Prognozowanie w rakach płaskonabłonkowych głowy i szyi na podstawie oceny proliferacji komórek nowotworowych

Nowotwory złośliwe charakteryzuje rozplem własnych, lecz zmienionych morfologicznie i funkcjonalnie komórek ustroju, który prowadzi do niszczenia prawidłowych struktur narządowych. Pierwotnie rozwój procesu nowotworowego jest miejscowy, a następnie dochodzi do zagnieżdżania się i namnażania komórek nowotworowych w narządach odległych. Komórki nowotworowe, zachowując zazwyczaj część cech charakterystycznych dla tkanki, z której powstały, ujawniają jednocześnie morfologiczne i funkcjonalne odróżnicowanie, wyrażające się utratą cech dojrzałości i specjalizacji czynnościowej, nabytych w rozwoju osobniczym. Inwazyjność i odróżnicowywanie się komórek nowotworowych mają zazwyczaj charakter postępujący. Z wielu obserwacji i doświadczeń wynika, że u podłoża rozwoju procesów nowotworowych leży zawsze przekształcenie, określane jako transformacja nowotworowa pojedynczych komórek i że raz nabyta cecha zdolności do ekspresji fenotypu nowotworowego, to jest zespołu cech morfologicznych i strukturalnych charakterystycznych dla komórek nowotworowych, jest w zasadzie nieodwracalna i przekazywana dziedzicznie komórkom potomnym [1, 2].


Histopatologiczne cechy raków
płaskonabłonkowych głowy i szyi

Nieustannie poszukuje się histologicznych i cytologicznych cech, które byłyby powszechnie akceptowane, a które można by wiązać z rokowaniem, co z kolei mogłoby mieć wpływ na dobór terapii. Nowotwory głowy i szyi to przede wszystkim raki płaskonabłonkowe. Raki te wywodzą się z nabłonka wielowarstwowego płaskiego albo gruczołowego, który uległ metaplazji płaskonabłonkowej. Są także doniesienia, iż raki płaskonabłonkowe powstają bezpośrednio z nabłonka migawkowego. Wygląd makroskopowy guza bywa różny. Opisuje się najczęściej wzrost egzofityczny lub płaskie powierzchowne rozprzestrzenianie się guza, tworzenie grzybiastych wyrośli z owrzodzeniem lub formy brodawczakowate. Niezależnie od tego czy nowotwór jest jedno- czy też wieloogniskowy, ma to samo utkanie histologiczne, zaś wieloogniskowy rozwój nowotworu jest na ogół jednoczasowy [3–7].

Raka płaskonabłonkowego klasyfikuje się wg
4-stopniowej skali określającej stopień dojrzałości histologicznej (G1–G4). Miano G1 oznacza raka wysoko dojrzałego. Jego utkanie składa się poligonalnych komórek, z dobrze widocznymi mostkami międzykomórkowymi i keratynizacją z formowaniem pereł rogowych. Jądra komórkowe są najczęściej hiperchromatyczne, nieregularne zarówno co do kształtu, jak i wielkości. Stosunek objętości jądra do objętości cytoplazmy jest przesunięty na korzyść jądra. Figury podziału są nieliczne. G2 oznacza raka miernie dojrzałego. Komórki mają podobne cechy histologiczne jak opisane powyżej, ale perły rogowe występują rzadziej lub wcale. Pojawiają się częstsze mitozy, które mogą być nieprawidłowe. G3 oznacza raka nisko dojrzałego. Utkanie tworzą komórki o znacznym pleomorfizmie jąder z hiperchromazją. Cytoplazma jest skąpa, mostki międzykomórkowe nieliczne lub niewidoczne. Mitoz jest dużo, często mają charakter atypowy. Cytokeratyny występują w małych ilościach. G4 to nowotwory najniżej dojrzałe (anaplastyczne), o tak bardzo niskim stopniu różnicowania, że ich dokładniejsze sklasyfikowanie przy użyciu podstawowych metod diagnostycznych jest niemożliwe. Często używa się w stosunku do nich określenia niezróżnicowany nowotwór złośliwy (neoplasma malignum anaplasticum).

Spotyka się również raki płaskonabłonkowe głowy i szyi, które zawierają ogniska komórek o jasnej cytoplazmie, komórki olbrzymie lub wrzecionowate. Te ostatnie mogą upodabniać utkanie raka do utkania mięsaka. Czasem widuje się takie zmiany po napromienianiu raka. Utkanie podobne do raka drobnokomórkowego w obrębie raka płaskonabłonkowego stanowi również rzadkość. Dla tych wszystkich postaci nowotworów również może służyć określenie nowotworu złośliwego niezróżnicowanego. W miarę pojawiania się coraz doskonalszych technik diagnostycznych, liczba nowotworów określanych tym mianem jest jednak coraz mniejsza.

Do niedawna jedyną informacją, jaką otrzymywał klinicysta było rozpoznanie histologiczne, potwierdzające i klasyfikujące chorobę nowotworową. Dodatkowo starano się, wykorzystując powyższe cechy histologiczne, określić stopień agresywności choroby nowotworowej. Najdłuższą historię dotyczącą porównań cech histologicznych i cytologicznych ma metoda stopniowania raka krtani wg Brodersa [9]. Wielu autorów przez dziesiątki lat stosowało tę metodę do porównań złośliwości nowotworów wszystkich tkanek i narządów. Ma ona niewątpliwie ograniczenia, wynikające z pewnego subiektywizmu w ocenie preparatów. Jednym ze sposobów omijających ograniczenia wynikające z podziału Brodersa, jest stosowanie systemu punktowego Jakobssona [2], który opiera się na rejestracji ośmiu cech mikroskopowych preparatów. Cztery z nich dotyczą charakteru utkania nowotworu i określają stopień dojrzałości, a cztery pozostałe odzwierciedlają związek między guzem a tkanką nienowotworową, otaczającą zmianę. Określają one sposób i stopień inwazji (łącznie z naciekaniem) oraz odpowiedź gospodarza. Do najważniejszych czynników rokowniczych co do 5-letnich przeżyć lub wznowy Jakobsson zalicza polimorfizm jąder, sposób inwazji i ogólną sumę punktów zebranych w tej skali. Niezależnie od klinicznego stopnia zaawansowania choroby chorzy, którzy mieścili się między 10 a 15 punktami nie mieli wznowy, natomiast ci, którzy uzyskali od 16 do 28 punktów mieli wznowę w 20 do 29%.

W preparatach mikroskopowych mogą występować artefakty, wynikające zarówno ze sposobu utrwalania tkanki i pobierania wycinków, jak i z samej procedury przygotowania preparatu. Mają one pewien wpływ na strukturę nukleoproteidów oraz innych składników komórek i tkanek, powodując tym samym zmiany obrazu morfologicznego. Te fakty musi brać pod uwagę histopatolog w ocenie preparatu i w przypadkach wątpliwych informować o tym klinicystę. Trzeba również pamiętać, iż nierzadko obraz mikroskopowy wycinka pobranego przed zabiegiem różni się od stwierdzonego w materiale pooperacyjnym. Niektórzy autorzy podkreślają istnienie różnic w charakterze utkania w częściach centralnych i obwodowych raków, co może tłumaczyć różnice wyników badania histologicznego [1, 4, 10]. Inni autorzy nie uznają klasyfikacji Jakobssona i proponują własne. Np. Glanz [11] uważa za istotne następujące parametry: stopień dojrzałości guza, naciekania naczyń i nerwów oraz komórkową odpowiedź chorego. Skala każdego z tych parametrów ma 3 punkty. Jeszcze inny system punktowy, uwzględniający stopień i charakter keratynizacji, nasilenie zmian jądrowych, liczbę mitoz, występowanie desmoplazji z lub bez nacieków zapalnych, obecność nacieków limfocytarnych w obrębie samego guza (TIL, ang. tumor infiltraiting lymphocytes) oraz charakter naciekania nowotworowego (w tym naczyń) proponują Crissman i Zarbo [1]. Skala każdego z tych parametrów ma 4 punkty.

Biologiczna złośliwość nowotworu rośnie wraz z jego polimorfizmem, a zmiany struktury jąder mają specjalne znaczenie prognostyczne, które wskazuje na zwiększenie ilości jądrowego DNA. Wysoki indeks mitotyczny jest także wskaźnikiem znacznej złośliwości biologicznej. Ekspansywny typ wzrostu nowotworów głowy i szyi ma również duże znaczenie prognostyczne. Guzy rosnące egzofitycznie później dają przerzuty niż naciekające. Równie ważna jest ocena tzw. frontu naciekania, gdzie obraz histologiczny może być inny niż, np. w centralnej części guza [1, 12]. Ocena wszystkich wymienionych wyżej czynników, pomocnych w prognozowaniu, cechuje pewna doza subiektywizmu, zależna od różnych właściwości oceniającego. Dlatego dąży się do wypracowania bardziej obiektywnych metod ich oceny.

Regulacja molekularna
cyklu komórkowego

Innym polem działania jest poszukiwanie nowych parametrów, pozwalających dokładniej określić prognozę w rakach głowy i szyi. Szczególnie owocne okazują się badania, dotyczące markerów proliferacji nowotworowej.

