Przeciwciała przeciw cytoplazmie granulocytów obojętnochłonnych w płynie stawowym chorych na reumatoidalne zapalenie stawów

Wstęp


Reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) należy do grupy układowych chorób tkanki łącznej, która charakteryzuje się przewlekłym procesem zapalnym o podłożu autoimmunologicznym. Zapalenie zostaje zapoczątkowane przez nieznany czynnik lub czynniki i ma charakter przewlekle postępujący. W jego trakcie dochodzi do zajęcia wielu narządów i układów. Proces zapalny w przebiegu RZS obejmuje głównie błonę maziową stawów, tkanki okołostawowe oraz narządy miąższowe, prowadząc do ich uszkodzenia. W przebiegu układowych chorób tkanki łącznej stwierdza się różnego rodzaju zaburzenia odpowiedzi immunologicznej zarówno typu komórkowego, jak i humoralnego. Ich przejawem jest m.in. obecność w surowicy krwi i płynach ustrojowych autoprzeciwciał reagujących z różnymi antygenami. Autoantygenami mogą być składowe komórki znajdujące się na błonie komórkowej, w cytoplazmie, czy choćby antygeny jądra komórkowego. Mogą nimi być także cząsteczki białka – fragment Fc immunoglobulin. Przeciwciała te, poza rolą, którą odgrywają w patogenezie niektórych jednostek chorobowych, mogą mieć znaczenie diagnostyczne. Czynnik reumatoidalny i przeciwciała przeciwjądrowe to najczęściej wykrywane autoprzeciwciała u chorych na reumatoidalne zapalenie stawów. W jego przebiegu wykazano także m.in. przeciwciała przeciw cyklicznie cytrulinowanemu peptydowi (aCCP), przeciw keratynie i przeciw cytoplazmie granulocytów obojętnochłonnych (ANCA). A-CCP swoiście reagują z determinantami antygenowymi zawierającymi cytrulinę i pełnią rolę markera wczesnego okresu reumatoidalnego zapalenia stawów, natomiast ANCA są skierowane przeciw składowym cytoplazmy granulocytów obojętnochłonnych. Przy użyciu metody immunofluorescencji pośredniej wyróżnia się 3 typy ANCA: C-ANCA (cytoplasmic – typ cytoplazmatyczny), P-ANCA (perinuclear – typ okołojądrowy) oraz A-ANCA (atypical – atypowe). C-ANCA reagują głównie z proteinazą 3 znajdującą się w ziarnistościach azurofilnych granulocytów obojętnochłonnych. P-ANCA są skierowane głównie przeciw mieloperoksydazie, ale mogą reagować także z lizozymem, katepsyną G i innymi enzymami granulocytów. ANCA są uważane za szczególnie istotny wykładnik serologiczny zapaleń naczyń, głównie ziarniniaka Wegenera, microscopic poliangiitis i gwałtownie postępującego, idiopatycznego kłębuszkowego zapalenia nerek [1]. Do chwili obecnej nie określono ostatecznie częstości występowania ANCA w płynie stawowym w przebiegu RZS.

Celem pracy była ocena częstości występowania i charakterystyka przeciwciał przeciw cytoplazmie granulocytów obojętnochłonnych w płynie stawowym chorych na reumatoidalne zapalenie stawów.


