Prognostic significance of occurrence of alternative splice mRNA VEGF forms – VEGF₁₂₁, VEGF₁₄₅, VEGF₁₆₅, VEGF₁₈₃, VEGF₁₈₉, VEGF₂₀₆in squamous intraepithelial lesions and cervical cancer

WSTĘP


Zmiany śródnabłonkowe małego (LSIL – low grade squamous intraepithelial lesion) i dużego stopnia (HSIL – high grade squamous intraepithelial lesion), patomorfologicznie klasyfikowane jako zmiany przednowotworowe, reprezentują heterogenną jednostkę kliniczną, posiadającą różnorodny biologiczny potencjał rozwojowy [1]. W przybliżeniu połowa zmian śródnabłonkowych małego stopnia zachowuje się jak zmiana łagodna, często ulegając spontanicznej regresji, podczas gdy druga połowa posiada fenotyp prawdziwie przednowotworowy, pozostając zmianą przetrwałą, lub ulegającą progresji do wyższych stopni patologii morfologicznej [2].
Kolposkopowe obserwacje rysunku naczyniowego oraz wcześniejsze badania współczynnika średniej gęstości mikronaczyń w prawidłowym i patologicznym nabłonku szyjki macicy [3] wyraźnie wskazują na kluczową rolę angiogenezy w progresji zmian śródnabłonkowych i raka szyjki macicy [4].
Spośród licznych białek opisywanych jako czynniki proangiogenne, które biorą udział w procesie tworzenia nowych naczyń, tylko VEGF, wg Riseau’a [5], spełnia wszystkie cechy czynnika angiogennego:
- obecny tylko w czasie trwania procesu angiogenezy,
- nie występuje, jeżeli w organizmie dorosłym aktualnie nie są tworzone nowe naczynia,
- jego działanie jest ograniczone ściśle do komórek śródbłonka naczyniowego i bezpośrednio wpływa na ekspresję jego receptorów,
- jego nadekspresja zawsze wiąże się z powstaniem nowych naczyń,
- neutralizowanie jego działania (przez naturalne lub syntetyczne inhibitory) lub poprzez zablokowanie funkcji przenoszenia sygnału przez receptor zawsze hamuje powstawanie nowych naczyń.

Gen VEGF, składający się z 8 egzonów, zlokalizowano w prążku 21.3 chromosomu 6, a jego region kodujący zajmuje obszar ok. 14 kb [6]. Na drodze alternatywnego dojrzewania mRNA, dość powszechnie spotykanego zjawiska, polegającego na różnicowym wycinaniu intronów z cząsteczki premRNA, z pojedynczego genu powstają wszystkie izoformy białka VEGF [7].
Znanych jest obecnie sześć izoform tego białka: VEGF₁₂₁ [7], VEGF₁₄₅ [8], VEGF₁₆₅ [9], VEGF₁₈₃ [10], VEGF₁₈₉ [11], oraz VEGF₂₀₆ [11] (liczby oznaczają ilość aminokwasów tworzących dane białko). Cząsteczka mRNA wszystkich izoform posiada eksony 1–5, zawierające informację wymaganą do rozpoznania specyficznych receptorów – VEGFR-1 (Flt-1) i VEGFR-2 (KDR/Flk-1), a różnice dotyczą obecności lub braku eksonów 6, 6’, 7 lub 8. Ekson 6 może występować w formie skróconej, jak to się zdarza w izoformie VEGF₁₈₃. Cząsteczka mRNA izoformy VEGF206 zawiera wszystkie eksony i jako jedyna zawiera ekson 6’. Pozostałe izoformy VEGF są pozbawione eksonu 6’, ponieważ w trakcie obróbki pre-mRNA wykorzystywane jest alternatywne miejsce składania eksonów w miejscu 563. VEGF₁₈₉ jest pozbawiony całkowicie eksonu 6’ o długości 51 par zasad (co jest równoważne 17 aminokwasom białka), a VEGF183 powstaje na skutek odcięcia kolejnych 18 par zasad z końca 3’ eksonu 6 liczącego 72 pary zasad. Transkrypt VEGF₁₆₅ nie ma w ogóle eksonu 6, transkrypt VEGF₁₄₅ eksonu 7, a VEGF₁₂₁ jednocześnie eksonu 6 i 7 [12] (ryc. 1.).