W organizmach żywych proliferacja komórek odbywa się na drodze cyklu komórkowego. Jest on niezbędnym elementem dla ich przeżycia. Sam proces podziału komórki jest bardzo skomplikowany i mimo znacznego postępu w tej dziedzinie, wiele z jego mechanizmów pozostaje nieznanych. Zadaniem zarówno mitozy, jak i mejozy jest przekazanie komórkom potomnym dokładnej kopii macierzystego materiału genetycznego. Dlatego procesy te poprzedza podwojenie ilości materiału genetycznego na drodze syntezy DNA. Obydwa procesy przebiegają na drodze aktywacji odpowiednich genów. Produkty tych genów sterują mechanizmami podziału, począwszy od syntezy DNA i kontroli jego jakości, aż po wytworzenie wrzeciona kariokinetycznego, przy pomocy którego dochodzi do rozdziału identycznych par chromosomów jako nosicieli materiału genetycznego. Musi również dojść do rozpadu, a następnie rekonstrukcji otoczki jądrowej oraz podziału komórki macierzystej na komórki potomne.



Cykl komórkowy składa się z interfazy, czyli okresu między dwoma kolejnymi podziałami komórki oraz samego podziału, czyli mitozy. W interfazie cyklu komórkowego wyróżnia się fazę G1 – między końcem mitozy a rozpoczęciem syntezy DNA, fazę syntezy DNA (S) oraz fazę G2 – między końcem syntezy DNA a początkiem mitozy. Podziały w populacji komórek przechodzących przez cykl komórkowy są zazwyczaj asynchroniczne, tzn. każda komórka znajduje się w określonym momencie w różnych fazach cyklu komórkowego. Odsetek komórek będących w danej fazie cyklu odpowiada procentowo stosunkowi czasu trwania tej fazy w odniesieniu do czasu trwania całego cyklu komórkowego. Jest to zależność, jaką wykorzystuje się do określenia czasu trwania poszczególnych faz i podfaz cyklu. Oceniając stan czynnościowy komórek, można podzielić je na proliferujące i nieproliferujące [13]. Komórki proliferujące to te, które przechodzą przez kolejne fazy cyklu komórkowego (G1, S, G2, M), w których dochodzi do replikacji DNA i podziału. Komórki nieproliferujące dzielą się na 2 podgrupy: pierwszą tworzą komórki w fazie G0, gdy pozostają w spoczynku i nie dzielą się aż do momentu zadziałania czynnika stymulującego wejście w cykl komórkowy. Drugą podgrupę tworzą zróżnicowanie i dojrzałe komórki, zdolne do wytwarzania substancji potrzebnych do rozwoju i czynności narządów, posiadające cechy komórek G1, ze zdolnością do syntezy i wydzielania, wchodzące w fazę S. Wykładnikiem stanu czynnościowego komórek jest ich aktywność proliferacyjna oraz aktywność syntezy, wydzielania i metabolizowania produktów odżywczych [14, 15]. Przyrost masy nowotworu jest najczęściej wynikiem rozplemu komórek przekształconych: odróżnia to procesy nowotworowe od wielu zmian tkankowych, np. zapalnych.
Proliferacja komórek prawidłowych może być wywołana przez czynniki uszkadzające, martwicę komórek i mechaniczną deformację tkanek [16–18]. Odgrywa kluczową rolę w regeneracji tkanek. Replikacja komórek jest kontrolowana głównie przez czynniki znajdujące się w mikrośrodowisku otaczającym komórki. Mogą one zarówno pobudzać (stymulatory), jak i hamować (inhibitory) proliferację. Nadmiar stymulatorów albo niedobór inhibitorów prowadzą do rozrostu zarówno komórek prawidłowych, jak i nowotworowych, jednak w przypadku tych ostatnich jest to proces niekontrolowany.



Czynniki stymulujące wzrost komórek (ang. growth factors) wywołują proliferację poprzez wpływ na ekspresję protoonkogenów, tzn. genów zaangażowanych w kontrolę prawidłowego cyklu komórkowego. Ekspresja tych genów jest ściśle kontrolowana podczas prawidłowego wzrostu komórek i regeneracji. Zmiany w strukturze protoonkogenów lub w regulacji ich ekspresji mogą przekształcić je w onkogeny, co przyczynia się do niekontrolowanej proliferacji komórek, charakterystycznej dla nowotworów złośliwych. Tak więc prawidłowa i nieprawidłowa proliferacja przebiega podobnymi ścieżkami. To, co odróżnia wzrost komórek nowotworowych od wzrostu komórek prawidłowych to utrata mechanizmów kontrolnych [16–18].

W warunkach prawidłowych proliferacja komórek jest najczęściej wywoływana poprzez związanie czynnika wzrostu ze swoistym receptorem na powierzchni błony komórkowej. Powoduje to przejściową, ograniczoną aktywację receptora (ma on właściwości białkowej kinazy tyrozynowej), a to z kolei pobudza szereg białek przenoszących sygnał do jądra komórkowego. W jądrze komórkowym dochodzi do indukcji i aktywacji jądrowych czynników regulacyjnych, zapoczątkowujących transkrypcję DNA. Końcowym efektem pobudzenia jest wejście komórki w cykl komórkowy, kończący się podziałem.

Przemiana nowotworowa prowadzi do szeregu zaburzeń na każdym z wyżej wymienionych etapów. Mogą one wynikać z obecności wadliwych białek (onkoprotein), kodowanych przez zmutowane protoonkogeny (tzn. onkogeny), albo z nadmiernej czy też niewłaściwej produkcji strukturalnie prawidłowych białek na skutek amplifikacji lub wzmożonej ekspresji kodujących je protoonkogenów. Onkoproteiny przypominają prawidłowe produkty protoonkogenów, są jednak pozbawione istotnych elementów regulacyjnych, a ich wytwarzanie nie jest zależne od czynników wzrostu czy też innych sygnałów zewnątrzkomórkowych [16–18].

Pobudzanie komórek do proliferacji przez czynniki wzrostu jest bardzo ważne w patogenezie wielu nowotworów (w tym głowy i szyi), jednak mutacje czy uszkodzenia w obrębie genów kodujących czynniki wzrostu są obserwowane rzadko (np. hst-1, int-2). Znacznie częściej wykazują one wzmożoną ekspresję, wynikającą z wadliwej czynności produktów innych onkogenów (np. białek ras, biorących udział w przekazywaniu sygnałów). Zmusza to komórkę do wydzielania dużej ilości czynników wzrostu, co może pobudzać proliferację tej samej komórki (stymulacja autokrynna) lub komórek leżących w sąsiedztwie (stymulacja parakrynna). Trzeba jednak zaznaczyć, że sama nadprodukcja czynników wzrostu nie jest wystarczająca do wywołania przemiany nowotworowej. Nasilona proliferacja, wynikająca z tej nadprodukcji powoduje jedynie zwiększenie ryzyka wystąpienia mutacji w danej populacji komórek.

Drugim elementem zaangażowanym w przewodnictwie sygnałów do wnętrza komórki są receptory, zlokalizowane na błonie komórkowej. Receptory dla czynników wzrostu są najczęściej białkami, składającymi się z części zewnątrzbłonowej (domena zewnątrzkomórkowa) wiążącej określoną substancję (tzn. liganda), części śródbłonowej oraz części leżącej po wewnętrznej stronie błony komórkowej (domena cytoplazmatyczna), będącej białkową kinazą tyrozynową. Prawidłowy receptor po związaniu z ligandem przyjmuje przejściowo postać aktywną (forma dimeryczna, złożona z 2 części), co powoduje fosforylację szeregu czynników będących częścią łańcucha reakcji, aktywujących w efekcie końcowym mitozę. Zmienione onkogennie wersje receptorów charakteryzują się przyjęciem na stałe formy dimerycznej i aktywacją bez konieczności wiązania liganda. Tak zmutowane receptory dostarczają komórce ciągłych sygnałów mitogennych. Podobny efekt wywoła zwiększona liczba prawidłowych receptorów, co obserwuje się w przypadku wzmożonej ekspresji lub amplifikacji genów kodujących ich białka. Taka sytuacja często ma miejsce w odniesieniu do grupy receptorów dla czynnika wzrostu naskórka (EGFR, ang. Epidermal Growth Factor Receptor). Geny kodujące 2 spośród nich (c-erb B1, c-erb B3) często wykazują nadmierną ekspresję w komórkach różnych nowotworów (np. raki płaskonabłonkowe płuc, raki piersi), natomiast trzeci (c-erb B2, zwany też c-neu lub HER2) ulega amplifikacji, m.in. w rakach piersi, jajników, płuc, żołądka. W rakach płaskonabłonkowych głowy i szyi amplifikacja c-erb B2 jest również spotykana [19–21] i wiąże się z pogorszeniem prognozy [19, 21]. Wcześniej zaobserwowano taki związek w rakach piersi.