Materiał

Materiał do badań stanowiły płyny stawowe uzyskiwane od 377 chorych na reumatoidalne zapalenie stawów – w tym 81 mężczyzn i 296 kobiet, w wieku 26–67 lat (średnia wieku 47,6±3,0 lata). Rozpoznanie choroby ustalono na podstawie kryteriów Amerykańskiego Towarzystwa Reumatologicznego z 1987 r. [2]. Czas trwania choroby wynosił od 9 mies. do 10 lat. U żadnej z badanych osób nie stwierdzono cech zapalenia naczyń w postaci owrzodzeń skóry, wybroczyn, zawałów okołopaznokciowych, martwicy w obrębie paliczków, neuropatii, czy cech zapalenia naczyń w obrębie narządów wewnętrznych. Wszyscy chorzy otrzymywali niesteroidowe leki przeciwzapalne oraz leki modyfikujące przebieg reumatoidalnego zapalenia stawów (metotreksat, sulfasalazynę, sole złota lub chlorochinę). Kliniczną charakterystykę chorych przedstawiono w tab. I. Grupę kontrolną stanowiło 183 chorych ze zmianami zwyrodnieniowymi. Do grupy tej należało 65 mężczyzn i 118 kobiet w wieku 47–65 lat, średnia wieku 56,7±3,1 roku. Rozpoznanie choroby ustalono na podstawie kryteriów Amerykańskiego Towarzystwa Reumatologicznego [3]. Czas trwania choroby wynosił 5–20 lat. Osoby należące do grupy kontrolnej zostały poddane badaniu podmiotowemu i przedmiotowemu, nie stwierdzono u nich cech zapalenia naczyń ani chorób układowych. Żaden z chorych nie otrzymywał glikokortykosteroidów dostawowo przez 3 mies. przed pobraniem płynu stawowego.

Metody

Uzyskane do badań płyny stawowe poddano ocenie typu i miana ANCA metodą immunofluorescencji pośredniej, natomiast swoistość ANCA oceniano metodą ELISA. Badane płyny stawowe poddano także ocenie obecności i miana przeciwciał przeciwjądrowych, granulocytospecyficznych ANA oraz czynnika reumatoidalnego

. Ocena ANCA przy użyciu metody immunofluorescencji pośredniej [4]


Na preparaty granulocytów obojętnochłonnych, utrwalonych alkoholem etylowym i aldehydem mrówkowym, oraz komórki linii HEp-2 nakładano badane płyny stawowe rozcieńczone w stosunku geometrycznym w PBS. Całość inkubowano w komorze wilgotnej w temperaturze pokojowej przez 30 min. Następnie preparaty przepłukiwano i nakładano króliczą immunoglobulinę znakowaną izotiocyjanianem fluoresceiny skierowaną przeciw ludzkiej IgG, przeciw IgM oraz przeciw IgA. Całość inkubowano przez 30 min, po czym przepłukiwano i zamykano szkiełkiem nakrywkowym. Tak przygotowane preparaty oceniano w mikroskopie fluorescencyjnym (Axioscop-2, Zeiss, Niemcy) w obiektywie immersyjnym x100. Za wynik dodatni przyjmowano obecność ANCA w mianie powyżej 1/80.


Ocena swoistości antygenowej przy użyciu metody immunoenzymatycznej ELISA [5]

Do oceny swoistości antygenowej ANCA użyto antygenów komercyjnych, dostarczonych w odpowiednich stężeniach. Wykorzystano proteinazę 3–0,7 µg/ml, mieloperoksydazę 0,5 µg/ml, elastazę 10 ng/ml, laktoferrynę 10 µg/ml, lizozym 1 µg/ml i katepsynę G 2 µg/ml. Mikropłytki (Maxisorp immuno plates, Nunc) opłaszczano 100 µl antygenu na studzienkę, rozpuszczonego w buforze opłaszczającym i inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie trzykrotnie przepłukiwano buforem płuczącym i pozostawiano do wyschnięcia, po czym szczelnie zamykano i przechowywano w temperaturze 4°C do czasu badania. Badane płyny stawowe rozcieńczano w buforze do inkubacji i nakładano po 100 µl na studzienkę. Œlepą próbę stanowił bufor do inkubacji. Całość pozostawiano na 60 min w temperaturze pokojowej, ponownie przepłukiwano i nakładano po 100 µl króliczej immunoglobuliny, znakowanej fosfatazą zasadową skierowaną przeciw ludzkiej IgG, przeciw IgM i przeciw Iga, lub mysiej immunoglobuliny, znakowanej fosfatazą zasadową skierowaną przeciw podklasom IgG1-IgG4. Po 60 min inkubacji w temperaturze pokojowej preparat trzykrotnie przepłukiwano i nakładano 100 µl PNP (fosforan przeciwnitrofenolowy). Ponownie inkubowano przez 60 min i odczytywano absorbancję przy długości fali 405 nm przy użyciu czytnika ELISA (Microplate Reader, ELX-800, USA). Ocena swoistości ANCA była potwierdzona przy użyciu komercyjnego zestawu ANCA profile (Euroimmun, Niemcy).

