Prognostic significance of CEBPA gene mutations in patients with acute myeloid leukemia

Wstęp

U ok. 55% dorosłych chorych na ostrą białaczkę szpikową (acute myeloid leukemia – AML) stwierdza się obecność zaburzeń cytogenetycznych w chwili rozpoznania choroby. Najczęściej występującymi aberracjami są: t(8;21)(q22;q22), t(15;17)(q22;q21), t(9;11)(p22;q23) oraz inv(16)(p13;q22). U prawie połowy chorych na AML analiza cytogenetyczna, prowadzona z wykorzystaniem standardowych technik, nie wykazuje jednak obecności aberracji chromosomowych. Ten typ AML definiowany jest jako „AML z prawidłowym kariotypem” (cytogenetically normal AML – CN-AML).

Obecnie wiadomo, że występowanie określonych zaburzeń cytogenetycznych jest ściśle powiązane z rokowaniem w tej grupie pacjentów [1]. Istotne znaczenie mają także niewielkie defekty molekularne, obejmujące pojedyncze geny, w tym m.in. NPM1, FLT3 oraz CEBPA [2].

Rola czynników transkrypcyjnych w procesie granulopoezy

W procesie różnicowania granulocytów uczestniczą dziesiątki genów. Misterna sieć zależności, które zachodzą między nimi, przekłada się na pełną synchronizację podziałów komórkowych, procesów różnicowania, dojrzewania i obumierania komórek. Dialog pomiędzy poszczególnymi elementami układu krwiotwórczego odbywa się za pośrednictwem cząsteczek białkowych, docierających do komórek hematopoetycznych poprzez odpowiednie receptory i kaskady sygnalizacyjne. Na poziomie międzykomórkowym mediatorami granulopoezy są cytokiny [wśród nich m.in. czynniki stymulujące formowanie kolonii (CSF) i interleukiny (IL)], które po związaniu z odpowiednimi receptorami na powierzchni komórek przekazują sygnał do ich wnętrza (zwykle w procesie fosforylacji lub defosforylacji kolejnego elementu szlaku transdukcji sygnału). Sygnał jest w cytoplazmie wielokrotnie wzmacniany poprzez aktywację kolejnych kinaz białkowych, by w końcu dotrzeć do ostatniego, „decyzyjnego” poziomu przekazywania informacji, tj. do poziomu czynników transkrypcyjnych, bezpośrednio kontrolujących ekspresję genów.

Wśród czynników transkrypcyjnych uczestniczących w procesie granulopoezy główną rolę odgrywają rodziny genów: Ets (E-twenty six), CBF (core binding factors), RAR (retinoic acid receptors), CEBP (CCAAT enhancer binding proteins). Te oraz inne liczne czynniki transkrypcyjne tworzą pomiędzy sobą funkcjonalną sieć powiązań, podtrzymującą homeostazę ekspresji reszty genów i siebie nawzajem.

Geny z rodziny Ets, m.in. PU.1, ERG, TEL1 i TEL2, przyłączają się do promotorów z motywem C/A GGA A/T. W granulopoezie centralną pozycję zajmuje czynnik PU.1, który wraz z CEBPA promuje ekspresję genów cytokin (CSF, IL), genów kodujących białka ziarnistości granulocytarnych, m.in. peroksydazy (MPO), elastazy neutrofilowej (NE), lizozymu oraz genów receptorów powierzchniowych [3–5]. Rola produktu białkowego genu ERG nie jest do końca poznana. Wykazano jednak, że jego podwyższona ekspresja jest związana z niekorzystnym rokowaniem u chorych cierpiących na AML i ostrą białaczkę limfoblastyczną (acute lymphoblastic leukemia – ALL) [6]. Do białek działających antagonistycznie należą hamujący proliferację komórek TEL1 i nasilający ten proces TEL2. Ich funkcja wydaje się powiązana z regulacją działania protoonkogenu c-Myc. Udział genu TEL1 w onkogenezie potwierdzają wyniki dotychczas przeprowadzonych badań u chorych na ostre białaczki. Obecność genu fuzyjnego TEL1-CBFB stwierdza się także u niektórych pacjentów z ALL [7, 8].

Czynnik CBF, heterodimeryczne białko złożone z podjednostek typu CBFA i CBFB, promuje m.in. ekspresję genu czynnika transkrypcyjnego PU.1 i pośrednio CEBPA, receptora dla makrofagowego czynnika wzrostu (M-CSFR), a także genów ważnych cytokin stymulujących różnicowanie i proliferację komórek linii granulocytarnej, w tym IL-3 i granulocytowo-makrofagowego czynnika wzrostu (GM-CSF). CBF wspólnie z czynnikiem c-Myb wzmacnia ekspresję genu mieloperoksydazy (MPO) i elastazy neutrofilowej (NE). Obecność aberracji chromosomowych z udziałem genów CBF (np. geny fuzyjne RUNX1-RUNX1T1, CBFB-MYH11, RUNX1-MDS1-EVI1) opisano u pacjentów z zespołem mielodysplastycznym (MDS) i AML [4, 9–11].

