Preliminary data concerning methodology of assessment of serum autoantibodies not included into CTS-s diagnostic criteria

Wprowadzenie

Autoimmunizacja, a więc występowanie autoprzeciwciał i limfocytów autoreaktywnych w surowicach pacjentów z układowymi chorobami tkanki łącznej, jest fenomenem występującym ze szczególnie dużym natężeniem w tzw. układowych chorobach tkanki łącznej, np. w toczniu trzewnym układowym (systemic lupus erythematosus – SLE), reumatoidalnym zapaleniu stawów (RZS), zespole Sjögrena [1, 2].
Autoprzeciwciała, szczególnie te z grupy tzw. przeciwciał przeciwjądrowych (ang. ANA), ze względu na wysoką swoistość w stosunku do określonych jednostek chorobowych, wartość prognostyczną oraz związek z chorobami układowymi zostały zaliczone do kryteriów diagnostycznych poszczególnych jednostek. Jednakże ze względu na mozaikowy typ odpowiedzi autoprzeciwciałowej w znacznej części surowic nie stwierdza się autoprzeciwciał markerowych – koniecznych czasem do postawienia diagnozy wg kryteriów ARA [3].
Niepowodzenia w diagnostyce przeciwciał markerowych są spowodowane przez wiele czynników.
W pracy pt. Podstawowe zasady racjonalnej serodiagnostyki autoprzeciwciał markerowych w układowych chorobach tkanki łącznej [4] zaproponowano pewien typ kompleksowego podejścia, nazwany metodą kaskadową oznaczania swoistości przeciwciał ANA, który eliminuje wiele przyczyn niepowodzeń w ustalaniu swoistości autoprzeciwciał markerowych, wynikających głównie ze składu antygenów testów.
Jednakże w ok. 20–25% przypadków w ogóle nie udaje się ustalić swoistości, pomimo nieraz wysoko pozytywnego wyniku testu ANA [5, 6]. W takich sytuacjach należy sięgnąć po identyfikację przeciwciał niewłączonych do kryteriów diagnostycznych, traktując je jako oznaczenie uzupełniające.
Przystępując do tego typu specjalnej procedury identyfikacyjnej, trzeba kierować się przede wszystkim typem świecenia (bądź wybarwienia w metodzie immunoperoksydazowej) ANA, ponieważ zawęża on zakres poszukiwanych autoprzeciwciał, a wiadomo, że określonemu typowi (ang. patterns) ANA odpowiada określona grupa autoprzeciwciał [1, 2].
Dodatkową istotną informacją byłyby dane kliniczne, które mogą wskazywać na określony typ schorzenia, ale nie spełniają kryteriów diagnostycznych. Jeśli zatem mamy do czynienia ze sprzecznością obrazu klinicznego i typu ANA, to należy wziąć pod uwagę możliwość przysłaniania miejsc wiązania przeciwciała swoistego i zmiany obrazu końcowego typu ANA. Istnieje zatem konieczność zastosowania sorbentu (lub sorbentów), np. ekstraktów grasiczych (RTE – ang. rabbit thymus extract) czy śledzionowych (BSE – ang. bovine spleen extract), które są bogate w określone typowe autoantygeny. RTE zawiera np. kilka podstawowych antygenów, określanych jako antygeny ENA (ang. extractible nuclear antigen), takich jak Sm, RNP, SSA i B, Scl-70, i ślady wielu innych, np. Jo-I [7, 8].
Celem pracy było sprawdzenie, czy zastosowanie do surowic (ANA-dodatnich – o nieustalonej swoistości) techniki neutralizacji ekstraktami antygenu ENA (grasiczymi lub śledzionowymi) pozwoli na ustalenie swoistości występujących autoprzeciwciał z grupy autoprzeciwciał tzw. pomocniczych, co mogłoby być użyteczne w diagnostyce różnicowej układowych chorób tkanki łącznej.