W rodzinie izoform naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu VEGF₁₂₁ jest najmniejszym, całkowicie rozpuszczalnym, słabo kwaśnym białkiem, nie wiążącym się z heparyną, o silnych właściwościach mitogennych i zwiększających przepuszczalność naczyń [13].
W przeciwieństwie do VEGF₁₂₁ i VEGF₁₆₅ VEGF₁₄₅ wiąże się z błoną podstawną, dlatego przedstawia formę posiadającego odrębną charakterystykę biologiczną. Izoforma ta zawiera ekson 6, warunkujący możliwość wiązania się z heparyną podobnie, jak VEGF₁₆₅ , lecz biologicznie zachowuje się jak VEGF₁₂₁ [14].
VEGF₁₆₅ , podobnie jak VEGF₁₂₁ jest zaliczana do czynników rozpuszczalnych. Niemniej poprzez fakt posiadania w swojej budowie domeny, kodowanej przez ekson 7, umożliwiającej wiązanie się z heparyną, nabywa ona nowych, specyficznych właściwości [9].
mRNA VEGF₁₈₃ różni się od większej izoformy VEGF₁₈₉ brakiem tylko 18 bp, a utrata tego fragment genomu ma wpływ na ruchliwość białka w komórce i macierzy pozakomórkowej, przenoszenie sygnału, zdolność wiązania heparyny, interakcję z innymi czynnikami wzrostu, aktywność mitotyczną i wiązanie receptorów [15].
W pełnej długości genu ekson 6 i 7 kodują domeny kationowe, która nadaje izoformie VEGF₁₈₉ aktywność wiązania heparyny [6], radykalnie kształtując kierunek działania, wyraźnie skierowany na elementy przestrzeni międzykomórkowej (ECM) stymulując w niej podziały komórek, fosforylację receptorów dla VEGF, wzrost wewnątrzkomórkowego Ca²⁺, ekspresję genów, migrację różnych elementów ECM [16].
VEGF₂₀₆ jest jedyną izoformą posiadającą w swoim składzie wszystkie, kodowane przez gen VEGF eksony [7] i podobnie jak VEGF₁₈₉ posiada miejsce silnie wiążące heparynę i w wyniku tego jest izoformą związaną z powierzchnią komórek [11]. Niewiele doniesień mówi o występowaniu tej izoformy, a jeszcze mniej o roli, jaką spełnia w procesie angiogenezy.
Celem przedstawionej pracy jest ocena wartości diagnostycznej występowania poszczególnych typów alternatywnego składania mRNA VEGF – VEGF₁₂₁, VEGF₁₄₅, VEGF₁₆₅, VEGF₁₈₃, VEGF₁₈₉, VEGF₂₀₆ w prognozowaniu ryzyka progresji zmian śródnabłonkowych i raka szyjki macicy.



MATERIAŁ I METODY


Materiał badawczy stanowiło 119 wycinków tkankowych szyjki macicy zakwalifikowanych do następujących grup morfologicznych,:
I. grupa kontrolna (K) – 43 wycinki tkankowe pochodzące z prawidłowej szyjki macicy,
II. grupa LSIL (LSIL) – 38 wycinków,
III. grupa HSIL (HSIL) – 17 wycinków,
IV. grupa raka płaskonabłonkowego w stopniu klinicznego zaawansowania IB – IIB (RAK) – 21 wycinków.

Materiał tkankowy bezpośrednio po pobraniu zamrażano do –70^oC.



EKSTRAKCJA RNA


Po wstępnym kruszeniu komórek w ciekłym azocie z homogenatu ekstrahowano DNA i RNA przy zastosowaniu zmodyfikowanej metody wg Chomczyńskiego i Sachi [17], a następnie wyznaczano stężenie kwasu nukleinowego w ekstrakcie techniką spektrofotometryczną z zastosowaniem RNA/DNA kalkulator Gene Quant LKB – Pharmacia Biotech.