Receptory kwasu retynowego (retinoic acid receptors – RAR), głównie receptor  (RARA), uczestniczą w aktywacji czynników transkrypcyjnych CEBPA, CEBPB i CEBPE. Upośledzenie procesu transkrypcji CEBP w wyniku mutacji lub rearanżacji genu RARA może prowadzić do zatrzymania granulopoezy na etapie promielocytu. Wykazano, że u chorych na ostrą białaczkę promielocytową (acute promyelocytic leukemia – APL) z obecnym genem fuzyjnym PML-RARA dochodzi do obniżenia ekspresji genu czynnika transkrypcyjnego PU.1, współdziałającego z CEBPA [3, 12, 13]. W procesie różnicowania granulocytów szczególną rolę odgrywają białka z rodziny CEBP. Razem z czynnikiem transkrypcyjnym PU.1 dimery CEBP wzmacniają ekspresję części spośród białek granulocytów, m.in. receptorów cytokin G-CSF, GM-CSF, M-CSF, peptydów zawartych w ziarnistościach neutrofili (MPO, NE, lizozymu, MBN, LF, kolagenazy neutrofilowej). Jednocześnie CEBP są represorami ekspresji genów stymulujących erytropoezę, m.in. GATA-1 EPOR, FOG1, KLF1 oraz GFI1B. Działają one także hamująco na ekspresję czynników proliferacyjnych, w tym E2F, CDK2, CDK4 [4, 14].

Wewnątrzkomórkowe stężenie poszczególnych CEBP zmienia się stopniowo podczas rozwoju komórek mieloidalnych. W mieloblastach dominuje CEBPA, którego ekspresja stopniowo maleje na korzyść CEBPB w dojrzewających granulocytach, by zostać następnie wygaszona w komórkach dojrzałych, w których z kolei wzrasta poziom CEBPE. Zmiana ta sama w sobie jest modulatorem ekspresji genów efektorowych (ryc. 1.) [15].

Charakterystyka genu CEBPA

Gen CEBPA (CCAAT enhancer binding protein ) jest umiejscowiony na chromosomie 19 w rejonie q13.1. Nie ma intronów, a w obrębie pojedynczego egzonu wyróżniono 4 domeny funkcjonalne: dwie domeny transaktywacyjne (TAD1 i TAD2) odpowiedzialne za wzmacnianie transkrypcji, region podstawowy (basic) i zamek leucynowy (Zip), połączone w jedną domenę funkcjonalną bZip. Odpowiada ona za dimeryzację i wiązanie DNA. Produktami translacji genu CEBPA są dwa białka o masach 30 kDa i 42 kDa. Forma lżejsza, powstająca dzięki zapoczątkowaniu translacji dalej od 5’-końca mRNA, nie ma domeny TAD1 i nie aktywuje wydajnie transkrypcji. W komórkach o niezakłóconej hematopoezie proporcja obu izoform jest optymalna i zapewnia utrzymanie ekspresji genów efektorowych na poziomie odpowiednim dla danego etapu granulopoezy [16, 17]. Białko CEBPA wykazuje aktywność czynnika transkrypcyjnego jedynie w formie dimeru. Może to być homodimer izoformy 42 kDa lub heterodimer, w którego skład oprócz CEBPA 42 kDa wchodzi CEBPA 30 kDa lub inny członek rodziny białek CEBP. Poszczególne dimery formują się w komórkach na różnych etapach różnicowania i mają inne powinowactwo do elementów promotorowych z motywem CCAAT [18, 19].

Białko CEBPA występuje w największym stężeniu w początkowych stadiach rozwojowych komórek mieloidalnych. Wspólnie z PU.1 wiąże się z motywami wzmacniającymi ekspresję w regionie promotorowym kilkadziesiąt do kilkuset nukleotydów przed miejscem inicjacji transkrypcji [20]. Wciąż mało wiadomo na temat całkowitej liczby genów, których ekspresję bezpośrednio reguluje CEBPA. Na podstawie analizy motywów promotorowych wykonanych przez Cold Spring Harbor Laboratory (baza danych TRED – informacje zgromadzone w tej bazie pochodzą z analiz promotorów in silico i ich weryfikacji na podstawie dostępnych danych literaturowych) wytypowano 220 genów kontrolujących różne procesy fizjologiczne, których promotory zawierają sekwencje rozpoznawane przez CEBPA. Wśród nich 74 geny (33%) są zaangażowane w proces hematopoezy. Spośród genów ulegających ekspresji w komórkach krwiotwórczych 38 zostało zidentyfikowanych laboratoryjnymi metodami analizy promotorów. Reszta została wytypowana dzięki eksperymentom mikromacierzowym. Poza genami kodującymi białka, CEBPA kontroluje także gen miRNA-223, uczestniczący w odpowiedzi molekularnej na kwas retynowy [21].

Jako ważny element systemu regulacji procesu różnicowania granulocytów CEBPA podlega ścisłej, wieloetapowej kontroli na wszystkich etapach ekspresji. Dotąd zidentyfikowano 7 różnych mechanizmów na poziomie genomu, transkryptu i białka, zapewniających synchronizację aktywności CEBPA podczas procesu różnicowania mieloblastów. Zestawienie wymienionych mechanizmów regulacji przedstawiono w tabeli 1.