Materiał i metody

Do badań użyto surowice pobrane od 8 pacjentów klinik IR, przesłane do Zakładu Mikrobiologii i Serologii w celu oznaczenia przeciwciał ANA oraz wytypowania swoistości. W tych surowicach, pomimo dodatniego wyniku testu ANA, nie udało się ustalić swoistości przeciwciał.
W surowicach wykonano oznaczenie przeciwciał ANA metodą Colorzyme z zastosowaniem komórek Hep-2 na zestawach firmy Immuno Concepts (USA). Typowanie swoistości wykonywano testami paskowymi DOT-blot firmy Biomedica oraz w miarę potrzeb testem Western-blotting Euroline W.B. firmy Euroimmun. Oznaczenie przeciwciał dla natywnego DNA wykonywano testem ELISA (Varelisa firmy HVD Holding) oraz na szkiełkach z utrwalonymi pierwotniakami Critidia luciliae firmy Immuno Concepts (USA). Oznaczanie przeciwciał dla NuHi wykonywano testem ELISA Aeskulisa firmy Pointe Scientific Polska. Oznaczenia pozostałych przeciwciał, tj. przeciwciał dla ssDNA, RNA, histonów, ubikwityny, HMG oraz Ku, wykonywano wg procedur ELISA dopracowanych w Zakładzie Mikrobiologii i Serologii IR z zastosowaniem wysoko oczyszczonych antygenów: histonu pełnego i frakcji, ssDNA, RNA i ubikwityny (wszystkie firmy Fluka).
Preparat pełnego (częściowo oczyszczonego) HMG, użytego w teście ELISA, uzyskano z grasicy cielęcej wg metody Goodwina i wsp. [9], w której wykorzystano jako czynnik strącający białka 2% kwas trójchlorooctowy (TCA), w którym białka HMG są rozpuszczalne.
Neutralizację surowic ekstraktami RTE oraz BSE wykonano wg własnej procedury.
Surowicę rozcieńczoną, tak by dawała wyraźny i czytelny typ ANA (zwykle 1–2 rozcieńczenia poniżej miana końcowego), mieszano ze standaryzowanymi ekstraktami grasiczymi i śledzionowymi (RTE i BSE) w stosunku 1:1 i inkubowano 3 godz. w temperaturze 37°C,
a następnie przez noc w temperaturze 4°C. Po inkubacji
surowice wirowano przy 10 000 obrotów/min przez
20 min i używano do oznaczania miana i typu ANA.
Standaryzacja preparatów BSE i RTE polegała na dodawaniu zawsze tych samych ilości białka w ekstraktach, a ponadto drogą neutralizacji testów Western-blotting ustalano, czy zawierają one podstawowe typowe antygeny ENA, czyli Sm, RNP, Ro, La, Scl-70 i Jo-I.