Wykryto wiele onkoprotein, mających odpowiedniki w prawidłowych białkach, przenoszących sygnał z receptora błonowego do jądra. Większość z nich jest zlokalizowana na wewnętrznej powierzchni błony jądrowej. Najlepiej poznane są białka z grupy ras. Mutacje w obrębie genu ras są jednymi z częściej spotykanych w nowotworach człowieka, w tym w rakach głowy i szyi [22–24]. W warunkach prawidłowych nieaktywne białko tego typu jest związane z cząsteczką guanozynodwufosforanu (GDP). Pobudzenie receptora, np. przez czynnik wzrostu powoduje aktywację białka ras poprzez wymianę cząsteczki GDP na cząsteczkę guanozynotrójfosforanu (GTP). To z kolei pobudza system kinaz MAP (ang. Mitogen Activated Protein kinase). Ostatnia z nich (ERK) aktywuje poprzez fosforylację swoiste czynniki regulujące transkrypcję DNA w jądrze komórkowym (np. c-jun, c-fos) i pobudza komórkę do podziału. Stan pobudzenia białka ras jest przejściowy, ponieważ mają one wewnętrzną aktywność GTP-azy, enzymu hydrolizującego GTP do GDP. Aktywność ta jest dodatkowo wzmacniana (ponadtysiąckrotnie) przez wiązanie białek GAP (ang. GTPase-activating proteins). Zmutowane postacie białek ras wiążą GAP, ale nie powoduje to wzmożenia aktywności GTP-azy. Powoduje to utrzymanie stanu pobudzenia i ciągłego wysyłania sygnałów mitogennych do jądra komórkowego. Białka ras biorą również udział w regulacji cyklu komórkowego poprzez wpływ na układ cyklin i kinaz cyklinozależnych (CDK). Układ ten ma zasadnicze znaczenie dla przejścia komórki z fazy G0 do fazy S (patrz dalej). Na czym polega udział ras w tej regulacji dotychczas nie wyjaśniono.



Spośród wielu białek biorących udział w regulacji jądrowej transkrypcji DNA jednym z najważniejszych jest białko kodowane przez protoonkogen c-myc. Jest on jednym z genów, które są indukowane w czasie wchodzenia komórki do cyklu komórkowego. Zahamowanie ekspresji tego genu uniemożliwia komórkom wejście w fazę S. Produkt tego genu może najprawdopodobniej również brać udział w kierowaniu komórki na drogę apoptozy (tzw. programowana śmierć komórki). Ekspresja tego białka podczas prawidłowego cyklu komórkowego jest ściśle kontrolowana i przejściowa, natomiast w wersji onkogennej wykazuje ono ekspresję ciągłą albo wzmożoną. Zaburzenia regulacji ekspresji c-myc są obserwowane w wielu nowotworach złośliwych, również w rakach głowy szyi [24–26]. W przypadkach raków płaskonabłonkowych języka ekspresja tego genu pogarsza rokowanie [26].



Końcowym efektem działania czynników pobudzających komórkę do proliferacji jest jej wejście do cyklu komórkowego. Przechodzenie komórki przez poszczególne fazy cyklu jest sterowane przez cykliny i kinazy cyklinozależne (CDK, ang. cyclin-dependent kinases) oraz ich inhibitory. Mutacje w genach kodujących te regulatory zostały zidentyfikowane w wielu nowotworach człowieka. W komórkach prawidłowych, CDK kierują cyklem komórkowym poprzez fosforylację i defosforylację białek, które są niezbędne dla przejścia komórki do następnej fazy cyklu. Wprawdzie CDK są obecne przez cały czas trwania cyklu, to jednak ich aktywność jest ograniczona do ściśle określonych momentów cyklu. Są one uruchamiane na drodze fosforylacji po związaniu z cyklinami. Cykliny, w odróżnieniu od CDK są syntetyzowane tylko podczas określonych faz cyklu komórkowego. Po wykonaniu swoich zadań (tzn. aktywacji CDK) ulegają bardzo szybkiej degradacji. Przeciwną do cyklin funkcję mają inhibitory CDK.

Szczególnie ważnym momentem cyklu komórkowego jest przejście komórki z fazy G1 do fazy S – jeżeli komórka przekroczy ten punkt cyklu, może podzielić się bez dalszej stymulacji ze strony czynników wzrostu. Po otrzymaniu sygnału mitogennego, we wczesnej fazie G1, następuje pobudzenie syntezy cykliny typu D, która wiąże się z CDK4 i CDK6. W późniejszym okresie fazy G1 syntetyzowana jest cyklina E, wiążąca się z CDK2. Kompleksy cyklina D/CDK4, cyklina D/CDK6 oraz cyklina E/CDK2 fosforylują białko Rb (pRb, ang. retinoblastoma protein), unieczynniając je. Jest to przełomowy moment, ponieważ pRb w postaci aktywnej wiąże się z czynnikami regulującymi transkrypcję z grupy E2F. Fosforylacja pRb powoduje uwolnienie czynników E2F, co umożliwia transkrypcję genów, niezbędnych dla przejścia przez komórkę fazy S (produktami tych genów są, np. polimeraza DNA, kinaza tymidyny). Cykliną produkowaną w fazie S jest cyklina A, wiążąca CDK2 i CDK1. Rola kompleksów cyklina A/CDK2 i CDK1 nie jest w pełni poznana. Natomiast we wczesnej fazie G2 pojawia się cyklina B, tworząca kompleksy z CDK1, wspomagając w ten sposób przejście komórki do mitozy (faza M).

Aktywność CDK jest hamowana przez 2 grupy inhibitorów (CDKI, ang. CDK inhibitors). Jedna grupa zawiera białka p21, p27 i p57 i hamuje różne CDK. Druga działa wybiórczo na kompleksy cyklina D/CDK4 i cyklina D/CDK6. Do tej grupy zalicza się białka p15, p16, p18, p19. Grupa ta nazywana jest INK4 (ang. Inhibitors of CDK4 and CDK6).

Mutacje, które rozregulowują działanie układu cyklin, CDK i ich inhibitorów powodują wzmożoną i niekontrolowaną proliferację komórek. Nadmierna ekspresja lub amplifikacja genów kodujących cyklinę D lub CDK4 jest spotykana w wielu nowotworach złośliwych, w tym w rakach głowy i szyi (cyklina D) [24, 27–38] (CDK4); [34–35]. Stwierdzono obecność związków pomiędzy ekspresją cykliny D a wystąpieniem przerzutów do węzłów chłonnych [29, 37] czy też wczesnych wznów [31].



Niezwykle istotne dla kontroli proliferacji komórek są również geny, które hamują ten proces. Są to tzw. antyonkogeny lub geny przeciwnowotworowe (supresorowe). Utrata ich fizjologicznej funkcji prowadzi do wzmożonej aktywności proliferacyjnej. Uszkodzenia funkcji tych genów odgrywają kluczową rolę w wielu (o ile nie we wszystkich) nowotworach. Pierwszym odkrytym genem tego typu był gen Rb, związany z siatkówczakiem (retinoblastoma) u dzieci. Ten rzadko spotykany nowotwór jest w ok. 40% dziedzicznie uwarunkowany. W tych przypadkach dziedziczona jest jedna nieaktywna kopia tego genu (pochodząca od jednego z rodziców), natomiast druga kopia jest prawidłowa. Aby wystąpił nowotwór potrzebna jest mutacja w niezmienionej kopii – utracona jest wtedy całkowicie prawidłowa funkcja genu. Ponieważ do wystąpienia nowotworu niezbędna jest homozygotyczność w zakresie uszkodzonego genu (inaczej mówiąc dochodzi do utraty heterozygotyczności w zakresie normalnego genu), geny tego typu określa się mianem recesywnych genów rakowych.



Zarówno czynniki hamujące wzrost, jak i mechanizmy zaangażowane w przewodzenie sygnałów przez nie wywołanych są dużo gorzej poznane niż w przypadku czynników mitogennych. Przypuszcza się, że sekwencja zdarzeń jest podobna do opisywanej w odniesieniu do tych drugich; pobudzenie receptora, przeniesienie sygnału do jądra komórkowego, wpływ na regulację cyklu komórkowego i transkrypcji DNA. Antyonkogeny kodują najprawdopodobniej różne składowe, niezbędne do prawidłowego przejścia poprzez poszczególne etapy tej drogi. Najwięcej danych zgromadzono dotychczas na temat tych antyonkogenów, które kontrolują cykl komórkowy i transkrypcję jądrowego DNA. Są one najważniejsze dla regulacji podziału komórki.

O produkcie jednego z nich, pRb, wspomniano już przy okazji omawiania przejścia komórki z fazy G0 do fazy S cyklu komórkowego. Jest to ten sam gen, który odpowiada za występowanie siatkówczaka, jednak zmiany w jego zakresie obserwowane są również w innych nowotworach. Omówiony uprzednio mechanizm działania produktu tego genu – pRb – wskazuje na jego istotną rolę w regulacji cyklu komórkowego. Utrata jego funkcji prowadzi do niekontrolowanego przejścia komórki do fazy S cyklu. Od tego momentu droga do podziału nie wymaga dalszej stymulacji przez czynniki wzrostu. Zmiany zarówno w ekspresji genu Rb, jak i jego produktu (pRb) są opisywane w wielu nowotworach, w tym w rakach głowy i szyi, jednakże ich wartość prognostyczna nie jest jednoznacznie określona [25, 30, 33, 34, 36, 39–43].

Podobny efekt będzie miało uszkodzenie inhibitorów kompleksów cyklina/CDK, odpowiedzialnych za dezaktywację prawidłowego białka pRb (p15, p16, p18, p19, p21, p27 i p57). Szczególnie często stwierdza się zmniejszenie aktywności p16 (INK4a). W rakach głowy i szyi opisywano również inaktywację p15, p21, p27 [24, 26, 31–33, 35, 44–58]. Znaczenie rokownicze tych znalezisk nie jest jeszcze do końca określone, wydaje się jednak, że mogą one wskazywać na gorszą prognozę [26, 44, 48, 55, 57, 58].