Mutacje CEBPA

Zgodnie z tzw. teorią dwóch uderzeń jedną z przyczyn wystąpienia AML jest pojawienie się w komórkach macierzystych szpiku szeregu defektów molekularnych. Mutacje w obrębie genów kontrolujących proliferację i procesy apoptozy (defekty klasy I) oraz mutacje genów odpowiedzialnych za inicjację i przebieg procesów różnicowania komórkowego (defekty klasy II) są przyczyną niekontrolowanego namnażania i dysplazji komórek [14, 30].

Mutacje genu kodującego czynnik transkrypcyjny CEBPA są zaliczane do defektów klasy II. Ich obecność prowadzi przede wszystkim do zaburzeń procesów różnicowania komórek hematopoetycznych oraz do zakłócenia funkcji komórkowych szlaków przekazywania sygnału. Mutacje CEBPA powodują także zaburzenia w procesach apoptozy i proliferacji. Sądzi się, że jest to wynikiem zmian w ekspresji genów klasy I, wywołanych przez obecność mutacji CEBPA [16, 30].

Opisano cały szereg mutacji genu CEBPA, zarówno punktowych, jak i insercyjno-delecyjnych. Ze względu na ich wpływ na ekspresję i funkcje białka można je zakwalifikować do jednej z trzech kategorii. Do pierwszej należą mutacje N-terminalne, powodujące zmianę ramki odczytu i przedwczesne za-koń­czenie procesu translacji, do drugiej – mutacje C-terminalne zachowujące ramkę odczytu, a do trzeciej – inne mutacje insercyjno-delecyjne i punktowe o dotychczas niescharakteryzowanym wpływie na funkcje CEBPA [16, 17].

Obecność mutacji N-terminalnych prowadzi do zaburzenia równowagi pomiędzy ilością izoformy 30 kDa i 42 kDa. Przedwczesna terminacja procesu translacji formy 42 kDa w jednej kopii genu przy niezakłóconej produkcji izoformy 30 kDa jest wynikiem zmiany ramki odczytu przed domeną TAD2. Prowadzi to do przesunięcia równowagi stechiometrycznej w syntezie CEBPA na korzyść mniej aktywnej izoformy 30 kDa. Skutkiem tego jest formowanie się nieaktywnych dimerów białka i w konsekwencji osłabienie ekspresji genów efektorowych [16, 17].

Mutacje C-końcowe to w większości przypadków duplikacje tandemowe lub insercje niezmieniające ramki odczytu. Stwierdzono także pojedyncze przypadki współwystępowania zmian delecyjnych i insercyjnych [31–33]. Mutacje te pojawiają się w obrębie domeny bZip, prowadząc do zakłócenia procesu wiązania DNA w obrębie zamka leucynowego lub do osłabienia dimeryzacji CEBPA. Zmniejszone powinowactwo CEBPA do DNA obniża efektywność promowania transkrypcji genów efektorowych, a tym samym ogranicza ich ekspresję [16]. W przypadku mutacji zarówno N-, jak i C-terminalnych zmiany sekwencji obejmują zwykle od kilku do kilkudziesięciu nukleotydów.

Mutacje CEBPA należące do trzeciej kategorii mogą wpływać w sposób pośredni na proces wzmacniania transkrypcji. Zakłócają one mechanizmy regulacji poziomu ekspresji i aktywność samego CEBPA.

Przystępując do analizy mutacji w obrębie genu CEBPA, należy pamiętać, że mutacje synonimiczne, znajdujące się poza miejscami wiązania miRNA, nie zaburzają funkcji białka i nie wywierają prawdopodobnie wpływu onkogennego. Zidentyfikowano również polimorfizmy (SNP oraz niewielkie duplikacje niezmieniające ramki odczytu), występujące w sposób naturalny w populacji ogólnej, które również nie mają wpływu na proces leukemogenezy [34, 35].

Mapa rozmieszczenia dotychczas poznanych defektów genu CEBPA umożliwiła wskazanie tzw. gorących miejsc mutacji (mutation hot spots), w których anomalie występują statystycznie najczęściej. Są to rejony: 160-460nt mRNA/50-350nt CDS, w którym dochodzi do mutacji N-terminalnych, oraz 1010-1060nt mRNA/900-950nt CDS, gdzie zlokalizowana jest większość mutacji C-terminalnych (w pracy wykorzystywane są koordynaty sekwencji o numerze akcesyjnym NM_004364) (ryc. 2.).

Metody wykrywania mutacji CEBPA

Duża heterogenność mutacji genu CEBPA, zarówno co do ich umiejscowienia, jak i charakteru, wyklucza diagnostyczne zastosowanie większości podstawowych narzędzi molekularnych. Tradycyjny rozdział elektroforetyczny produktów amplifikacji CEBPA nie pozwala na wykrycie mutacji pojedynczych nukleotydów oraz niewielkich mutacji insercyjno-delecyjnych. Obecnie najpopularniejszą metodą poszukiwania mutacji genu CEBPA jest sekwencjonowanie poprzedzone amplifikacją sekwencji kodującej techniką reakcji łańcuchowej polimerazy (polymerase chain reaction – PCR). Materiałem wyjściowym może być zarówno RNA, jak i DNA, ponieważ gen CEBPA jest jednoegzonowy. Najczęściej stosowaną techniką detekcji mutacji CEBPA jest metoda zaproponowana przez Pabsta i wsp., obejmująca reakcję PCR prowadzoną przy użyciu 4 par starterów. Uzyskane dzię­ki niej amplikony zawierają wszystkie domeny funkcjonalne, pozbawione są natomiast większości sekwencji 5’- i 3’-UTR. W metodzie tej w kolejnym etapie produkty PCR są oczyszczane i poddawane jedno- bądź obustronnemu sekwencjonowaniu [17].