Obecność i miano innych autoprzeciwciał

Oceny obecności i miana czynnika reumatoidalnego dokonywano przy użyciu odczynu wiązania lateksu oraz odczynu Waalera-Rose [6], natomiast ocenę obecności i miana przeciwciał przeciwjądrowych (ANA) oraz przeciwciał przeciwjądrowych swoiście reagujących z jądrem granulocytów obojętnochłonnych (GS-ANA) dokonywano z wykorzystaniem metody immunofluorescencji pośredniej.

Obliczenia statystyczne


Analiza statystyczna uzyskanych wyników obejmowała obliczenia średniej arytmetycznej, odchylenia standardowego, błędu standardowego średniej arytmetycznej. Różnice między rozkładem dwóch grup oceniano testem Manna-Whitneya. Współczynnik korelacji wyznaczono testem rank Spearmana. Za poziom ufności przyjęto p<0,05. Przy analizie statystycznej korzystano z programu Statistica 5.1.

Wyniki

Przeciwciała przeciw cytoplazmie granulocytów obojętnochłonnych w płynie stawowym

Posługując się metodą immunofluorescencji pośredniej, obecność ANCA w płynie stawowym wykazano u 108/377 chorych na reumatoidalne zapalenie stawów, co stanowiło 28,6% badanych. U osób we wczesnym okresie choroby (RZS <24) ANCA były obecne w 26/114 (22,8%) przypadków, natomiast w grupie chorych z dłuższym czasem trwania choroby (RZS >24) przeciwciała te wykryto u 82/263 badanych, co stanowiło 31,2%. Uzyskane wyniki nie wykazywały statystycznie znamiennej różnicy (p>0,05). W grupie kontrolnej ANCA wykryto u 2/183 badanych (1,09%). W badanych płynach stawowych stwierdzano okołojądrowe (P-ANCA) (ryc. 1.) i atypowe (A-ANCA) świecenie przeciwciał (ryc. 2.). P-ANCA wykazano u 87/108 (80,5%) badanych, A-ANCA w 21/108 (19,4%) przypadków. Uzyskane wyniki wykazywały statystycznie znamienną różnicę (p<0,001). U chorych z wczesnym okresem reumatoidalnego zapalenia stawów P-ANCA stwierdzono u 22/26 (84,6%), a A-ANCA u 4/26 (15,3%) badanych. U chorych z dłuższym czasem trwania choroby P-ANCA wykazano u 65/82 (79,3%), A-ANCA zaś u 17/82 badanych, co stanowiło 20,7% przypadków. Nie było statystycznej istotnej różnicy pomiędzy częstością występowania poszczególnych typów ANCA a czasem trwania choroby. ANCA, których obecność obserwowano u 2 chorych z grupy kontrolnej, wykazywały okołojądrowy typ świecenia (P-ANCA).W żadnym z badanych płynów stawowych nie stwierdzono cytoplazmatycznego typu świecenia (C-ANCA). Jednocześnie z określeniem typu ANCA oceniano ich miano. Za dodatni wynik ANCA przyjmowano miano powyżej >1/20. Miano ANCA 1/40 wykazano w 19/108 (17,6 %) przypadków, miano 1/80 w 46/108 (42,6%), a 1/160 w 27/108 (25%), natomiast miano 1/320 w 16/108, co stanowiło 14,8% badanych płynów. ANCA w mianie 1/80 stwierdzono u 20/26 (76,9%) badanych u chorych we wczesnym okresie RZS (tab. II). U 2 chorych z grupy kontrolnej miano ANCA wynosiło 1/40.