Innym dość dobrze poznanym genem, zaliczanym do grupy genów przeciwnowotworowych, jest gen p53. Mutacje w jego obrębie są najczęściej spotykanymi w nowotworach człowieka (w ponad 50% przypadków). Dziedziczna forma mutacji tego genu nosi nazwę zespołu Li-Fraumeni. W zespole tym wzrasta ok. 25-krotnie ryzyko wystąpienia różnorakich nowotworów w wielu narządach, nie wyłączając obszaru głowy i szyi [59]. Białko kodowane przez gen p53 pełni rolę nadzorczą, zapobiegającą podziałowi komórki z uszkodzonym materiałem genetycznym. Białko to wykonuje swoją funkcję poprzez kontrolowanie transkrypcji kilku innych genów. W warunkach fizjologicznych ma ono krótki okres półtrwania (ok. 20 min), dlatego jest praktycznie niewykrywalne w prawidłowym cyklu komórkowym. W przypadku uszkodzenia DNA jego poziom gwałtownie wzrasta. Wiążąc się z DNA, pobudza transkrypcję genów zdolnych do zatrzymania cyklu komórkowego (p21) lub wywołujących apoptozę. p21 nie pozwala komórce wejść w fazę S, dając tym samym czas na naprawę uszkodzonego DNA. Naprawa jest wspomagana przez produkt genu GADD45, którego transkrypcja jest również wywoływana przez białko p53. Jeśli naprawa DNA powiedzie się, białko p53 aktywuje gen mdm2, którego produkt je unieczynnia. Tym samym cykl komórkowy zostaje odblokowany. Jeżeli jednak naprawa DNA jest niemożliwa, białko p53 aktywuje geny wywołujące apaptozę (bax i IGF--BP3). Mutacje w obrębie genu p53 najczęściej uniemożliwiają transkrypcję genów zależnych od białka p53. W takich przypadkach komórka nie może naprawić uszkodzonego DNA i mutacje zostają utrwalone w kolejnych podziałach. Może to prowadzić do przekształcenia nowotworowego komórki.

Podobny efekt można zaobserwować w przypadkach nadekspresji genu mdm2, degradującego prawidłowe białko p53.

Mutacje genu p53 są najprawdopodobniej zasadniczymi zmianami w kancerogenezie w obrębie nowotworów głowy i szyi, jednakże ich znaczenie prognostyczne jest ciągle niejednoznacznie określone [24-26, 28, 32, 34, 39, 40, 53, 55, 60-66].

Ekspresja genu mdm2 jest obserwowana rakach jamy ustnej [65, 67] i ma związek z obecnością przerzutów w węzłach chłonnych [67].



Innym mechanizmem, na drodze którego prawidłowy gen p53 może hamować proliferację komórek nowotworowych jest związany z aktywacją tego genu przez hipoksję [68]. Hipoksja z kolei może być wywołana przez słabe unaczynienie guza. Gen p53 ma zdolność hamowania tworzenia nowych naczyń poprzez wywoływanie produkcji inhibitora angiogenezy thrombospondyny-1. Mutacje p53 prowadzą z jednej strony do ignorowania przez komórkę nowotworową hipoksji (brak indukcji apoptozy), z drugiej zaś poprawiają utlenowanie komórek nowotworowych poprzez zachwianie równowagi pomiędzy czynnikami stymulującymi i hamującymi angiogenezę, na korzyść tych pierwszych.

Funkcję nieco zbliżoną do genu p53 ma odkryty w 1997 r. gen p73 [69, 70]. Jego rola w kancerogenezie w obrębie głowy i szyi wydaje się niewielka [71].
Innym genem supresorowym jest FHIT, opisany w roku 1996 [72, 23]. Jego utrata jest często spotykana w rakach głowy i szyi. W rakach języka został uznany za istotny czynnik prognostyczny [74].



Geny, zawiadujące programowaną śmiercią komórki czyli apoptozą, są równie ważne dla wzrostu nowotworu, jak onkogeny i antyonkogeny. Poznano bardzo dużo genów zarówno pobudzających (proapoptotyczne), jak i hamujących apoptozę (antyapoptotyczne). Geny hamujące apoptozę to np. bcl-2, bcl-xL, natomiast geny proapoptotyczne to np. bax, bad, bid, bcl-
-xS. Funkcje tych genów i ich produktów, jak również procesy biochemiczne, prowadzące do apoptozy są w ostatnich latach przedmiotem bardzo intensywnych badań. Mimo to nie są do końca poznane. W uproszczeniu można założyć, że stosunek ilościowy czynników pro- i antyapoptotycznych decyduje o tym, czy komórka po otrzymaniu odpowiedniego bodźca wejdzie na drogę apaptozy. Dla komórek nowotworowych korzystna jest albo nadprodukcja czynników hamujących apoptozę lub też niedobór czynników ją promujących. Wzmożoną ekspresję białka bcl-2 (o działaniu antyaoptotycznym) zaobserwowano pierwotnie w chłoniaku Burkitta, jednak później stwierdzono ją również w innych nowotworach. W rakach płaskonabłonkowych głowy i szyi obecność bcl-2 jest opisywana [60, 63, 75, 76] i może wskazywać na oporność na leczenie promieniowaniem [75]. Niedobór czynników promujących apoptozę obserwuje się z kolei w zaburzeniach funkcji p53, powodujących utratę zdolności stymulacji przez to białko produkcji bax (patrz wyżej). Znaczenie prognostyczne obecności bax w rakach głowy i szyi nie zostało jednoznacznie dowiedzione [26, 76].



W ostatnich latach odkryto jeszcze jeden mechanizm kontrolujący podziały komórkowe – układ telomerazy. Wiadomo od dawna, że komórki prawidłowe nie mogą dzielić się w nieskończoność. W hodowlach komórkowych po pewnej liczbie podziałów komórki zostają zatrzymane w stanie spoczynku, po czym obumierają [77]. Nie jest znany sposób, w jaki komórki liczą swoje podziały, jednak zauważono, że każdy podział powoduje skrócenie tzw. telomerów, czyli struktur umiejscowionych na końcach chromosomów. Gdy skracanie telomerów przekracza pewien punkt, następuje ich unieczynnianie, co z kolei pociąga za sobą fuzję chromosomów (koniec do końca) i śmierć komórki. Tak więc telomery spełniają funkcję licznika podziałów danej komórki. Zaobserwowano również, że w bardzo intensywnie dzielących się komórkach germinalnych telomery nie ulegają skracaniu. Umożliwia to aktywność enzymu zwanego telomerazą, który odtwarza telomery. Enzym ten jest nieobecny w większości komórek somatycznych. Wprowadzając telomerazę do komórek prawidłowych udaje się przedłużyć ich życie, co potwierdza hipotezę, że utrata telomerów jest przyczynowo związana z utratą zdolności replikacyjnych komórek. Wiadomo, że komórki nowotworowe w przeciwieństwie do komórek prawidłowych mogą w hodowlach dzielić się bez ograniczeń (określa się to mianem nieśmiertelności). Wynika to z jednej strony z opisywanych uprzednio zaburzeń regulacji cyklu komórkowego, jednakże konieczne jest też uruchomienie mechanizmów zapobiegających skracaniu telomerów. Oczywistym wydaje się w takiej sytuacji konieczność reaktywacj telomerazy w komórkach nowotworowych. I rzeczywiście, reaktywację taką stwierdza się w większości nowotworów [16]. Te nowotwory, które nie posiadają telomerazy, potrafią wydłużać telomery na innej drodze [16]. Komórki raków głowy i szyi zawierają telomerazę [58, 78–84], jednak dotychczas nie udało się wykazać wartości prognostycznej tego faktu [82]. Wykazano jednak związek pomiędzy obecnością telomerazy a wystąpieniem przerzutów w węzłach chłonnych [58].
Liczba nowych informacji dotyczących czynników biorących udział w proliferacji komórkowej i ich roli w kancerogenezie jest bardzo duża. Z pewnością pozwala to na lepsze zrozumienie mechanizmów transformacji nowotworowej, jak również jest podstawą do opracowywania nowych, bardziej niż dotychczasowe precyzyjnych metod diagnostycznych i skuteczniejszych metod leczenia. Niestety, do praktycznego, powszechnego wykorzystania tych danych jest jeszcze daleko.

To samo odnosi się do zastosowania ich w celu określenia prognozy przebiegu choroby nowotworowej. W związku z tym wydaje się, że nadal znacznie częściej będzie się wykorzystywać ocenę tych parametrów, które znane są od nieco dłuższego czasu i których przydatność rokownicza jest lepiej poznana.

Widomym znakiem, że komórka znajduje się w cyklu komórkowym jest mitoza. Można ją zaobserwować przy pomocy mikroskopu świetlnego, można też je policzyć. Zwiększenie liczby mitoz jest związane ze zwiększoną niedojrzałością nowotworów, a tym samym z bardziej agresywnym przebiegiem klinicznym. Liczba mitoz jest kryterium stosowanym w większości systemów, określających stopień złośliwości histologicznej. Jednakże mitoza jest jedynie fragmentem cyklu komórkowego i to wcale nie najdłuższym. Dlatego większość komórek znajdujących się w cyklu komórkowym umyka naszej uwadze, ponieważ fazy G1, S i G2 nie wywołują zmian zauważalnych w preparacie histologicznym, barwionym rutynowo. Z pomocą idą nam tu przeciwciała przeciwko takim antygenom proliferacyjnym, jak Ki67 i PCNA.