Według doświadczeń autorów niniejszej pracy podczas wykonywania analizy wspomnianą metodą można napotkać na kilka problemów. Wysoka zawartość par GC utrudnia reakcję PCR, co zmusza do optymalizacji składu mieszaniny reakcyjnej poprzez użycie odczynników zwię­kszających topliwość DNA, takich jak DMSO lub betaina [36]. Z kolei trakty CGG i CCG występujące w rejonie 500-700nt transkryptu mogą zmniejszać w znaczący sposób wydajność znakowania nukleotydów podczas sekwencjonowania. W rzadkich przypadkach miejsca delecji w genie CEBPA mogą pokrywać się z miejscem przyłączania któregoś ze starterów, co prowadzi do braku jednego z produktów reakcji. W sytuacjach tych konieczne jest zastosowanie innej pary starterów PCR.

Wykrywanie mutacji CEBPA jest także możliwe za pomocą metod przesiewowych: wysoko sprawnej chromatografii cieczowej w warunkach denaturujących (dHPLC) [37], analizy krzywych topnienia o wysokiej rozdzielczości (high resolution melt – HRM) [38] oraz elektroforezy kapilarnej znakowanych fluorescencyjnie produktów PCR [39]. Analiza krzywych topnienia o wysokiej rozdzielczości oraz dHPLC pozwalają na wykrycie każdego typu mutacji. Rozdział metodą elektroforezy kapilarnej prowadzony wg protokołów dostępnych w literaturze umożliwia jedynie wykazanie obecności mutacji insercyjno-delecyjnych. Jest to istotna wada wymienionej metody, uniemożliwia ona bowiem wykrycie ok. 9% przypadków mutacji pojedynczego nukleotydu (wg COSMIC Trust Sanger Institute, tab. 2.). Obecność mutacji zidentyfikowanych metodą przesiewową należy w każdym przypadku potwierdzić za pomocą sekwencjonowania wg protokołu Pabsta. Ten sposób postępowania zmniejsza koszt wykonywania oznaczeń, ograniczając ich przeprowadzanie jedynie do przypadków z wysokim prawdopodobieństwem występowania defektu.

Znaczenie rokownicze CEBPA w ostrej białaczce szpikowej

Klasyfikacja AML zmienia się ustawicznie w ostatnich latach. Jest to spowodowane coraz lepszą znajomością molekularnego podłoża tej bardzo heterogennej choroby. W 2008 r. WHO wyodrębniła przypadki AML z mutacjami genu CEBPA jako osobną podkategorię w kategorii „Ostre białaczki szpikowe ze zdefiniowanymi anomaliami genetycznymi”. Obecność mutacji CEBPA została uznana za korzystny czynnik rokowniczy.

Renneville i wsp., analizując przypadki 638 chorych z AML, wykazali, że odsetek przypadków z mutacjami CEBPA wynosi 8% [40]. Na podstawie oceny wyników innych badań okazało się także, że mutacje genu CEBPA występują najczęściej u chorych z typem M1 i M2 (wg FAB) i to zarówno u dzieci, jak i dorosłych [31, 32, 41]. Obecność pojedynczej mutacji lub dwóch różnych mutacji CEBPA występujących na różnych chromosomach potwierdzono także u ok. 10–20% chorych na AML z prawidłową cytogenetyką [40, 42]. U chorych na AML z delecją 9q22 i bez innych aberracji chromosomowych stwierdzono zwiększone prawdopodobieństwo wystąpienia mutacji CEBPA. Częstość występowania defektów w CEBPA w tej grupie pacjentów określono na 22–48% [43].

Dowiedziono, że w przypadkach CEBPA– i CEBPA+ odsetek pacjentów uzyskujących remisję hematologiczną jest zbliżony (odpowiednio 82% i 80%). Okazało się jednak, że odsetek przeżyć 5-letnich pacjentów CEBPA+ w porównaniu z chorymi CEBPA– jest wyższy (odpowiednio 47% i 31%) [40]. U chorych CEBPA+ ze wznową choroby stwierdza się obecność tych samych defektów molekularnych, które wykazano przy pierwszej manifestacji choroby. Zmianie często podlega natomiast dystrybucja poszczególnych alleli. To ostatnie spostrzeżenie może świadczyć o ewolucji klonalnej choroby [41].

Coraz większa liczba danych dotyczących występowania mutacji w CEBPA dowodzi, że wpływ na rokowanie ma nie tylko sam fakt wystąpienia mutacji, ale także ich liczba. Zaobserwowano, że w ponad połowie przypadków AML CEBPA+ obecne są dwie różne mutacje, zlokalizowane na dwóch chromosomach (mutacje bialleliczne), z których najczęściej jedna jest mutacją N-terminalną, a druga C-terminalną. Komórki blastyczne, w których doszło do pojawienia się dwóch mutacji, cechuje charakterystyczny immunofenotyp: CD15+, CD7+, CD34+ i HLA-DR+ [31]. Zgodnie z opinią niektórych autorów wystąpienie pojedynczej mutacji CEBPA nie wpływa korzystnie na czas trwania pierwszej remisji i średni czas przeżycia chorych. Obserwację tę poczyniono na podstawie wyników trzech niezależnych analiz [37, 42, 44]. Wykazano w nich, że jedynie obecność mutacji biallelicznych CEBPA rokuje korzystnie.