Wyniki

We wszystkich 8 surowicach ANA-dodatnich, tam gdzie nie udało się ustalić swoistości autoprzeciwciał klasycznymi metodami (po ustaleniu końcowego miana przeciwciał przeciwjądrowych) przystąpiono do typowania swoistości wg klasycznego schematu, zakładając, że określonemu typowi wybarwienia w technice immunoperoksydazowej odpowiada określony zestaw autoprzeciwciał [1, 2, 4], z uwzględnieniem dodatkowych procedur opublikowanych uprzednio, a służących do określania swoistości autoprzeciwciał dla podtypów (ang. fine specificities) autoantygenów, a następnie do oznaczania autoprzeciwciał niezaliczanych do kryteriów diagnostycznych układowych chorób tkanki łącznej.
Sumaryczne zestawienie danych uzyskanych w wyniku zastosowania procedur wszystkich trzech stopni, tj. ustalenia obecności autoprzeciwciał zakwalifikowanych do kryteriów oraz ich podtypów i autoprzeciwciał niezaliczanych, przedstawiono w tab. I.
Surowica nr 1 miano ANA 1/1280 typ homogenno-plamisty. Wynik testu na obecność dsDNA oraz testu DOT-blott negatywny, także wynik testu Western-blott bazującego na pełnym ekstrakcie komórki Hep-2 również ujemny. Ponieważ identyfikacja swoistości została wykonana na testach zawierających wszystkie główne podtypy autoantygenów dających plamisty typ ANA, pozostała zatem identyfikacja antygenów dających homogenny typ ANA (z wyjątkiem anty-dsDNA już wykonanego) oraz sprawdzenie, czy w pełnych ekstraktach z grasicy króliczej i śledziony bydlęcej nie występują rzadsze autoantygeny białkowe, które mogą w teście neutralizacji spowodować zanik lub osłabienie miana testu ANA. I rzeczywiście, w przypadku obu ekstraktów (RTE i BSE) uzyskano neutralizację odczynu ANA, co oznacza, że są w nich autoantygeny neutralizujące przeciwciała odpowiedzialne za homogenno-plamisty typ ANA. Przykładowe efekty neutralizacji surowicy pacjenta nr 1 przedstawiono na ryc. 1.
Wykonano zatem oznaczenie metodą ELISA następujących autoprzeciwciał (dających homogeny typ ANA): anty-NuHi, anty-histon – pełny, anty-HMG – pełne, przeciw ubikwitynie oraz anty-ssDNA i anty-RNA. Testem ELISA wykazano obecność słabo dodatnich poziomów przeciwciał dla ubikwityny.
W przypadku surowicy pacjenta nr 2 przy zastosowaniu analogicznej procedury, jak w przypadku pacjenta nr 1 nie udało się zidentyfikować swoistości ANA, ponieważ surowica ta wykazuje typową dla wielu surowic w przypadku układowych chorób tkanki łącznej wieloswoistość, polegającą na występowaniu (np. w teście Western-blott) podprogowych poziomów autoprzeciwciał dla wielu autoantygenów. Jest to prawdopodobnie wynik poliklonalnej stymulacji układu immunologicznego, np. przez superantygeny bakteryjne czy wirusowe.
W surowicach trzech dalszych pacjentów (nr 3–5) – wszystkie testy ANA wysoko dodatnie (miano 1/1280 o typie homogenno-plamistym), również nie ustalono swoistości ANA, a po wykonaniu dodatkowych testów w kierunku przeciwciał dających homogenno-plamisty typ ANA stwierdzono:
• w surowicy pacjenta nr 3 podprogowe poziomy przeciwciał dla NuHi i ubikwityny, wykonany zaś test Western-blott na pełnym ekstrakcie komórek Hep-2 wykazał obecność jednego prążka o ciężarze cząsteczkowym 86 kD (charakterystycznego dla przeciwciał anty-Ku),
• w surowicy pacjenta nr 4 wykazano tylko obecność przeciwciał dla nukleohistonu (NuHi),
• w surowicy pacjenta nr 5 obok podprogowych poziomów przeciwciał dla NuHi wykazano obecność przeciwciał dla obu izotopów antygenu Ku (o ciężarze cząsteczkowym 86 i 72 kD).

Wymienione wyżej 3 surowice o typie ANA homogenno-plamistym wykazywały osłabienie natężenia odczynu ANA (w teście Colorzyme) po neutralizacji pełnymi ekstraktami RTE i BSE – w przypadku surowic pacjentów nr 3 i 5 tylko osłabienie, a w przypadku surowicy pacjenta nr 4 także zmianę typu ANA z homogenno-plamistego na jąderkowy (co może być cenną wskazówką kliniczną).
Pozostałe 3 surowice pacjentów (nr 6–8) (ANA-dodatnie), także po neutralizacji RTE i BSE wykazały osłabienie intensywności odczynu ANA-Hep-2 (w technice Colorzyme), a surowica pacjenta nr 8 także wyraźną zmianę typu ANA (z homogenno-plamistych na jąderkowe). Nie wykazano w żadnej z nich obecności przeciwciał charakterystycznych dla antygenów chromatynowych, z wyjątkiem przeciwciał dla antygenu Ku (we wszystkich trzech surowicach), a w surowicy pacjenta nr 6 po neutralizacji wykazano obecność podprogowych poziomów przeciwciał dla izotypu antygenu U1snRNP o ciężarze cząsteczkowym 70 kD.