Antygeny proliferacyjne

Przeciwciała monoklonalne Ki67 mogą wykrywać jądrowy antygen, który jest obecny tylko w komórkach proliferujących. Obecność ludzkiego antygenu jądrowego, który jest związany z proliferacją komórek, była rozpoznawana przez ludzkie autoprzeciwciała identyfikowane w surowicy niektórych pacjentów z toczniem rumieniowatym. Podobne przeciwciała zostały wykryte przez Kleina [85] w surowicy pacjentów z białaczką. Ki67 należy do klasy IgG1 mysich przeciwciał monoklonalnych, których poziom wzrasta przeciw niedojrzałej frakcji jądrowej w chorobie Hodgkina. Pochodzą one z linii komórkowej L428. Przeciwciała te po raz pierwszy zostały zidentyfikowane w Kilonii w Niemczech i z tego powodu otrzymały skrót Ki. Najlepszy klon produkujący przeciwciała znajdował się na 67 płytce hodowli tkankowej i dlatego została przyjęta nazwa Ki67. Gerdes i wsp. [86, 87] wykazali, że Ki67 pojawia się nieprzerwanie we wszystkich stadiach cyklu komórkowego z wyjątkiem G0. Komórki odpoczywające w cyklu komórkowym od G0 do wczesnej fazy G1 nie posiadają antygenu Ki67. Niektórzy autorzy [86, 88, 89] dowiedli, że ilość antygenu Ki67, obecna w komórkach proliferujących, jest różna w zależności od fazy cyklu komórkowego. Sasaki i wsp. [90] dowiedli, że antygenowa ekspresja wzrasta w toku cyklu komórkowego, a mianowicie wzrost następuje w końcowej fazie S i osiąga szczyt w fazie G2 i M. Topograficzny rozkład antygenu jest również zależny od fazy cyklu komórkowego. Braun i wsp. [91] ocenili rozkład antygenu Ki67 w komórkach płucnych embrionu ludzkiego. Zaobserwowali różny wzór barwienia podczas interfazy i mitozy. W późnej fazie G1 antygen Ki67 był obecny w strefie okołojądrowej, w fazie S antygen był rozmieszczony homogennie w strukturze jądra, natomiast w fazie G2 barwienie w obrębie jądra było mieszane. Intensywność barwienia zmniejsza się gwałtownie podczas anafazy i telofazy.

Baisch i Gerdes [92] zaobserwowali rozbieżności pomiędzy pomiarem aktywności proliferacyjnej komórek za pomocą przeciwciał monoklonalnych Ki67 a innymi technikami (kolchicyna, bromodezoksyurydyna). Wyższe wartości proliferacyjne, uzyskane na podstawie Ki67 w porównaniu z innymi metodami tłumaczą pozbawieniem odżywiania komórek, a co za tym idzie – powolnym wzrostem i stałą ekspresją antygenu Ki67. W przeciwieństwie do tych odkryć, Verheijen i wsp. [93] zademonstrowali utratę antygenu Ki67 w komórkach pozbawionych odżywiania, ale nadal obecnych w poszczególnych fazach cyklu komórkowego S, G2 i M, określonych i mierzonych przy użyciu DNA cytometrii przepływowej. Występowanie komórek, pozostających stale w stanie proliferacji i pozbawionych antygenu Ki67 jest niejasne. W nowotworach cechujących się zwiększoną proliferacją ważnym elementem jest możliwość dostarczania odpowiednich czynników odżywczych (odpowiednio rozbudowana sieć naczyń krwionośnych). Faktycznie, fenomen odżywiania może być odpowiedzialny za zmienne rezultaty uzyskiwane przez Walkera [94], który badał frakcje wzrostu guzów płuc przy zastosowaniu Ki67 oraz porównywał uzyskiwane wyniki z fazą S określaną przy użyciu DNA cytometrii przepływowej. Verheijen i wsp. [93], używając confocal scanning laser microscopy oraz mikroskopu elektronowego wykazał, że antygen Ki67 jest zlokalizowany podczas interfazy w otoczce jądrowej oraz w gęstych składnikach cytoplazmy wokół włókienek.

Do tej pory charakter oraz ciężar cząsteczkowy antygenu pozostaje nieokreślony. Ostatnio Scott i wsp. [95] opisali 3 jednakowe białka, które reagują z przeciwciałami Ki67 i których ciężar cząsteczkowy zawiera się w zakresie 35-40 kD. Schonk i wsp. [96] oznaczyli gen(y), obejmujący swoją ekspresją antygen Ki67, należący do ludzkiego chromosomu 10.

W normalnym nabłonku antygen jądrowy Ki67 ograniczony jest do wyizolowanych komórek, graniczących z błoną podstawną. W dysplazji oraz w carcinoma in situ, komórki ujawniające pozytywny odczyn dla Ki67 czasami występują na całej długości i grubości skrawka. W raku inwazyjnym pozytywne komórki są widoczne w obwodowych częściach guza [88]. Lorz i wsp. [97], w odniesieniu do raków płaskonabłonkowych głowy i szyi, uzyskali pozytywną korelację między stopniem dojrzałości histologicznej a obecnością Ki67.

Ocena właściwości kinetycznych komórek może być pomocna w podstawowej histologicznej klasyfikacji nowotworów oraz w zrozumieniu warunków dla rozwoju procesów nowotworowych. Mechanizm replikacji simian virusa 40 (SV40) – wirusa wakuolizującego – jest podobny do mechanizmu replikacji komórkowych chromosomów, skutkiem czego dostarcza on doskonałego modelu do badań enzymatycznych, wymaganych do replikacji DNA. Do replikacji wirusa potrzebny jest produkt tylko jednego genu (large T-antigen), tak więc większość replikujących enzymów musi być komórkowa. Enzymatyczna aktywność, związana z replikacją i fazą S cyklu komórkowego, jest wywołana poprzez infekcję wirusem SV40. Ekstrakt wolnych komórek – pochodzących z komórek ludzkich – uzupełniony oczyszczoną immunologicznie SV-40-large T antigen, podtrzymuje skutecznie replikacje w plazmidiach, które zawierają oryginalny SV40 w replikującym DNA. Przy użyciu tego modelu po raz pierwszy oczyszczono i zidentyfikowano in vitro białko komórkowe o relatywnym ciężarze cząsteczkowym 36,000 (Mr=36K), które jest potrzebne do wydłużenia replikacji DNA. Zostało ono nazwane komórkowym białkiem regulującym cykl komórkowy lub alternatywnie – proliferating cell nuclear antigen (PCNA) [98–102]. Jest to kwaśny polipeptyd, składający się z 261 aminokwasów. Zanotowano również, że fizyczne właściwości PCNA są takie same, jak białka regulującego aktywność DNA cielęcej grasicy (polimeraza delta). Dodatkowo stwierdzono, że PCNA i polimeraza delta – białko pomocnicze, mają podobne właściwości elektroforetyczne i obydwie formy są rozpoznawane przez ludzkie autoprzeciwciała (anty-PCNA) [103]. PCNA jest białkiem jądrowym, którego ekspresja związana jest z fazą S cyklu komórkowego. Białko to zostało opisane niezależnie przez Bravo i Celis (H24), którzy wykorzystywali dwuwymiarowy żel do badań elektroforetycznych komórek proliferujących i spoczynkowych oraz przez Miyachi i wsp. [104], którzy do badań używali ludzkich przeciwciał od pacjentów chorujących na toczeń rumieniowaty. PCNA okazał się bardzo użytecznym markerem proliferacyjnym. W ostatnim czasie postępem okazało się wyprodukowanie całego szeregu przeciwciał monoklonalnych przeciwko PCNA, włącznie z PC10, które reagują w preparatach mrożonych i parafinowych. Ilość PCNA wzrasta w późnej fazie G1 oraz S cyklu komórkowego, a następnie spada od G2/M do G1 [105–106]. Ilościowa analiza przeprowadzona przez Giroda i wsp. [107] wskazuje na wyraźny wzrost ekspresji PCNA w momencie przejścia nabłonka normalnej błony śluzowej krtani w wysoko dojrzałego raka płaskonabłonkowego. Munck-Wikland i wsp. [108] oceniali stopień wybarwienia dla PCNA we wczesnych rakach głośni przed leczeniem oraz we wznowach, które wystąpiły po pełnym kursie radioterapii. Ekspresja PCNA znacznie się różniła w obu przypadkach. Wczesne wznowy charakteryzował znacznie niższy poziom ekspresji PCNA w porównaniu z guzem pierwotnym.