Swoistość antygenowa, klasy i podklasy immunoglobulin

Posługując się metodą ELISA, oceniono swoistość antygenową ANCA. W 6 przypadkach ANCA stwierdzanych w metodzie immunofluorescencji pośredniej nie wykazano żadnej swoistości antygenowej. Były to przeciwciała o okołojądrowym typie świecenia (P-ANCA). W 2 przypadkach wykryto je w płynach chorych z wczesnym RZS, w 4 zaś z długotrwałym procesem choroby. W płynach tych jednocześnie z ANCA wykazano obecność przeciwciał przeciwjądrowych. Metoda ELISA pomogła więc zweryfikować rzeczywistą liczbę ANCA+ płynów stawowych, uznano bowiem, że wynik badania immunofluorescencyjnego w tych 6 płynach był fałszywie dodatni. Przyjęto zatem, że ANCA były obecne w 102/377 płynach stawowych, co stanowiło 27% badanych. W 20/102 (19,6 %) przypadków ANCA reagowały z mieloperoksydazą. W 45/102, co stanowiło 44,1% ANCA+ płynów, reagowały one swoiście z laktoferryną, natomiast w 10/102 przypadkach ANCA wykazywały swoistość w stosunku do lizozymu, co stanowiło 9,8% ANCA+ płynów stawowych. W 19/102 (18,6%) badanych płynach przeciwciała te reagowały swoiście z katepsyną G, dotyczyło to głównie płynów pochodzących od chorych z długotrwałym procesem zapalnym. W 8/102 (7,8 %) przypadki ANCA wykazywały swoistość w stosunku do elastazy. Wykazano także statystycznie znamiennie częstsze występowanie ANCA reagujących swoiście z laktoferryną w porównaniu z innymi antygenami (p<0,05). W żadnym przypadku ANCA nie wykazywały swoistości dla proteinazy 3, natomiast w płynach stawowych pochodzących od chorych we wczesnym okresie choroby nie stwierdzono obecności ANCA reagujących swoiście z elastazą (tab. III). W 2 badanych płynach stawowych z grupy kontrolnej nie wykazano żadnej swoistości antygenowej ANCA. Jednocześnie z oceną swoistości określano klasę i podklasę immunoglobulin, do których należały przeciwciała przeciw cytoplazmie granulocytów obojętnochłonnych. ANCA w klasie IgM obserwowano u 25/102 badanych, co stanowiło 24,5% przypadków. W 75% ANCA występowały w klasie IgG. Obserwowano je w podklasie IgG1 u 29/77 badanych, co stanowiło 37,6%, i podklasie IgG3 u 27/77 badanych, co stanowiło 35,1% (tab. IV). Przeciwciała przeciw cytoplazmie granulocytów obojętnochłonnych reagujące swoiście z mieloperoksydazą występowały w klasie IgG. W 9/20 przypadków (45%) ANCA stwierdzono podklasę IgG1, a w 7/20 (35%) IgG3. W żadnym przypadku nie obserwowano ANCA w klasie IgM reagujących swoiście z mieloperoksydazą. Obecność ANCA reagujących swoiście z laktoferryną w klasie IgM stwierdzono w 10/45 (22,2%) płynów, a w klasie IgG w 36/45 (80%). W 17/36 przypadków (47,2%) wykryto je w podklasie IgG3, a w 10/36 (27,8%) w podklasie IgG1. ANCA skierowane przeciwko lizozymowi obserwowano w klasie IgM w 4/10 (40%) płynów, a w IgG 6/10 (60%). Występowały one w podklasie IgG1 w 4/6, co stanowiło 66,7% ANCA IgG. Przeciwciała reagujące z katepsyną G obserwowano w klasie IgM w 8/19 (42,1%), a w klasie IgG w 11/19 (57,9%) przypadków. Należały one głównie do podklasy IgG1 w 5/11 (45,5%) płynów. ANCA w klasie IgM skierowane przeciwko elastazie wykryto w 3/8 (37,5%) płynów, pozostałe zaś w klasie IgG w 5/8, co stanowiło 62,5% (tab. V). Wykazano statystycznie znamiennie częstsze (p<0,05) występowanie ANCA w klasie IgG, głównie w podklasie IgG1i IgG3, w porównaniu z klasą IgM.