ANALIZA AKTYWNOŚCI TRANSKRYPCYJNEJ GENU VEGF


Aktywność transkrypcyjną badanych genów wyznaczano na podstawie analizy kinetyki reakcji QRT-PCR, w której matrycą były ekstrakty całkowitego RNA otrzymywane z wycinków tkanek. W pierwszej części badań projektowano reakcję QRT-PCR dla badanych transkryptów i produktów ich modyfikacji potranskrypcyjnej. Sprawdzano empirycznie i optymalizowano zaprojektowane reakcje oraz potwierdzano specyficzność amplimerów techniką elektroforezy w żelu polakrylamidowym, barwionym srebrem i metodą sekwencjonowania enzymatycznego. Dla wszystkich zaprojektowanych reakcji QRT-PCR przyjęto identyczne warunki termiczne oraz mieszaninę reakcyjną różniącą się tylko zestawem oligonukleotydów – starterów i sond wyznakowanych fluorochromami FAM i TAMRA. W drugim etapie wyznaczono liczby kopii mRNA badanych traskryptów w 1 μg całkowitego mRNA badanego wycinka.



PROJEKTOWANIE
SPECYFICZNYCH
STARTERÓW I SOND
STOSOWANYCH W REAKCJI QRT-PCR DLA mRNA VEGF



Sekwencję nukleotydów starterów oraz sond dla reakcji RT-QPCR zaprojektowano na podstawie programu komputerowego Primer Express^TM Version 1.0 ABI PRISM, na podstawie sekwencji badanych genów pochodzących z bazy danych Gen Bank (http://www.ncbi,nlm.nih.gov/irx/gen-bank). Korzystając z bazy danych BLAST 2 SEQUENCES RESULTS VERSION BLASTN 2.0.11 porównano kolejność nukleotydów genu VEGF, znalezione pod numerem dostępu – accession – NM_003376 (266), M63978.




SEKWENCJONOWANIE
AMPLIMERÓW



Ostatnim etapem sprawdzenia specyficzności zaprojektowanych reakcji QRT-PCR, umożliwiających detekcję produktów modyfikacji potranskrypcyjnej mRNA VEGF, było sekwencjonowanie produktów amplifikacji prowadzone metodą Sangera [18]. Amplifikację sekwencyjną prowadzono z zastosowaniem dideoksynukleotydów wyznakowanych odpowiednio: ddATP barwnikiem dichloro[R6G], ddCTP barwnikiem dichloro[ROX], ddGTP barwnikiem dichloro[R110] i ddTTP barwnikiem dichloro[TAMRA] w termocyklerze GeneAmp PCR System 9600 firmy Perkin Elmer. Następnie otrzymane produkty rozdzielono przy użyciu automatycznego analizatora sekwencji ABI PRISM^TM 310. i zanalizowano stosując program DNA Sequencing Analysis Software^TM Version 3.7. Kolejne etapy sekwencjonowania przeprowadzano zgodnie z zaleceniem protokołu dołączonego do zestawu odczynników sekwencyjnych zalecanych przez firmę Perkin Elmer.



WYZNACZANIE LICZBY KOPII mRNA TECHNIKĄ QRT – PCR



Otrzymany w ekstrakcji RNA stanowił matrycę w reakcji Q-RT-PCR prowadzonej jednostopniowo z zastosowaniem termostabilnego enzymu Tth. Wprowadzenie jonów Mg²⁺ i Mn²⁺ do mieszaniny reakcyjnej w odpowiednich proporcjach umożliwiło wykonanie reakcji QRT-PCR w jednej probówce, w mieszaninie reakcyjnej zawierającej 1x Tth PCR Buffor zawierający fluorochrom zapewniający odpowiednie tło dla pomiaru fluorescencji po każdym cyklu termicznym QRT-PCR, 3mM MgCl₂, 400 μM. dATP, 400 μM. dTTP. 400 μM. dGTP, 400 μM. dCTP, 1 x wzmacniacz reakcji PCR, 0,5 μM MnSO₄, 0,3 μM starter 1 i starter 2, 0,2 μM sondy wyznakowanej fluorochromami FAM i TAMRA, 1–10 mg całkowitego RNA, 2.5 U polimerazy DNA Tth. Reakcję Q-RT-PCR wykonywano z zastosowaniem detektora sekwencji ABI PRISM^TM 7700.