DNA ploidia

Do technik – stosowanych od kilku lat szczególnie chętnie – należy analiza DNA ploidii komórek guza. Nazwę DNA ploidia wprowadzono w roku 1984, na podstawie decyzji komitetu powołanego przez Towarzystwo Analitycznej Cytologii (Society of Analytical Cytology), dla odróżnienia nazwy ploidia komórkowa, opartej na określeniu liczby chromosomów w komórkach [109–114]. Cytometry przepływowe mogą wykonywać badania większej liczby niż 10 tys. jąder komórkowych. Tym samym zdecydowanie zmniejszył się błąd metody. W cytometrach oceny obrazowej można było zbadać niewiele ponad tysiąc jąder. Z badań prowadzonych przez wielu autorów i dotyczących różnych typów nowotworów wynikają niejednoznacznie brzmiące wnioski co do przydatności tych badań w ocenie utkania nowotworów. Analiza tych doniesień pozwala stwierdzić, iż przeważa stanowisko, że w utkaniu o typie G1 dominuje diploidalny charakter jądrowego DNA. W nowotworach o większej złośliwości występują w coraz większej liczbie komórek cechy DNA aneuploidio-poliploidii [115, 116]. Niektórzy autorzy podnoszą sprawę pewnej współzależności charakteru ploidii i występowania wznowy [93, 117–120]. Według tych autorów wzór diploidalny dotyczy nowotworów, które nie powodują wznowy. Inni autorzy podkreślają, iż nie wszystkie diploidalne guzy były wolne od wznowy [121–122]. Część autorów twierdzi, że charakter ploidii nie ma związku ze stopniem klinicznego zaawansowania choroby, a w części guzów nawet ze stopniem ich histologicznego zróżnicowania czy dojrzałości [123, 124]. Kilku autorów podkreśla wyraźny związek znacznej heterogenności charakteru ploidii DNA z niekorzystną prognozą [125–129]. Badania ploidii DNA w tkankach świeżych, nieutrwalonych, a więc niekontrolowanych histologicznie (w tej części, która była poddana analizie DNA), mogą dać błędną odpowiedź, co wynika z obecności komórek nacieku zapalnego, które niewątpliwie są komórkami diploidalnymi i często są obecne w utkaniu raków krtani. Spotyka się również często wykładniki infekcji, zarówno bakteryjnej, jak i grzybiczej. Można uznać, iż ocena jądrowego DNA z preparatów parafinowych może być wolna od opisanego powyżej błędu, ponieważ do badań wybiera się materiał kontrolowany histologicznie [130]. W cytowanych wyżej pracach używano różnych technik, dlatego wyniki te nie muszą być porównywalne [131–140].



Do analizy ploidii DNA w komórkach proliferujących obecnie używa się dwóch technik: cytometrii przepływowej DNA i cytometrii obrazowej. Znacznie więcej cytowań podkreśla przydatność techniki cytometrii przepływowej, przede wszystkim dlatego, iż szybko analizuje duże populacje komórkowe, co znacznie zwiększa wiarygodność wyników. W cytometrii przepływowej materiałów nieutrwalonych nie jest możliwa bezpośrednia morfologiczna kontrola struktury jąder i cytoplazmy liczonych komórek. Ponadto w odniesieniu do jąder, może także oznaczać trudności w oznaczaniu lub wyszukiwaniu nielicznych aneuploidalnych komórek (Cornelisse i wsp. [141], Bowman i wsp. [142], Wresto i wsp. [143]). Jakość histogramów DNA cytometrii także może nie być optymalna, ze względu na istnienie fragmentów jądrowych, pojawiających się w czasie enzymatycznego, a przede wszystkim mechanicznego rozdrabniania tkanek dla uzyskania zawiesiny komórek. Ma to wpływ na ocenę wielkości odsetka komórek znajdujących się w fazie S i S + G2/M. Użyty w pracy system algorytmów, korygujących wyniki poprzez odrzucanie agregatów komórkowych i resztek jądrowych, zdecydowanie poprawia precyzję oznaczeń aktywności proliferacyjnej populacji komórek. Istnieje wiele trudności przy oznaczaniu komórek tetraploidalnych. Często są to komórki duże, ulegające łatwo uszkodzeniu w trakcie opracowania materiału, dlatego niektórzy autorzy (Felman i wsp. [144], Zbieranowski i wsp. [146]) podkreślają, iż w cytometrii przepływowej i obrazowej komórki te mogą być pominięte w liczeniu. Zbieranowski [146] pisze o tym także przy użyciu techniki wykorzystującej materiał z parafiny. Z drugiej strony, analiza tkanek zatopionych w parafinie stwarza możliwości pełnej kontroli materiału wziętego do badań. W tym miejscu należy jednak wyraźnie podkreślić, iż kluczowe znaczenie dla poprawności oznaczeń ma jakość preparatyki. Przedłużone utrwalanie – powyżej 30 min w utrwalaczu o nieodpowiednim składzie i zatopienie do parafiny o wyższej temperaturze topnienia powoduje powstawanie wielu artefaktów. Grace i wsp. [146] w 1989 r. stwierdzili, iż precyzja oznaczeń ilości DNA w preparatach świeżych jest wyższa aniżeli w peletach otrzymanych z preparatów parafinowych lub cytometrii obrazowej. Świeże preparaty pozwalają na znalezienie komórek nieomal diploidalnych. Lanningan i wsp. [127] przez zastosowanie cytometrii obrazowej w identyfikowaniu DNA aneuploidalnych komórek ujawnili, iż w preparatach zatopionych w parafinie DNA aneuploidalne komórki były schowane w szerokim piku DNA diploidalnym. Inną opinię przedstawia Zbieranowski [146]. Różnice zdań mogą wynikać, jak to już wcześniej podkreślano, z zastosowanej odmiennej obróbki materiału biologicznego oraz czułości przyrządów pomiarowych. Z powodu różnych opinii co do stosowanych technik Bacus i wsp. [109] oraz ESCAP-Task Force on Standarization of Quantitative Methods in Diagnostic Pathology opublikowali rekomendowane techniki w DNA cytometrii. Biorąc pod uwagę ogromne piśmiennictwo przedmiotu, dotyczące oznaczeń fazy cyklu komórkowego w komórkach nowotworowych należy podkreślić, iż wiarygodność uzyskanych danych nie może zostać przeceniona. Innym aspektem – istotnym w ocenie uzyskanego odczytu – jest niewątpliwie obszar tkanki pobrany do badań. Ploidia DNA i aktywność proliferacyjna komórek mogą być różne w różnych częściach topograficznych indywidualnych nowotworów. Heterogenność ploidii DNA w niektórych, niekiedy nawet małych obszarach, była znajdowana tak w nowotworach, jak i zmianach przednowotworowych (Shackney i wsp. [148, 149], Yonemura i wsp. [129], Van den Houte i wsp. [150], Carey i wsp. [125]). Niektórzy autorzy sugerują, że wielorakie wyniki dotyczące tego samego guza mogą poprawić wykrycie heterogenności populacji komórkowych w obrębie tego samego nowotworu (Heiden i wsp. [151]). Pokazano, że proliferujące komórki nowotworowe nie są równomiernie rozmieszczone w utkaniu nowotworu. Różnice w aktywności proliferacyjnej zależą od dostępności substancji odżywczych i tlenu; dotyczy to nowotworów układowych (chłoniaki), a przede wszystkim nowotworów litych (Garcia i wsp. [152], Quinn i wsp. [153]. Z tego powodu w ostatnich latach stosuje się szereg technik, określających za pomocą przeciwciał monoklonalnych antygeny proliferacyjne (MIB-1, PCNA, KI-S1).



Największe opracowania, podsumowujące wyniki badań opartych na dużych grupach nowotworów głowy i szyi, liczone w tysiącach przypadków, opierają się na analizie materiału klinicznego popartej rutynowym badaniem morfologicznym. Jednak te informacje dawno przestały być wystarczające. Nie uwzględniają bowiem dostatecznie warunków wpływających na rokowanie. Większość badań biologicznych, dotyczących raków głowy i szyi oparta jest na wynikach uzyskanych różnymi technikami laboratoryjnymi. Należy je standaryzować, jak również dokonywać merytorycznej selekcji. Z całą odpowiedzialnością można powiedzieć, że prognozowanie nowotworów głowy i szyi i nie tylko tej grupy nowotworów zawarte jest w ocenie proliferacji i regulacji cyklu komórkowego.


Piśmiennictwo

1. Crissman JD, Zarbo RJ. Squamous cell carcinoma of the upper aerodigestive tract: histologic parameters with prognostic value. In: Fee WE Jr, Goepfert H, Johns ME, Strong EW, Ward PH (red). Head and Neck Cancer. Vol. 2. Decker, Toronto 1990.

2. Jakobsson PA, Eneroth CM, Killander A, et al. Histologic classification and graiding of malignancy in carcinoma of the larynx. Acta Radiol Ther Phys Biol, 1973; 12: 1-18.

3. Ferlito A, Carbone A, DeSanto LW et al. Early cancer of the larynx: the concept as defined by clinicians, pathologist, and biologists. Ann Otol Rhinol Laryngol 1996; 105/3: 245-250.

4. Ferlito A, Friedman I. Poorly-differentiated laryngeal malignancies. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec 1990; 52: 63-64.

5. Ferlito A. Histological classification of larynx and hypopharynx cancer and their clinical implications. Pathologic aspects of 2 052 malignant neoplasms diagnosed at the O. R. L. Department of Padwa University from 1966 to 1976. Acta Otolaryngol 1976; 342, Suppl: 1-88.

6. Kleinsasser O. Tumors of the larynx and hypopharynx. Thieme, Stuttgart 1988.

7. Olofsson J. Aspects on laryngeal cancer based on whole organ sections. Auris Nasus Larynx 1985; 12, Suppl. II: 166-175.

8. American Joint Committee on Cancer: Manual for staging of cancer. 4th ed. Lippincott, Philadelphia 1992.

9. Broders AC. Carcinoma grading and practical application. Arch Pathol 1976; 2: 376-381.

10. Malaise EP, Chavaudra N, Tubiana M. The relationship between growth rate, labelling index and histological type of human solid tumours. Eur J Cancer 1973; 9: 305-312.