Należy także wspomnieć, że obecność mutacji genu CEBPA nie jest charakterystyczna jedynie dla pacjentów z AML. Ich występowanie stwierdzono u chorych z zespołem mielodysplastycznym, szpiczakiem mnogim, chłoniakami nieziarniczymi, a także u osób z niektórymi nowotworami litymi [34, 56]. Również u chorych na ALL odnotowano przypadki występowania translokacji chromosomowych z udziałem CEBPA i czterech innych genów z rodziny CEBP [45].

Wystąpienie mutacji w CEBPA jest przypuszczalnie zdarzeniem pierwotnym w procesie transformacji nowotworowej. Świadczą o tym opisane przypadki dziedzicznych defektów N-terminalnych CEBPA, prowadzących bezpośrednio do wystąpienia objawów AML. Potwierdzeniem tej hipotezy jest spostrzeżenie, że w większości przypadków z dziedzicznym defektem CEBPA w momencie wystąpienia pierwszych objawów choroby pojawia się niezależnie inna mutacja tego genu zlokalizowana na drugim chromosomie. Sugeruje to, że pierwsza mutacja jest czynnikiem zwiększającym ryzyko pojawienia się kolejnej, przyspieszającej transformację nowotworową [46, 47].

Mutacje CEBPA a defekty innych genów zaangażowanych w hematopoezę

Obecnie wiadomo, że oprócz CEBPA obecność mutacji dwóch innych genów ma wartość rokowniczą u chorych na AML. Wykrycie wewnętrznych tandemowych duplikacji genu FLT3 (FLT3-ITD) wiąże się z niekorzystnym, a mutacji NPM1, podobnie jak CEBPA, z korzystnym rokowaniem [24]. Dotyczy to szczególnie przypadków AML z prawidłową cytogenetyką (cytogenetically normal AML – CN-AML), w których nie stwierdzono aberracji chromosomowych ani obecności genów fuzyjnych.

Fms-podobna kinaza tyrozynowa 3 (FLT3) jest transbłonowym receptorem, uruchamiającym kaskadę sygnalizacyjną JAK/STAT, zaangażowaną w kontrolę proliferacji i apoptozy. Do mutacji genu FLT3 dochodzi w obrębie domeny kinazowej (TKD) oraz domeny przybłonowej (ITD). Pierwsze mają charakter punktowy i prowadzą do zwiększenia aktywności kinazowej, drugie sprzyjają dimeryzacji niezależnej od związania ligandu. W efekcie obu typów mutacji FLT3 jest stale aktywna, chociaż względem różnych grup genów efektorowych. Obecność FLT3-ITD potwierdzono u ok. 15–35%, a FLT3-TKD u ok. 6–8% pacjentów z AML [48]. Wyniki analiz klinicznych wykazały bezpośrednią zależność pomiędzy mutacjami FLT3-ITD a ryzykiem wznowy choroby u pacjentów z pośrednim ryzykiem niekorzystnego przebiegu choroby (w tym CN-AML). W przeciwieństwie do mutacji domeny przybłonowej, substytucje nukleotydowe w domenie kinazowej nie prowadzą do zmniejszenia czasu przeżycia i czasu wolnego od wznowy [48–51].

Innym genem, którego mutacje istotnie wpływają na przebieg AML, jest gen nukleofozminy. Nukleofozmina (NPM1) należy do tzw. białek opiekuńczych, zaangażowanych m.in. w kształtowanie się rybosomów i podział centromerów. Mutacje tego genu to insercje lub delecje prowadzące do zaniku dwóch reszt tryptofanu i wprowadzenia C-końcowej sekwencji VSLRK. Nieprawidłowe białko zmienia lokalizację z jądrowej na cytoplazmatyczną, powodując m.in. zaburzenia w proliferacji. Mutacje NPM1 są stosunkowo często obecne u chorych na AML. Ich występowanie udokumentowano u ok. 15–35% chorych dorosłych oraz w ok. 2–8% przypadków AML u dzieci. Obecność mutacji w NPM1 rokuje korzystnie i jest powiązana z wyższym odsetkiem uzyskiwanych remisji całkowitych (86,4% w porównaniu z 64,3%) [51]. Ponadto u pacjentów z CN-AML i mutacją NPM1 przeżycie wolne od wznowy jest dłuższe w porównaniu z obserwowanym u chorych bez mutacji NPM1 [2].