WYNIKI



Zaobserwowane wielkości maksymalne VEGF₁₂₁, VEGF₁₄₅, VEGF₁₆₅ i VEGF w prawidłowej strefie regeneracji nie przekraczały wartości 1 x 10³ kopii mRNA/1 μg całkowitego RNA. Jedynie VEGF₁₈₉ i VEGF₂₀₆ charakteryzowały się podwyższonymi wartościami w granicach nawet do 2 x 10 <sup>4145 , którą zarejestrowano w 53,49 proc. wszystkich wycinków pochodzących z prawidłowej szyjki macicy (ryc. 2A.). W 1/4 wszystkich przypadków grupy kontrolnej stwierdzono występowanie VEGF ₁₆₅ (25,58 proc.) (ryc. 2A.) i VEGF₂₀₆ (25,58 proc.) (ryc. 2B.).
Aktywność transkrypcyjna VEGF w grupie LSIL była znamiennie wyższa od grupy kontrolnej (p <0,05), a jedynie ilość kopii mRNA VEGF ₂₀₆ nie różniła się znamiennie w porównaniu do grupy kontrolnej (ryc. 2B.). W grupie LSIL znamiennie częściej zaobserwowano obecność ₁₂₁ (p <0,001; Chi 2 _Pearsona = 12,3) (ryc. 2A.) oraz VEGF ₁₈₉ (p <0,05;
Chi 2 _Pearsona = 9,14) w porównaniu do grupy kontrolnej, a w przypadku pozostałych izoform nie potwierdzono statystycznie istotnych różnic w częstości występowania (ryc. 2B.).
Grupa HSIL charakteryzowała się najwyższą aktywnością transkrypcyjną genu VEGF i jakkolwiek zarejestrowane niektóre wartości maksymalne były porównywalne z grupą LSIL, to niemniej liczba kopii mRNA poszczególnych izoform VEGF w większości badanych przypadków mieściła się w zakresie wartości maksymalnych różniąc się znamiennie od zaobserwowanych w grupie kontrolnej (p <0,001) i grupie LSIL (p <0,05). W grupie HSIL zaobserwowano częstsze występowanie mRNA VEGF ₁₂₁, VEGF ₁₄₅, VEGF₁₆₅ , VEGF₁₈₃ , VEGF ₁₈₉, VEGF₂₀₆ , w porównaniu z grupą kontrolną (p <0,001) i LSIL (p <0,05) (ryc. 2A. i B.).
Wbrew oczekiwaniom, nie zaobserwowano wzrostu aktywności transkrypcyjnej VEGF w wycinkach tkankowych raka szyjki macicy, a w niektórych przypadkach była niższa od grupy HSIL (ryc. 2A. i B.).

Obserwacja zakresu wartości minimalnych i maksymalnych wykazała podobieństwo do grupy HSIL, aczkolwiek wykazano statystycznie znamienne różnice w porównaniu z grupą kontrolną i LSIL (p <0,001). Częstość występowania poszczególnych izoform VEGF była identyczna jak w grupie HSIL, a jedynie mRNA VEGF183 było znamiennie częściej rejestrowane niż w grupie HSIL
(p < 0,05; Chi 2 _Pearsona = 5,8) (ryc. 2B.).
W sposób bezpośredni w badaniu prospektywnym oceniono ryzyko względne progresji zmian morfologicznych w zależności od występowania formy alternatywnego składania mRNA VEGF (VEGF ₁₂₁, VEGF ₁₄₅, VEGF ₁₆₅, VEGF ₁₈₃, VEGF ₁₈₉, VEGF₂₀₆ ). W przypadku stwierdzenia mRNA VEGF ₁₂₁ w stosunku do grupy kontrolnej ryzyko progresji LSIL będzie 2,28 razy wyższe (RW = 2,28±1,56; 95 proc. = 0,78 – 5,34) i podobnie w przypadku VEGF ₁₈₉ (RW = 2,02±1,06; 95 proc. = 0,06 – 4,09), podczas gdy dla VEGF ₁₄₅, VEGF₁₆₅ , VEGF₁₈₃ i VEGF₂₀₆ ryzyko to wzrasta niewiele i mieści się w zakresie – RW = 1,32 – 1,73 (tabela).
W przypadku stwierdzenia występowania mRNA izoformy VEGF121 w wycinku z cechami morfologicznymi zmiany śródnabłonkowej dużego stopnia (HSIL), względne ryzyko progresji do form bardziej zaawansowanych będzie 10-krotnie wyższe niż w przypadku niewystępowania tej izoformy w badanym materiale tkankowym (RW = 8,94±7,4; 95 proc. = 5,56 – 23,44). Podobnie w przypadku VEGF ₁₈₉ (12,95±11,12 (95 proc. = 8,85 – 34,76), oraz VEGF₂₀₆ ryzyko wzrasta 9,81±8,14 (95 proc. = 6,15 – 25,76) (tabela).
W raku płaskonabłonkowym szyjki macicy najwyższą wartość ryzyka względnego progresji w zależności od występowania form alternatywnego składnia mRNA VEGF stwierdzono w przypadku VEGF ₂₀₆, który powoduje wzrost ryzyka 21-krotnie (RW = 21,29±23,05; 95 proc. = 23,89 – 66,47) w stosunku do przypadku braku obecności mRNA tej izoformy w badanej tkance (tabela). W przypadku stwierdzenia obecności mRNA VEGF ₁₂₁ w stosunku do grupy porównawczej ryzyko progresji jest 9-krotnie wyższe (RW = 9,35±7,64; 95 proc. = 5,62 – 24,32) i podobnie w przypadku VEGF ₁₄₅ (RW = 9,77±10,45), VEGF₁₆₅ (RW = 5,45), VEGF₁₈₃ (RW = 4,46) i VEGF₁₈₉ (RW = 3,58).



