-8. 4. Goode EL, Ulrich CM, Potter JD. Polymorphisms in DNA repair genes and associations with cancer risk. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2002; 11: 1513-30. 5. Duell EJ, Millikan RC, Pittman GS, et al. Polymorphisms in the DNA repair gene XRCC1 and breast cancer. Cancer Epidemiol Biomark Prev 2001; 10: 217-22. 6. De Ruyck K, Wilding CS, Van Eijkeren M, et al. Microsatellite polymorphisms in DNA repair genes XRCC1, XRCC3 and XRCC5 in patients with gynecological tumors: association with late clinical radiosensitivity and cancer incidence. Radiat Res 2005; 164: 237-44. 7. Wood RD, Mitchell M, Sgouros J, Lindahl T. Human DNA repair genes. Science 2001; 291: 1284-9. 8. Ford BN, Ruttan CC, Kyle VL, et al. Identification of single nucleotide polymorphisms in human DNA repair genes. Carcinogenesis 2000; 21: 1977-81. 9. Ishida T, Hippo Y, Nakahori Y, et al. Structure and chromosome localization of human OGG1. Cytogenet Cell Genet 1999; 85: 232-6. 10. Kohno T, Shinmura K, Tosaka M, et al. Genetic polymorphisms and alternative splicing of the hOGG1 gene, that is involved in the repair of 8hydroxyguanine in damaged DNA. Oncogene 1998; 16: 3219-25. 11. Dherin C, Radicella JP, Dizdaroglu M, Boiteux S. Excision of oxidatively damaged DNA bases by the human alphahOGG1 protein and polymorphic alphahOGG1 (Ser326Cys) protein which is frequently found in human populations. Nucleic Acids Res 1999; 27: 4001-7. 12. Janssen K, Schlink K, Götte W, et al. DNA repair activity of 8oxoguanine DNA glycosylase 1 (OGG1) in human lymphocytes is not dependent on genetic polymorphism Ser326/Cys326. Mutat Res 2001; 486: 207-16. 13. Trask B, Fertitta A, Christensen M, et al. Fluorescence in situ hybridization mapping of human chromosome 19: cytogenetic band location of 540 cosmids and 70 genes or DNA markers. Genomics 1993; 15: 133-45. 14. Mohrenweiser H, Olsen A, Carrano A, Tynan K. Fluorescence in situ hybridization mapping of human chromosome 19: cytogenetic band location of 540 cosmids and 70 genes or DNA markers. Genomics 1993; 15: 133-45. 15. David-Beabes GL, London SJ. Genetic polymorphism of XRCC1 and lung cancer risk among African-Americans and Caucasians. Lung Cancer 2001; 34: 333-9. 16. Stern MC, Umbach DM, van Gils CH, et al. DNA repair gene XRCC1 polymorphisms, smoking, and bladder cancer risk. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2001; 10: 125-31. 17. Hu JJ, Mohrenweiser HW, Bell DA, et al. Symposium overrview: genetic polymorphisms in DNA repair and cancer risk. Toxicol Appl Pharmacol 2002; 185: 64-73.