Obecność mutacji jednego z genów: CEBPA, NPM1 i FLT3, jest uznawana za niezależny czynnik rokowniczy u osób z AML. Okazuje się jednak, że u części chorych dochodzi do współwystępowania różnych defektów molekularnych. Współwystępowanie mutacji NPM1 i FLT3-ITD jest zjawiskiem stosunkowo częstym, stwierdzanym u ok. 18% chorych na CN-AML [24]. Co ciekawe, obecność mutacji NPM1 nie znosi negatywnego wpływu mutacji FLT3 na rokowanie u pacjentów z AML. Nie zaobserwowano istotnych różnic w przeżyciu całkowitym oraz odsetku uzyskiwanych remisji całkowitych pomiędzy pacjentami FLT3-ITD+/NPM1– i FLT3-ITD+/NPM1+. Podobne obserwacje poczyniono odnośnie do genotypu FLT3-ITD+/CEBPA+. Także korzystny wpływ mutacji biallelicznych CEBPA jest znoszony przez wystąpienie FLT3-ITD [40, 44]. Przeciwnie, u chorych na AML CEBPA+ ze współwystępującą mutacją genu NPM1 rokowanie jest podobne jak u mających tylko jedną z nich [42].

Obecność mutacji domeny kinazowej FLT3 (FLT3-TKD+), w przeciwieństwie do mutacji domeny przybłonowej, jest skorelowana z wydłużonym czasem przeżycia i lepszym rokowaniem zarówno u chorych z mutacjami CEBPA (dane przedstawione jedynie dla 4 pacjentów), jak i z mutacjami NPM1 [52].

Na rycinie 3. przedstawiono dotychczas poznane defekty molekularne o uznanej wartości prognostycznej u chorych na AML z prawidłową cytogenetyką.

Oprócz mutacji w NPM1, FLT3 i CEBPA wśród czynników wpływających na rokowanie u chorych z AML wymienia się defekty w TP53, c-KIT, NRAS, nadekspresję ERG, WT1 i BAALC oraz częściowe duplikacje genu MLL [24, 53]. Ich wpływ na rokowanie u chorych na AML jest trudny do oszacowania ze względu na małą częstość występowania wymienionych defektów wśród pacjentów z AML. Być może wraz z wprowadzeniem nowych technik jednoczesnego monitorowania wielu defektów molekularnych ocena ich wpływu na rokowanie będzie możliwa. Największe nadzieje w tym zakresie budzą wyniki prac nad diagnostycznym wykorzystaniem profilowania ekspresji genów (w tym WT1, BAALC, ERG, miRNA-223 i innych) [54, 55].

Piśmiennictwo

 1. Dohner H, Estey EH, Amadori S, et al. Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in adults: recommendations from an international expert panel, on behalf of the European Leukemia Net. Blood 2010; 115: 453-74.  

2. Schlenk RF, Döhner K, Krauter J, et al. Mutations and treatment outcome in cytogenetically normal acute myeloid leukemia. N Engl J Med 2008; 358: 1909-18.  

3. Yoshida H, Ichikawa H, Tagata Y, et al. PML-retinoic acid receptor alpha inhibits PML IV enhancement of PU.1-induced C/EBPepsilon expression in myeloid differentiation. Mol Cell Biol 2007; 27: 5819-34.  

4. Britos-Bray M, Friedman AD. Core binding factor cannot synergistically activate the myeloperoxidase proximal enhancer in immature myeloid cells without c-Myb. Mol Cell Biol 1997; 17: 5127-35.  

5. Rupa J, Lewandowski K. Granulopoeza: od roli zaangażowanych genów do czynników transkrypcyjnych i cytokin. Acta Haematologica Polonica 2006; 485-504.  

6. Stankiewicz MJ, Crispino JD. ETS2 and ERG promote megakaryopoiesis and synergize with alterations in GATA-1 to immortalize hematopoietic progenitor cells. Blood 2009; 113: 3337-47.  

7. Carella C, Potter M, Bonten J, Rehg JE, Neale G, Grosveld GC. The ETS factor TEL2 is a hematopoietic oncoprotein. Blood 2006; 107: 1124-32.  

8. Zelent A, Greaves M, Enver T. Role of the TEL-AML1 fusion gene in the molecular pathogenesis of childhood acute lymphoblastic leukaemia. Oncogene 2004; 23: 4275-83.  

9. Helbling D, Mueller BU, Timchenko NA, et al. The leukemic fusion gene AML1-MDS1-EVI1 suppresses CEBPA in acute myeloid leukemia by activation of Calreticulin. Proc Natl Acad Sci U S A 2004; 101: 13312-7.

10. Friedman AD. Transcriptional regulation of granulocyte and monocyte development. Oncogene 2002; 21: 3377-90.

11. Link KA, Chou FS, Mulloy JC. Core binding factor at the crossroads: determining the fate of the HSC. J Cell Physiol 2010; 222: 50-6.

12. Duprez E, Wagner K, Koch H, Tenen DG. C/EBPbeta: a major PML-RARA-responsive gene in retinoic acid-induced differentiation of APL cells. EMBO J 2003; 22: 5806-16.

13. Mueller BU, Pabst T, Fos J, Petkovic V, Fey MF, Asou N, Buergi U, Tenen DG. ATRA resolves the differentiation block in t(15;17) acute myeloid leukemia by restoring PU.1 expression. Blood 2006; 107: 3330-8.

14. Kelly LM, Gilliland DG. Genetics of myeloid leukemias. Annu Rev Genomics Hum Genet 2002; 3: 179-98.

15. Du J, Stankiewicz MJ, Liu Y, Xi Q, Schmitz JE, Lekstrom-Himes JA, Ackerman SJ. Novel combinatorial interactions of GATA-1, PU.1, and C/EBPepsilon isoforms regulate transcription of the gene encoding eosinophil granule major basic protein. J Biol Chem 2002; 277: 43481-94.