OMÓWIENIE


Wzrastająca liczba publikacji dowodzi, że raczej wzajemny stosunek izoform VEGF, a nie całkowity VEGF jest odpowiedzialny za angiogenezę, tak w procesach fizjologicznych, jak i stanach patologicznych [19–22]. Niedosyt z fragmentarycznej wiedzy na temat roli tych izoform w strefie regeneracji pogłębia fakt niezwykle ważnego znaczenia tego miejsca, charakteryzującego się podwyższonym potencjałem proliferancyjnym komórek znajdujących się w tej strefie [24] w inicjacji raka szyjki macicy [23], charakteryzującego się podwyższonym potencjałem proliferacyjnnym komórek znajdujących się w tej strefie [24].
W prawidłowej szyjce macicy stwierdzono w tej pracy występowanie wszystkich sześciu typów mRNA (VEGF ₁₂₁, VEGF ₁₄₅, VEGF ₁₆₅, VEGF ₁₈₃, VEGF ₁₈₉, VEGF₂₀₆ ), których różnice w ekspresji, oraz charakterystycznych układów jednocześnie występujących różnych form alternatywnego składania są widoczne, zwłaszcza wyższe wartości w aktywności izoform VEGF₁₄₅ , VEGF₁₈₉ i VEGF ₂₀₆, co może mieć związek z wcześniejszymi obserwacjami zwiększonego potencjału proliferacyjnego nabłonka metaplastycznego w strefie regeneracji szyjki macicy i prawdopodobnym wpływem na intensyfikację angiogenezy właśnie w tym miejscu.
Zaobserwowana w tym eksperymencie ekspresja izoformy VEGF ₁₄₅, która zachowuje się podobnie jak VEGF₁₂₁ i VEGF₁₆₅ , wiążąc się z błoną podstawną wskazuje na rolę tej izoformy w fizjologicznych procesach modelowania podnabłonkowej sieci naczyniowej w strukturach lącznotkankowych.
Fakt ten, wraz z zaobserwowaną dominującą ekspresją izoformy VEGF₂₀₆ , która w swoich właściwościach charakteryzuje się aktywnym działaniem w przestrzeni międzykomórkowej, może sugerować, że zaobserwowana aktywność transkrypcyjna i charakterystyczny układ form alternatywnego składania mRNA VEGF moduluje w podścielisku nabłonkowym już istniejącą prawidłową sieć naczyniową, która w ten sposób dostosowuje się do formującego się nabłonka wielowarstwowego płaskiego z jednowarstwowego gruczołowego w procesie metaplazji. Te 2 fakty mogą także stanowić hipotezę występowania fizjologicznego zjawiska autokrynnej stymulacji proliferacji komórek śródbłonka naczyń podścieliska [25].
Spośród nielicznych prac badawczych, przedstawiających występowanie poszczególnych form alternatywnego składania VEGF zwraca uwagę wynik analizy Fujimoto i wsp. w raku szyjki macicy, którzy w badanych wycinkach kontrolnych (prawidłowa szyjka macicy) nie stwierdzili obecności VEGF₁₈₉ i VEGF₂₀₆ , a ekspresję wykazała izoforma VEGF ₁₂₁ i VEGF ₁₆₅ [26]. Niemniej wyniki te są trudne w porównaniu ze względu na różnice metodologiczne i zakres badanych izoform jednocześnie.
W przeprowadzonym badaniu stwierdzono wyższe wartości aktywności transkrypcyjnej VEGF w badanych wycinkach zmian śródnabłonkowych małego stopnia w porównaniu z grupą kontrolną i jedynie liczba kopii mRNA VEGF206 była taka sama w obu porównywanych grupach, co może sugerować prosty wniosek o znaczącym wpływie wzrostu aktywności pozostałych izoform VEGF na proces progresji LSIL. Dalsza obserwacja wzajemnych zależności aktywności transkrypcyjnej i częstości występowania form alternatywnego składania mRNA VEGF nie potwierdzają tej hipotezy i ocena względnego ryzyka progresji LSIL dla VEGF₁₄₅ , VEGF ₁₆₅, VEGF ₁₈₃ i VEGF₂₀₆ wskazała brak wpływu podwyższonych wartości ilości mRNA tych izoform na wzrost stopnia patologii morfologicznej. Jedynie dwie izoformy VEGF ₁₂₁ i VEGF ₁₈₉ znamiennie częściej pojawiały się w badanej patologii morfologicznej w porównaniu ze zdrową szyjką macicy i wykazywały niewielki wzrost względnego ryzyka progresji tych zmian.