11. Glanz HK. Carcinoma of the larynx. Growth’ p-classification and grading of squamous cell carcinoma of the vocal cords. Adv Otorhinolaryngol 1984; 32: 1-123.

12. Welkoborsky HJ, Dienes HP, Hinni M, et al. Predicting recurrence and survival in patients with laryngeal cancer by means of DNA cytometry, tumor front grading, and proliferation markers. Ann Otol Rhinol Laryngol 1995; 104: 503-510.

13. Wright NA. Cell proliferation in health and disease. Recent Adv Histopathol 1984; 12: 17-33.

14. Edström SSF, Gustafsson B, Stenman G, Lydén E, Stein H, Westin T. Proliferative pattern of head and neck cancer. Am J Surg 1991; 162: 412-416.

15. Nasierowska-Guttmejer, Unakami M. Przydatność diagnostyczna oznaczania aktywności proliferacyjnej w nabłonku i raku płaskonabłonkowym przełyku. Nowotwory 1995; 45: 642-651.

16. Cotran SR, Kumar V, Collins V. Robbins pathologic basis of disease. Saunders, Philadelphia 1999.

17. Kawiak J, Mirecka J, Olszewska M, et al. Podstawy cytofizjologii. PWN, Warszawa 1998.

18. Barciszewski J, Łastowski K, Twardowski T. Nowe tendencje w biologii molekularnej i inżynierii genetycznej. Wydawnictwo Sorus, Poznań 1996.

19. Shiga H, Rasmussen AA, Johnston PG, et al. Prognostic value of
c-erbB2 and other markers in patients treated with chemotherapy for recurrent head and neck cancer. Head Neck 2000; 22: 599-608.

20. Khan AJ, King BL, Smith BD, et al. Characterization of the HER-2/neu oncogene by immunohistochemical and fluorescence in situ hybridization analysis in oral and oropharyngeal squamous cell carcinoma. Clin Cancer Res 2002; 8: 540-548.

21. Roychowdhury DF, Tseng A Jr, Fu KK, et al. New prognostic factors in nasopharyngeal carcinoma. Tumor angiogenesis and C-erbB2 expression. Cancer 1996; 77: 1419-1426.

22. Anderson JA, Irish JC, McLachlin CM, et al. H-ras oncogene mutation and human papillomavirus infection in oral carcinomas. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1994; 120: 755-760.

23. Hoellering J, Shuler CF. Localization of H-ras mRNA in oral squamous cell carcinomas. J Oral Pathol Med 1989; 18: 74-78.

24. Nadal A, Cardesa A. Molecular biology of laryngeal squamous cell carcinoma. Virchows Arch 2003; 442: 1-7.

25. Takes RP, Baatenburg de Jong RJ, Schuuring E, et al. Differences in expression of oncogenes and tumor suppressor genes in different sites of head and neck squamous cell. Anticancer Res 1998; 18, 6B: 4793-4800.

26. Xie X, Clausen OP, Boysen M. Prognostic significance of p21WAF1/CIP1 expression in tongue squamous cell carcinomas. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 2002; 128: 897-902.

27. Almadori G, Galli J, Cadoni G, et al. Human papillomavirus infection and cyclin D1 gene amplification in laryngeal squamous cell carcinoma: biologic function and clinical significance. Head Neck 2002; 24: 597-604.

28. Quon H, Liu FF, Cummings BJ. Potential molecular prognostic markers in head and neck squamous cell carcinomas. Head Neck 2001; 23: 147-159.

29. Capaccio P, Pruneri G, Carboni N, et al. Cyclin D1 expression is predictive of occult metastases in head and neck cancer patients with clinically negative cervical lymph nodes. Head Neck 2000; 22: 234-240.

30. El-Naggar AK, Lai S, Clayman GL, et al. Expression of p16, Rb, and cyclin D1 gene products in oral and laryngeal squamous carcinoma: biological and clinical implications. Hum Pathol 1999; 30: 1013-1018.

31. Bova RJ, Quinn DI, Nankervis JS, et al. Cyclin D1 and p16INK4A expression predict reduced survival in carcinoma of the anterior tongue. Clin Cancer Res 1999; 5, 10: 2810-2819.

32. Regezi JA, Jordan RC. Oral cancer in the molecular age. J Calif Dent Assoc 2001; 29, 8: 578-584.

33. Nakahara Y, Shintani S, Mihara M, et al. Alterations of Rb, p16 (INK4A) and cyclin D1 in the tumorigenesis of oral squamous cell carcinomas. Cancer Lett 2000; 10, 160: 3-8.

34. Koontongkaew S, Chareonkitkajorn L, Chanvitan A, et al. Alterations of p53, pRb, cyclin D (1) and cdk4 in human oral and pharyngeal
squamous cell carcinomas. Oral Oncol 2000; 36: 334-339.

35. Chen Q, Luo G, Li B, et al. Expression of p16 and CDK4 in oral premalignant lesions and oral squamous cell carcinomas: a semi-quantitative immunohistochemical study. J Oral Pathol Med 1999; 28: 158-164.

36. Takes RP, Baatenburg De Jong RJ, Alles MJ, et al. Markers for nodal metastasis in head and neck squamous cell cancer. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 2002; 128: 512-518.

37. Takes RP, Baatenburg de Jong RJ, Schuuring E. Markers for assessment of nodal metastasis in laryngeal carcinoma. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1997; 123: 412-419.

38. Michalides RJ, van de Brekel M, Balm F. Defects in G1-S cell cycle control in head and neck cancer: a review. Head Neck 2002; 24: 694-704.

39. Sakata K. Alterations of tumor suppressor genes and the H-ras oncogene in oral squamous cell carcinoma. J Oral Pathol Med 1996; 25: 302-307.

40. Ioachim E, Assimakopoulos D, Agnantis NJ. Altered patterns of retinoblastoma gene product expression in benign, premalignant and malignant epithelium of the larynx: an immunohistochemical study including correlation with p53, bcl-2 and proliferating indices. Anticancer Res 1999; 19: 541-545.

41. Dokiya F, Ueno K, Ma S, et al. Retinoblastoma protein expression and prognosis in laryngeal cancer. Acta Otolaryngol 1998; 118: 759-762.

42. Yokoyama J, Shiga K, Sasano H, et al. Abnormalities and the implication of retinoblastoma locus and its protein product in head and neck cancers. Anticancer Res 1996; 16: 641-644.

43. Scholnick SB, Sun PC, Shaw ME, et al. Frequent loss of heterozygosity for Rb, TP53, and chromosome arm 3p, but not NME1 in squamous cell carcinomas of the supraglottic larynx. Cancer 1994; 15, 73, 10: 2472-2480.

44. Bazan V, Zanna I, Migliavacca, M et al. Prognostic significance of p16INK4a alterations and 9p21 loss of heterozygosity in locally advanced laryngeal squamous cell carcinoma. J Cell Physiol 2002; 192: 286-293.

45. Gruttgen A, Reichenzeller M, Junger M, et al. Detailed gene expression analysis but not microsatellite marker analysis of 9p21 reveals differential defects in the INK4a gene locus in the majority of head and neck cancers. J Pathol 2001; 194: 311-317.


46. Jares P, Nadal A, Fernandez PL, Pinyol M, et al. Disregulation of p16MTS1/CDK4I protein and mRNA expression is associated with gene alterations in squamous-cell carcinoma of the larynx. Int J Cancer 1999; 31, 81, 5: 705-711.

47. Jares P, Fernandez PL, Nadal A, et al. p16MTS1/CDK4I mutations and concomitant loss of heterozygosity at 9p21-23 are frequent events in squamous cell carcinoma of the larynx. Oncogene 1997; 15: 1445-1453.

48. Gonzales-Moles MA, Rodriguez-Archilla A, Ruiz-Avila I, et al. p16 Expression in squamous carcinomas of the tongue. Onkologie 2002; 25: 433-436.

49. Kresty LA, Mallery SR, Knobloch TJ, et al. Alterations of p16 (INK4a) and p14 (ARF) in patients with severe oral epithelial dysplasia. Cancer Res 2002; 62: 5295-5300.

50. Shintani S, Nakahara Y, Mihara M, et al. Inactivation of the p14 (ARF), p15 (INK4B) and p16 (INK4A) genes is a frequent event in human oral squamous cell carcinomas. Oral Oncol 2001; 37: 498-504.

51. Tsai CH, Yang CC, Chou LS, et al. The correlation between alteration of p16 gene and clinical status in oral squamous cell carcinoma. J Oral Pathol Med 2001; 30: 527-531.

52. Pande P, Mathur M, Shukla NK, et al. pRb and p16 protein alterations in human oral tumorigenesis. Oral Oncol 1998; 34: 396-403.

53. Warnakulasuriya KA, Tavassoli M, Johnson NW. Relationship of p53 overexpression to other cell cycle regulatory proteins in oral squamous cell carcinoma. J Oral Pathol Med 1998; 27: 376-381.

54. Papadimitrakopoulou V, Izzo J, Lippman SM, et al. Frequent inactivation of p16INK4a in oral premalignant lesions. Oncogene 1997; 14: 1799-1803.