16. Pabst T, Mueller BU. Complexity of CEBPA dysregulation in human acute myeloid leukemia. Clin Cancer Res 2009; 15: 5303-7.

17. Pabst T, Mueller BU, Zhang P, et al. Dominant-negative mutations of CEBPA, encoding CCAAT/enhancer binding protein-alpha (C/EBPalpha), in acute myeloid leukemia. Nat Genet 2001; 27: 263-70.

18. Parkin SE, Baer M, Copeland TD, Schwartz RC, Johnson PF. Regulation of CCAAT/enhancer-binding protein (C/EBP) activator proteins by heterodimerization with C/EBPgamma (Ig/EBP). J Biol Chem 2002; 277: 23563-72.

19. Ranjan R, Thompson EA, Yoon K, Smart RC. C/EBPalpha expression is partially regulated by C/EBPbeta in response to DNA damage and C/EBPalpha-deficient fibroblasts display an impaired G1 checkpoint. Oncogene 2009; 28: 3235-45.

20. Kovács KA, Steinmann M, Magistretti PJ, Halfon O, Cardinaux JR. CCAAT/enhancer-binding protein family members recruit the coactivator CREB-binding protein and trigger its phosphorylation. J Biol Chem 2003; 278: 36959-65.

21. Fazi F, Rosa A, Fatica A, Gelmetti V, De Marchis ML, Nervi C, Bozzoni I. A minicircuitry comprised of microRNA-223 and transcription factors NFI-A and C/EBPalpha regulates human granulopoiesis. Cell 2005; 123: 819-31.

22. Skokowa J, Cario G, Uenalan M, et al. LEF-1 is crucial for neutrophil granulocytopoiesis and its expression is severely reduced in congenital neutropenia. Nat Med 2006; 12: 1191-7.

23. Pabst T, Mueller BU, Harakawa N, et al. AML1-ETO downregulates the granulocytic differentiation factor C/EBPalpha in t(8;21) myeloid leukemia. Nat Med 2001; 7: 444-51.

24. Mrózek K, Marcucci G, Paschka P, Whitman SP, Bloomfield CD. Clinical relevance of mutations and gene-expression changes in adult acute myeloid leukemia with normal cytogenetics: are we ready for a prognostically prioritized molecular classification? Blood 2007; 109: 431-48.

25. Geletu M, Balkhi MY, Peer Zada AA, Christopeit M, Pulikkan JA, Trivedi AK, Tenen DG, Behre G. Target proteins of C/EBPalphap30 in AML: C/EBPalphap30 enhances sumoylation of C/EBPalphap42 via up-regulation of Ubc9. Blood 2007; 110: 3301-9.

26. Ross SE, Radomska HS, Wu B, et al. Phosphorylation of C/EBPalpha inhibits granulopoiesis. Mol Cell Biol 2004; 24: 675-86.

27. Khanna-Gupta A. Sumoylation and the function of CCAAT enhancer binding protein alpha (C/EBP alpha). Blood Cells Mol Dis 2008; 41: 77-81.

28. Keeshan K, He Y, Wouters BJ, et al. Tribbles homolog 2 inactivates C/EBPalpha and causes acute myelogenous leukemia. Cancer Cell 2006; 10: 401-11.

29. Rangatia J, Vangala RK, Singh SM, et al. Elevated c-Jun expression in acute myeloid leukemias inhibits C/EBPalpha DNA binding via leucine zipper domain interaction. Oncogene 2003; 22: 4760-4.

30. Ishikawa Y, Kiyoi H, Tsujimura A, Miyawaki S, Miyazaki Y, Kuriyama K, Tomonaga M, Naoe T. Comprehensive analysis of cooperative gene mutations between class I and class II in de novo acute myeloid leukemia. Eur J Haematol 2009; 83: 90-8.

31. Lin LI, Chen CY, Lin DT, et al. Characterization of CEBPA mutations in acute myeloid leukemia: most patients with CEBPA mutations have biallelic mutations and show a distinct immunophenotype of the leukemic cells. Clin Cancer Res 2005; 11: 1372-9.

32. Liang DC, Shih LY, Huang CF, et al. CEBPalpha mutations in childhood acute myeloid leukemia. Leukemia 2005; 19: 410-4.

33. Fuchs O, Kostecka A, Provaznikova D, et al. Nature of frequent deletions in CEBPA. Blood Cells Mol Dis 2009; 43: 260-3.

34. Fuchs O, Provaznikova D, Kocova M, et al. CEBPA polymorphisms and mutations in patients with acute myeloid leukemia, myelodysplastic syndrome, multiple myeloma and non-Hodgkin’s lymphoma. Blood Cells Mol Dis 2008; 40: 401-5.

35. Leecharendkeat A, Tocharoentanaphol C, Auewarakul CU. CCAAT/enhancer binding protein-alpha polymorphisms occur more frequently than mutations in acute myeloid leukemia and exist across all cytogenetic risk groups and leukemia subtypes. Int J Cancer 2008; 123: 2321-6.