Interesującym faktem jest pojawienie się większej liczby kopii mRNA tak odmiennych we właściwościach i miejscach działania izoform jakimi są VEGF ₁₂₁, uważanej za główny czynnik mitogenny komórek śródbłonka [27] i VEGF₁₄₅ mającej główne działanie skierowane na macierz śródkomórkową [11].
Obserwacja ta wskazuje na istotny fakt małego potencjału angiogennego oraz proliferacyjnego LSIL i jest zgodna z obserwowanymi cechami samoistnej regresji tych przypadków [1, 2, 28, 29].
Ocena ryzyka względnego progresji zmiany śródnabłonkowej dużego stopnia wskazała na 3 izoformy – VEGF₁₂₁ , VEGF₁₈₉ i VEGF₂₀₆ podwyższające znacząco to ryzyko, jakkolwiek wszystkie izoformy charakteryzowały się wyższą aktywnością i częstszym występowaniem w porównaniu z LSIL i grupą kontrolną. Dominacja izoformy krótkiej VEGF ₁₂₁ przyczyniającej się do rozwoju angiogenezy poprzez wzrost przepuszczalności naczyń krwionośnych i wzrost proliferacji komórek śródbłonka, oraz jednoczesna obecność izoform długich, takich jak VEGF₁₈₉ i VEGF₂₀₆ wskazuje na pełne zaangażowanie genów w indukowanie procesu angiogenezy, którego fenotyp wyrażony jest morfologicznym obrazem zwiększonej liczby mikronaczyń w podścielisku zmiany.
Dobbs i wsp. zaobserwowali wyraźną korelację pomiędzy współczynnikiem średniej gęstości mikronaczyń podścieliska, a ekspresją VEGF w badaniu immunohistochemicznym 70 wycinków prawidłowej szyjki macicy, zmian śródnabłonkowych (LSIL, HSIL) i raka inwazyjnego [30]. Również badania Obermaira i wsp. w grupie 83 przypadków CIN I – CIN III [3], jak i Guidiego i wsp. 66 kobiet w grupach prawidłowej szyjki macicy, LSIL, HSIL i raka inwazyjnego [4] wskazują zgodnie, że największe nasilenie procesu angiogenezy (maksymalne wartości współczynnika średniej gęstości mikronaczyń i ekspresji VEGF) występuje w grupie patologii śródnabłonkowej dużego stopnia. Tym samym stawia hipotezę, że analiza ekspresji genu VEGF, oraz występowanie form alternatywnego składania mRNA powinno pozwolić na określenie fenotypu angiogennego – złośliwego – komórek, pozwalającego na ocenę ryzyka progresji zmian śródnabłonkowych i raka szyjki macicy.
Porównanie wyników aktywności transkrypcyjnej genów VEGF grupy kobiet chorujących na raka szyjki macicy w stopniu klinicznego zaawansowania IB-IIB z grupą kontrolną oraz zmian śródnabłonkowych małego i dużego stopnia, zwraca uwagę podobieństwo ekspresji genu VEGF w grupach kobiet z rozpoznanym rakiem płaskonabłonkowym szyjki macicy i zmianą śródnabłonkową dużego stopnia, które może wskazywać na pewne granice ekspresji tego genu w zmianie patologicznej i prawdopodobny fakt udziału poszczególnych izoform raczej w procesie przygotowania podścieliska do procesu powstawania przerzutów odległych, a nie w samym procesie proliferacji i wzroście masy guza. Obserwacja ta ma pewne potwierdzenie w pracach badawczych porównujących współczynnik gęstości mikronaczyń w podścielisku guza a stanem klinicznym badanych chorych [31, 32].
Wszystkie warianty alternatywnego składania VEGF indukują angiogenezę i pytanie – dlaczego aż sześć izoform VEGF jest wytwarzanych – w aspekcie przeprowadzonego badania znajduje częściowe wytłumaczenie i jednocześnie wytycza dalsze kierunki badawcze w poznaniu angiogenezy nowotworów.