Dyskusja

We wszystkich 8 surowicach, w których klasyczną metodą ustalania swoistości, tj. najpierw wykonanie testu ANA (na komórkach Hep-2 metodą Colorzyme), a następnie wykonanie testu DOT-blott, umożliwiającego oznaczenie podstawowych autoprzeciwciał markerowych, nie udało się ustalić swoistości, wykonano zatem neutralizację surowic preparatami ekstraktów z grasicy króliczej oraz śledziony bydlęcej. W 7 na 8 (87%) surowic uzyskano wyraźne osłabienie natężenia (intensywności odczynu ANA w metodzie Colorzyme), a w 4 na 8 wyminusowanie odczynu ANA. Wstępne wyniki zastosowanej procedury (adsorpcja przeciwciał z grupy ENA) wskazują zatem, że może być ona użyteczna w przybliżonym ustalaniu przypuszczalnej swoistości autoprzeciwciał spoza głównego panelu autoprzeciwciał markerowych, a w każdym razie w istotny sposób zawęża zakres poszukiwań, co daje oszczędność w liczbie zużytych testów.
W 5 surowicach (o mianie średnim ANA 1/1280 i typie homogenno-plamistym) nie udało się ustalić swoistości przeciwciała pomocniczego tylko w przypadku surowicy wieloswoistej, tj. takiej, w której na DOT-blotach obserwuje się podprogowe poziomy autoprzeciwciał (z grupy przeciwciał markerowych), co może być wynikiem poliklonalnej stymulacji układu odpornościowego, np. przez superantygeny [10].
Słuszne (logiczne) okazało się także podążanie za dominującym typem świecenia, w przypadku ww.
5 surowic był to typ homogenny z nieznaczną domieszką plamistego, i poszukiwanie autoprzeciwciał dających homogenny typ wybarwienia ANA, a mianowicie przeciwciała przeciwko ssDNA i dsDNA, RNA, NuHi, nQ, białek HMG oraz antygenu Ku. Co istotne, w 3 przypadkach uzyskano identyfikację swoistości (patrz tab. I). Co prawda poziomy tych przeciwciał nie w pełni tłumaczą wysokie miano całkowite ANA (średnio 1/1280), ale prawdopodobnie w surowicach pacjentów oprócz przeciwciał o określonej swoistości oraz znacznej awidności, ewentualnie powinowactwie, występuje pula przeciwciał o małej awidności i/lub powinowactwie, które mogą maskować typ świecenia poprzez wiązanie się z substratem (antygenem) na komórkach Hep-2, jednocześnie zwiększając miano całkowite ANA.
Będzie to przedmiotem dalszych badań, czy pule wyżej opisanych autoprzeciwciał występują w tych surowicach i czy zmiana warunków odczynu na dyskryminujące przeciwciała o małym powinowactwie/awidności będzie miała istotny wpływ na częstość (%) wykrywania autoprzeciwciał, a zmiana warunków (zwłaszcza siły jonowej) spowoduje dodatkowo eliminację autoprzeciwciał maskujących, co jest istotne w diagnostyce różnicowej swoistości autoprzeciwciał. Jest to prawdopodobne, ponieważ – wg wiedzy autorów – tylko w opisach niektórych testów służących do oznaczania przeciwciał dla dsDNA są notki, że test służy do oznaczania przeciwciał o znacznym powinowactwie/awidności – charakterystycznym dla fazy zaostrzenia tocznia [8]. Pojawienie się po adsorpcji (neutralizacji) preparatów RTE i BSE ANA typu jąderkowego wskazywało na obecność przeciwciał o swoistości dla antygenów jąderkowych (np. Pm-Scl, Ku oraz atypowych RNA jąderkowych) [1, 2].
Zastosowanie testu typu Western-blott, opartego na pełnym ekstrakcie komórek Hep-2, pozwoliło
w 5 surowicach ustalić obecność przeciwciał dla antygenu Ku [11]. Jest to antygen chromatynowy, dla którego przeciwciała występują w ok. 19% aktywnego tocznia rumieniowatego układowego [1], choć występują także w zespole nakładania PM/DM i PM/twardzina [12].
Ograniczona liczebność badanej grupy surowic nie pozwala na wyciągnięcie jednoznacznych wniosków, ale prace są kontynuowane i autorzy sądzą, że zastosowanie specjalnej procedury pozwoli na rozstrzygnięcie przyczyn seronegatywności (co do swoistości autoprzeciwciał) przy wysokich mianach całkowitych ANA.
Podsumowując wyniki, należy stwierdzić, iż zastosowana procedura neutralizacji surowic ANA-wysoko dodatnich, w których ekstraktami płynów grasicy króliczej lub śledziony bydlęcej nie udaje się potwierdzić obecności autoprzeciwciał markerowych, pozwala na usunięcie przeciwciał przeciwko antygenom ENA, blokujących odczyn i odsłonięcie epitopów przeciwciał spoza panelu przeciwciał dla antygenu ENA, a to może mieć znaczenie przy diagnostyce różnicowej układowych chorób tkanki łącznej – w przypadku nieobecności markerów serologicznych.