36. Ralser M, Querfurth R, Warnatz HJ, Lehrach H, Yaspo ML, Krobitsch S. An efficient and economic enhancer mix for PCR. Biochem Biophys Res Commun 2006; 347: 747-51.

37. Wouters BJ, Löwenberg B, Erpelinck-Verschueren CA, van Putten WL, Valk PJ, Delwel R. Double CEBPA mutations, but not single CEBPA mutations, define a subgroup of acute myeloid leukemia with a distinctive gene expression profile that is uniquely associated with a favorable outcome. Blood 2009; 113: 3088-91.

38. Rázga F, Dvoráková D, Jurcek T, Jezísková I, Krístková Z, Mayer J. CEBPA gene mutational status: a complete screening using high-resolution melt curve analysis. Mol Diagn Ther 2009; 13: 195-200.

39. Ahn JY, Seo K, Weinberg O, Boyd SD, Arber DA. A comparison of two methods for screening CEBPA mutations in patients with acute myeloid leukemia. J Mol Diagn 2009; 11: 319-23.

40. Renneville A, Boissel N, Gachard N, et al. The favorable impact of CEBPA mutations in patients with acute myeloid leukemia is only observed in the absence of associated cytogenetic abnormalities and FLT3 internal duplication. Blood 2009; 113: 5090-3.

41. Shih LY, Liang DC, Huang CF, et al. AML patients with CEBPalpha mutations mostly retain identical mutant patterns but frequently change in allelic distribution at relapse: a comparative analysis on paired diagnosis and relapse samples. Leukemia 2006; 20: 604-9.

42. Dufour A, Schneider F, Metzeler KH, et al. Acute myeloid leukemia with biallelic CEBPA gene mutations and normal karyotype represents a distinct genetic entity associated with a favorable clinical outcome. J Clin Oncol 2010; 28: 570-7.

43. Fröhling S, Schlenk RF, Krauter J, et al. Acute myeloid leukemia with deletion 9q within a noncomplex karyotype is associated with CEBPA loss-of-function mutations. Genes Chromosomes Cancer 2005; 42: 427-32.

44. Green CL, Koo KK, Hills RK, Burnett AK, Linch DC, Gale RE. Prognostic significance of CEBPA mutations in a large cohort of younger adult patients with acute myeloid leukemia: impact of double CEBPA mutations and the interaction with FLT3 and NPM1 mutations. J Clin Oncol 2010; 28: 2739-47.

45. Akasaka T, Balasas T, Russell LJ, et al. Five members of the CEBP transcription factor family are targeted by recurrent IGH translocations in B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia (BCP-ALL). Blood 2007; 109: 3451-61.

46. Owen C, Barnett M, Fitzgibbon J. Familial myelodysplasia and acute myeloid leukaemia – a review. Br J Haematol 2008; 140: 123-32.

47. Renneville A, Roumier C, Biggio V, Nibourel O, Boissel N, Fenaux P, Preudhomme C. Cooperating gene mutations in acute myeloid leukemia: a review of the literature. Leukemia 2008; 22: 915-31.

48. Meshinchi S, Appelbaum FR. Structural and functional alterations of FLT3 in acute myeloid leukemia. Clin Cancer Res 2009; 15: 4263-9.

49. Meshinchi S, Alonzo TA, Stirewalt DL, et al. Clinical implications of FLT3 mutations in pediatric AML. Blood 2006; 108: 3654-61.

50. Moreno I, Martin G, Bolufer P, et al. Incidence and prognostic value of FLT3 internal tandem duplication and D835 mutations in acute myeloid leukemia. Haematologica 2003; 88: 19-24.

51. Rau R, Brown P. Nucleophosmin (NPM1) mutations in adult and childhood acute myeloid leukaemia: towards definition of a new leukaemia entity. Hematol Oncol 2009; 27: 171-81.

52. Bacher U, Haferlach C, Kern W, Haferlach T, Schnittger S. Prognostic relevance of FLT3-TKD mutations in AML: the combination matters – an analysis of 3082 patients. Blood 2008; 111: 2527-37.

53. Metzeler KH, Dufour A, Benthaus T, et al. ERG expression is an independent prognostic factor and allows refined risk stratification in cytogenetically normal acute myeloid leukemia: a comprehensive analysis of ERG, MN1, and BAALC transcript levels using oligonucleotide microarrays. J Clin Oncol 2009; 27: 5031-8.

54. Metzeler KH, Hummel M, Bloomfield CD, et al. An 86-probe-set gene-expression signature predicts survival in cytogenetically normal acute myeloid leukemia. Blood 2008; 112: 4193-201.

55. Gulley ML, Shea TC, Fedoriw Y. Genetic tests to evaluate prognosis and predict therapeutic response in acute myeloid leukemia. J Mol Diagn 2010; 12: 3-16.

56. Koschmieder S, Halmos B, Levantini E, Tenen DG. Dysregulation of the C/EBPalpha differentiation pathway in human cancer. J Clin Oncol 2009; 27: 619-28.



Adres do korespondencji

Marzena Pieronkiewicz

Katedra i Klinika Hematologii i Chorób Rozrostowych

Układu Krwiotwórczego

Laboratorium Diagnostyki Hematologicznej

ul. Szamarzewskiego 82

60-569 Poznań

e-mail: marzena.pieronkiewicz@gmail.com