PIŚMIENNICTWO


1. Östör AG. Natural history of cervical intraepithelial neoplasia: a critical review. Int J Gynecol Pathol 1993; 12: 186-92.
2. Mitchell MF, Hittelman WN, Hong WK, Lotan R, Schottenfeld D. The natural history of cervical intraepithelial neoplasia: an argument for intermediate endpoint biomarkers. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 1994; 3: 619-26.
3. Obermair A, Bancher-Todesca, Bilgi S, Kaider A, Kohlberger P, Müllauer-Ertl S, Leodolter S, Gitsch G. Correlation of vascular endothelial growth factor expression and microvessel density in cervical intraepithelial neoplasia. J Natl Cancer Inst 1997; 89: 1212-7.
4. Guidi AJ, Abu-Jawdeh G, Berse B, Jackman RW, Tognazzi K, Dvorak HF, Brown LF. Vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) expression and angiogenesis in cervical neoplasia. J Natl Cancer Inst 1995; 87: 1237-45.
5. Risau W. What, if anything, is an angiogenic factor? Cancer Metastasis Rev 1996; 15: 149-51.
6. Ferrara N. Role of vascular endothelial growth factor in the regulation of angiogenesis. Kidney Int 2001; 56: 794-814.
7. Ferrara N. Molecular and biological properties of vascular endothelial growth factor. J Mol Med. 1999; 77: 527-43.
8. Poltorak Z, Cohen T, Sivan R, Kandelis Y, Spira G, Vlodavsky I, Keshet E, Neufeld G. VEGF145 a secreted vascular endothelial growth factor isoform that binds to extracellular matrix. J Biol Chem 1997; 272: 7151-8.
9. Ruckman J, Green LS, Beeson J, Waugh S, Gillette WL, Henninger DD, Claesson-Welsh L, Janjić N. 2'-fluoropirimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165). Inhibition of receptor binding and VEGF-induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-encoded domain. J Biol Chem 1998; 273: 20556-67.
10. Lei J, Jiang, Pei D. Identification and characterization of a new splicing variant of vascular endothelial growth factor: VEGF183. Biochim Biophys Acta 1998; 1443: 400-6.
11. Grützkau A, Krüger-Krasagakes S, Baumeister H, et al. Synthesis, storage and release of vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor (VEGF/VPF) by human mast cells: implications for biological significance of VEGF206. Mol Biol Cell 1998; 9: 875-84.
12. Loch T, Michalski B, Mazurek U, Graniczka M. Naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostu (VEGF) i jego rola w procesie nowotworowym. Post Hig Med Dośw 2001; 55: 257-74.
13. Ferrara N, Davis-Smyth T. The biology of vascular endothelial growth factor. Endocrin Rev 1997; 18: 4-25.
14. Neufeld G, Cohen T, Gengrinovitch S, Poltorak Z. Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors. FASEB J 1999; 13: 9-22.
15. Jingjing L, Xue Y, Agarwal N, Roque RS. Human Müller cells express VEGF183, a novel spliced variant of vascular endothelial growth factor. Invest Ophthalmol Vis Sci 1999; 40: 752-9.
16. Claffey KP, Robinson GS. Regulation of VEGF/VPF expression in tumor cells: Consequences for tumor growth and metastasis. Cancer Metastasis Rev 1996; 15: 165-76.
17. Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 1987; 162: 156-9.
18. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 1977; 74: 5463-7.
19. Tokunaga T, Oshika Y, Abe Y, et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF) mRNA isoform expression pattern is correlated with liver metastasisn and poor prognosis in colon cancer. Brit J Cancer 1998; 77: 998-1002.
20. Cheung N, Wong MP, Yuen ST, Leung SY, Chung LP. Tissue-specific expression pattern of vascular endothelial growth factor isoforms in the malignant transformation of lung and colon. Hum Pathol 1998; 29: 910-4.
21. Tomisawa M, Tokunaga T, Oshika Y, et al. Expression pattern of vascular endothelial growth factor isoform is closely correlated with tumour stage and vasularisation in renal cell carcinoma. Eur J Cancer 1999; 35: 133-7.
22. Lee YH, Tokunaga T, Oshika Y, et al. Cell-retained isoforms of vascular endothelial growth factor (VEGF) are correlated with poor prognosis in osteosarcoma. Eur J Cancer 35, 1089-93.
23. Elson DA, Riley RR, Lacey A, Thordarson G, Talamantes FJ, Arbeit JM. Sensitivity of the cervical transformation zone to estrogen-induced squamous cercinogenesis. Cancer Res 2000; 60: 1267-75.
24. Soini Y, Pöllänen R, Kemppainen S, Pääkö P, Lehto V-P. The association of vascular proliferation with HPV status and epithelial PCNA positivity in cervical intraepithelial lesions. APMIS 1996; 104: 183-90.
25. Folberg R, Hendrix MJC, Maniotis AJ. Vascular mimicry and tumor angiogenesis. Am J Pathol 2000; 156: 361-81.
26. Fujimoto J, Sakaguchi H, Hirose R, Ichigo S, Tamaya T. Expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and its mRNA in uterine cervical cancer. Brit J Cancer 1999; 80: 827-33.
27. Zhang H-T, Scott PAE, Morbidelli L, et al. The 121 amino acid isoform of vascular endothelial growth factor is more strongly tumorigenic than other splice variants in vivo. Brit J Cancer 2000; 83: 63-8.
28. Hellberg D, Nilsson S, Valentin J. Positive cervical smear with subsequent normal colposcopy and histology-frequency of CIN in a long-term follow-up. Gynecol Oncol 1994; 53: 148-51.
29. Kataja V, Syrjänen SM, Mäntyjärvi R, Yliskoski M, Saarikoski S, Syrjänen K. Prognostic factor in cervical human papillomavirus infections. Sex Transm Dis 1992; 19: 154-60.
30. Dobbs SP, Hewett PW, Johnson IR, Carmichael J, Murray JC. Angiogenesis is associated with vascular endothelial growth factor expression in cervical intraepithelial neoplasia. Brit J Cancer 1997; 76: 1410-5.
31. Tjalma W, Van Marck E, Weyler J, et al. Quantification and prognostic relevance of angiogenic parameters in invasive cervical cancer. Brit J Cancer 1998; 78: 170-4.
32. Kainz C, Speiser P, Wanner C, et al. Prognostic value of tumour microvessel density in cancer of the uterine cervix stage IB to IIB. Anticancer Res 1995; 15: 1549-52.


ADRES DO KORESPONDENCJI


dr n. med. Bogdan Michalski
ul. Graniczna 63/36
40-018 Katowice
e-mail: bogdan@proloc.com.pl</sup>