Piśmiennictwo

1. von Muhlen CA, Tan EM. Autoantibodies in the diagnosis of systemic rheumatic diseases. Semin Arthritis Rheum 1995; 24: 323-58.
2. Manual of Biological Markers of Disease. van Venrooij WJ, Maini RN (eds). Kluwer Academic Publishers. Dordrecht, Boston, London 1994.
3. Dugawson CE, Nelson JL, Koepsell TD. Evaluation of the 1987 revised criteria for rheumatoid arthritis in a cohort a newly diagnostic female patients. Arthritis Rheum 1990; 33: 1042-6.
4. Ząbek J. Podstawowe zasady racjonalnej serodiagnostyki autoprzeciwciał markerowych w układowych chorobach tkanki łącznej. Reumatologia 2005; 43: 335-40.
5. Ząbek J. Przyczyny niepowodzeń w identyfikacji swoistości autoprzeciwciał ANA w surowicach pobranych od pacjentów z układowymi chorobami tkanki łącznej. Reumatologia 2004; 42: 416-26.
6. Ząbek J, Palacz A, Musiej-Nowakowska E i wsp. Porównanie wartości diagnostycznej przeciwciał dla nukleosomów z innymi markerami serologicznymi występującymi w toczniu rumieniowatym układowym. Reumatologia 2004; 42: 507-14.
7. Luft S. Wstęp. Podstawy i perspektywy diagnostyki serologicznej w reumatologii. W: Metody diagnostyki serologicznej w reumatologii. Luft S (red.). Wydawnictwo Naukowe PWN. Warszawa 1996: 9-32.
8. Puszczewicz M. Badania serologiczne w diagnostyce chorób reumatycznych. Nowa Klinika 2004; 9: 1193-8.
9. Goodwin GH i wsp. (cyt. za Gröbner S). Właściwości i funkcja białek niehistonowych o wysokiej ruchliwości elektroforetycznej. Postepy Biochem 1982; 28: 487-501.
10. Ząbek J. Metody wykrywania autoprzeciwciał „markerowych” w chorobach z autoimmunizacją. W: Immunologia kliniczna. Kowalski ML (red.). Mediton Oficyna Wydawnicza, Łódź 2000: 787.
11. Fritzler MJ. Autoantibodies in scleroderma. J Dermatol 1993; 20: 257-68.
12. Mimori T, Akizuki M, Yamagata H, et al. Characterization of a high molecular weight acidic nuclear protein recognized by autoantibodies in sera from patients with polymyositis-scleroderma overlap. J Clin Invest 1981; 68: 611-20.