Proteomika proteaz na przykładzie możliwej roli MMP-9 w plastyczności synaptycznej

W coraz większym stopniu proteazy są postrzegane jako precyzyjne mechanizmy komórkowe mogące regulować procesy biologiczne u wszystkich organizmów, a nie tylko jako niespecyficzne enzymy towarzyszące katabolizmowi białek. Z tego powodu niezwykle ważne są nowe podejścia eksperymentalne, które mogą wyjaśniać rolę proteaz oraz regulację ich aktywności na wszystkich etapach ekspresji białka, począwszy od transkrypcji genu, na hamowaniu aktywności poprzez endogenne inhibitory skończywszy. W swoich badaniach autorzy niniejszej pracy skupili się na poszukiwaniu nowych elementów regulujących transkrypcję genu mmp-9 (ang. matrix metalloproteinase 9 – metaloproteinaza macierzy zewnątrzkomórkowej 9), jak również na znalezieniu substratów dla tego enzymu w mózgu. Dzięki metodzie footprinting autorzy zidentyfikowali czynnik YY1, który okazał się represorem genu mmp-9 w neuronach niepobudzonych, a także aktywatorem w neuronach stymulowanych. Przy użyciu immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) i immunoprecypitacji (IP), a następnie dzięki analizie uzyskanych próbek białek za pomocą spektrometrii mas, zidentyfikowano wiele potencjalnych partnerów wiążących się z YY1 in vivo zarówno w neuronach niepobudzonych, jak i pobudzonych. Z kolei badając aktywność białka MMP-9, autorzy wykazali cięcie b-dystroglikanu (białka błonowego występującego na synapsach neuronów) przez MMP-9 wydzielone w wyniku pobudzenia neuronalnego, co ma potencjalne znaczenie w plastyczności synaptycznej, procesach leżących prawdopodobnie u podstaw uczenia się i pamięci. W dalszej części pracy przedstawiono zrodzoną niedawno koncepcję „proteodegradomiki” oraz zestawiono metody mogące służyć do znajdywania potencjalnych substratów proteaz, jak również do analizowania poziomu proteolizy w różnych stanach komórki.

More and more proteases are viewed as precise cellular mechanisms, which may regulate biological processes in all organisms, and not only as unspecific enzymes involved in catalysis of proteins. For this reason new experimental approaches are needed, which may explain the role of proteases and regulation of their activity on all levels of protein expression, starting from gene transcription, ending with inhibition of activity by endogenous inhibitors. In our research, we focused on finding new elements regulating transcription of the mmp-9 (matrix metalloproteinase-9) gene and on finding new substrates for this enzyme in the brain. Thanks to the footprinting method we identified YY1 factor, which turned out to be an mmp-9 gene repressor in non-stimulated and activator in stimulated neurons. Using chromatin immunoprecipitation (ChIP) and immunoprecipitation (IP) and analyzing resulting samples by mass spectrometry, we identified many potential partners binding to YY1 in vivo in non-stimulated and stimulated neurons. Studying the activity of MMP-9 protein, we have shown that cleavage of b-dystroglycan (transmembrane protein occurring on neuronal synapses) by MMP-9, released as a result of neuronal excitation, is potentially important in synaptic plasticity, a process which is probably a base of learning and memory. In a later part of this paper, we explain the new concept of “proteodegradomics” and we set together methods which are useful in finding new substrates for proteases and analysing the level of proteolysis in various states of the cell.