55. Kapranos N, Stathopoulos GP, Manolopoulos L, et al. p53, p21 and p27 protein expression in head and neck cancer and their prognostic value. Anticancer Res 2001; 21: 521-528.

56. Scambia G, Catozzi L, Benedetti Panici P, et al. Expression of ras oncogene p21 protein in normal and neoplastic laryngeal tissues: correlation with histopathological features and epidermal growth factor receptors. Br J Cancer 1994; 69: 995-999.

57. Vora HH, Shah NG, Patel DD, et al. Prognostic significance of biomarkers in squamous cell carcinoma of the tongue: multivariate analysis. J Surg Oncol 2003; 82: 34-50.

58. Thurnher D, Knerer B, Formanek M, et al. Non-radioactive semiquantitative testing for the expression levels of telomerase activity in head and neck squamous cell carcinomas may be indicative for biological tumour behaviour. Acta Otolaryngol 1998; 118: 423-427.

59. Friedlander PL. Genomic instability in head and neck cancer patients. Head Neck 2001; 23: 683-691.

60. Masuda M, Shinokuma A, Hirakawa N, et al. Expression of bcl-2-, p53, and Ki-67 and outcome of patients with primary nasopharyngeal carcinomas following DNA-damaging treatment. Head Neck 1998; 20: 640-644.

61. Pukkila MJ, Kumpulainen EJ, Virtaniemi JA, et al. Nuclear and cytoplasmic p53 expression in pharyngeal squamous cell carcinoma: prognostic implications. Head Neck 2002; 24: 784-791.

62. Chow V, Yuen AP, Lam KY, et al. Prognostic significance of serum p53 protein and p53 antibody in patients with surgical treatment for head and neck squamous cell carcinoma. Head Neck 2001; 23: 286-291.

63. Friedman M, Lim JW, Manders E, et al. Prognostic significance of
Bcl-2 and p53 expression in advanced laryngeal squamous cell
carcinoma. Head Neck 2001; 23: 280-285.

64. Piffko J, Bankfalvi A, Tory K, et al. Molecular assessment of p53 abnormalities at the invasive front of oral squamous cell carcinomas. Head Neck 1998; 20: 8-15.

65. Ng IO, Lam KY, Ng M, et al. Expression of p21/waf1 in oral squamous cell carcinomas–correlation with p53 and mdm2 and cellular proliferation index. Oral Oncol 1999; 35: 63-69.

66. Nylander K, Dabelsteen E, Hall PA. The p53 molecule and its prognostic role in squamous cell carcinomas of the head and neck. J Oral Pathol Med 2000; 29: 413-425.

67. Yanamoto S, Kawasaki G, Yoshitomi I, et al. p53, mdm2, and p21 expression in oral squamous cell carcinomas: relationship with clinicopathologic factors. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2002; 94: 593-600.

68. Graeber TG, Osmanian C, Jacks T, et al. Hypoxia-mediated selection of cells with diminished apoptotic potential in solid tumours. Nature 1996; 379: 88-91.

69. Dickman S. First p53 relative may be a new tumor suppressor. Science 1997; 277: 1605-1606.

70. Jost CA, Marin MC, Kaelin WG Jr. p73 is a simian [correction of human] p53-related protein that can induce apoptosis. Nature 1997; 389: 191-194.

71. El-Naggar AK, Lai S, Clayman GL, et al. p73 gene alterations and expression in primary oral and laryngeal squamous carcinomas. Carcinogenesis 2001; 22: 729-735.

72. Mao L, Fan YH, Lotan R, et al. Frequent abnormalities of FHIT, a candidate tumor suppressor gene, in head and neck cancer cell lines. Cancer Res 1996; 56: 5128-5131.

73. Virgilio L, Shuster M, Gollin SM, et al. FHIT gene alterations in head and neck squamous cell carcinomas. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 9770-9775.

74. Lee JI, Soria JC, Hassan K. Loss of Fhit expression is a predictor of
poor outcome in tongue cancer. Cancer Res 2001; 61: 837-841.

75. Condon LT, Ashman JN, Ell SR, et al. Overexpression of Bcl-2 in
squamous cell carcinoma of the larynx: a marker of radioresistance. Int J Cancer 2002; 100: 472-475.

76. Casado S, Forteza J, Dominguez S, et al. Predictive value of P53,
BCL-2, and BAX in advanced head and neck carcinoma. Am J Clin Oncol 2002; 25: 588-590.

77. Hayflick L, Moorhead PS. The serial cultivation of of human diploid cell strains. Exp Cell Res 1961; 25: 585.

78. Lee BK, Diebel E, Neukam FW, et al. Diagnostic and prognostic
relevance of expression of human telomerase subunits in oral cancer. Int J Oncol 2001; 19: 1063-1068.

79. Liao J, Mitsuyasu T, Yamane K, et al. Telomerase activity in oral and maxillofacial tumors. Oral Oncol 2000; 36: 347-352.

80. Miyoshi Y, Tsukinoki K, Imaizumi T, et al. Telomerase activity in oral cancer. Oral Oncol 1999; 35: 283-289.

81. Hohaus S, Cavallo S, Bellacosa A, et al. Telomerase activity in human laryngeal squamous cell carcinomas. Clin Cancer Res 1996; 2: 1895-1900.

82. Curran AJ, Gullane PJ, Irish J, et al. Telomerase activity is upregulated in laryngeal squamous cell carcinoma. Laryngoscope 2000; 110: 391-396.

83. Lazaris ACh, Rigopoulou A, Tseleni-Balafouta S, et al. Immunodetection and clinico-pathological correlates of two tumour growth regulators in laryngeal carcinoma. Histol Histopathol 2002; 17: 131-138.

84. Cheng RY, Yuen PW, Nicholls JM et al. Telomerase activation in nasopharyngeal carcinomas. Br J Cancer 1998; 77: 456-460.

85. Klein G, Steiner M, Wiener F, et al. Human leukemia associated anti-nuclear reactivity. Proc Natl Acad Sci USA 1974; 71: 685.

86. Gerdes J, Lemke H, Baisch H, et al. Cell cycle analysis of a cell proliferation-associated human nuclear antigen defined by the monoclonal antibody Ki-67. J Immunol 1984; 133: 1710-1715.

87. Gerdes J, Schwab U, Lemke H, et al. Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation. Int J Cancer 1983; 31: 13-20.

88. Brown DC, Gatter KC. Monoclonal antibody Ki-67: its use in histopathology. Histopathology 1990; 17: 489-503.

89. Burger PC, Shibata T, Kleihues P. The use of the monoclonal antibody
Ki-67 in the identification of proliferating cells: application to surgical neuropathology. Am J Surg Pathol 1986; 10: 611-617.

90. Sasaki K, Murakami T, Kawasaki M, et al. The cell cycle associated change of the Ki67 reactive nuclear antigen expression. J Cell Physiol 1987; 133: 579-584.

91. Braun N, Papaulopoulos T, Muller-Hermelink HK. Cell cycle dependent distribution of the proliferation-associated Ki67 antigen in human embryonic lung cells. Virchows Archiv B Cell Pathol Incl Mol Pathol 1988; 56: 25-33.

92. Baisch H, Gerdes J. Simultaneous staining of exponentially growing versus plateau phase cells with the proliferation – associated antibody Ki67 and propidium iodide: analysis by flow cytometry. Cell Tissue Kinet 1987; 20: 387-391.

93. Verheijen R, Kujpers HSH, van Driel. Ki67 defects a nuclear matrix-associated proliferation – related antigen. II Localization in mitotic cells and association with chromosomes. J Cell Sci 1989; 92: 531-540.

94. Walker RA, Camplejohn RS. Comparison of monoclonal antibody Ki67 reactivity with grave and DNA flow cytometry of breast carcinomas. Br J Cancer 1988; 57: 281-283.

95. Scott CS, Ramsden W, Limbert MJ et al. Membrane transferrin receptor (TfR) and nuclear proliferation associated Ki67 expression in hemopoetic malignancies. Leukemia 1988; 2: 438-442.

96. Schonk DM, Kujpers HSH, van Drunen F. Assignment of the gene (s) involved in the expression of the proliferation related Ki67 antigen to human chromosome 10. Hum Genet 1989; 83: 297-299.

97. Lorz M, Meyer-Breiting E. Evaluation of proliferative activity in human head and neck tumors using the monoclonal antibody Ki-67. ORL J Otohinolaryngol Relat Spec 1988; 50: 183-187.

98. Bravo R, Celis JE. A search for differential polypeptide synthesis
throughout the cell cycle of HeLa cells. J Cell Biol 1980; 84: 795-802.

99. Bravo R, Frank R, Blundell PA et al. Cyclin/PCNA in the auxiliary protein of DNA polymerase-delta. Nature 1987; 326: 515-517.

100. Bravo R, Macdonald-Bravo H. Changes in the nuclear distribution of cyclin (PCNA) but not its synthesis depend on DNA replication. EMBO J 1985; 4: 655-661.

101. Bravo R, Macdonald-Bravo H. Existence of two populations of cyclin/proliferating cell nuclear antigen during the cell cycle: association with DNA replication sites. J Cell Biol 1987; 105: 1549-1554.

102. Suzuka I, Daidoji H, Matsuoka M. Gene for proliferating-cell nuclear antigen (DNA polymerase delta auxiliary protein) is present in both mammalian and higher plant genomes. Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86: 3189-3193.

103. Takasaki Y, Fishwild D, Tan EM. Characterization