Obecność innych autoprzeciwciał

Czynnik reumatoidalny w klasie IgM (IgM RF) stwierdzono w 300/377 (79,6%) badanych płynów. Był on obecny w 37/114 (32,4%) płynów pochodzących od chorych z wczesnym RZS i 263/263 (100%) płynów pochodzących od chorych z dłuższym czasem trwania choroby. RF stwierdzono w 100/102 (98%) płynów stawowych, w których wykazano obecność ANCA. Okołojądrowy typ świecenia (P-ANCA) obserwowano u 83/100, co stanowiło (83%) płynów z obecnym czynnikiem reumatoidalnym, A-ANCA zaś wykazano w 17/100 (17%) płynów RF+. Pochodziły one głównie od chorych z długotrwałym przebiegiem RZS. RF nie wykazano w żadnym z płynów stawowych, w których wykryto A-ANCA, pochodzących od chorych we wczesnym okresie choroby. Wartości te były statystycznie znamienne (p<0,05). U żadnego chorego z grupy kontrolnej nie wykazano obecności czynnika reumatoidalnego w płynie stawowym. Określano również miano czynnika reumatoidalnego. Za wynik dodatni w odczynie wiązania lateksu uważano miano powyżej 1/40. Najczęściej obserwowano miano 1/80, które wykazano u 40/102 (39,2%) badanych. W tab. V zamieszczono wartości miana dla poszczególnych grup w zależności od czasu trwania choroby i typu ANCA. Przeciwciała przeciwjądrowe wykryto w 24/377 (6,4%) płynów stawowych chorych na RZS. Obserwowano je w 8/114 (7%) płynów pobranych od chorych z wczesnym okresem choroby i w 16/263 (6,1%) z długotrwałym przebiegiem RZS. Wykazywały one plamisty typ świecenia (ryc. 3). Jednoczesne występowanie ANCA i ANA stwierdzono w 2/26 (7,69%) badanych płynach stawowych pochodzących od osób z wczesnym okresem choroby. Ich miano w obu przypadkach wynosiło 1/40, natomiast w płynach, w których wykazano obecność ANCA, pochodzących od osób z długotrwałym przebiegiem choroby, ANA były obecne w 5/82 (6,1%) przypadkach, a ich miano kształtowało się w zakresie od 1/80 do 1/320. Nie wykazano istotnej statystycznie korelacji między mianem i typem ANCA a mianem ANA (p>0,05). U żadnego chorego z grupy kontrolnej nie wykazano obecności ANA w płynie stawowym. U nikogo także, zarówno z grupy badanej, jak i kontrolnej, nie stwierdzono w płynie stawowym obecności przeciwciał przeciwko jądrom granulocytów obojętnochłonnych (GS-ANA).

Dyskusja

Obecność ANCA w surowicy chorych na reumatoidalne zapalenie stawów oceniało wielu badaczy [7-10], natomiast ich obecność w płynie stawowym była przedmiotem badań nielicznych autorów [11, 12]. W niniejszej pracy wykazano, że ANCA są obecne w 27% badanych płynów stawowych. Obserwowano je w 22,8% płynów uzyskanych od chorych z wczesnym okresem RZS i w 31,2% od osób z wieloletnim czasem trwania choroby. Tę wyższą, choć nieznamienną statystycznie, częstość występowania ANCA w płynie stawowym chorych o długim przebiegu RZS można tłumaczyć stałą stymulacją antygenami pochodzącymi z granulocytów, które w przeważającej liczbie występują w płynie stawowym o charakterze zapalnym. Mulder i wsp. [12] wykazali obecność ANCA w płynach stawowych 6 chorych. Wyższa częstość ANCA w płynach stawowych, wykazana przez tych autorów, mogła wynikać z małej grupy badanej (6 chorych). Analiza 377 płynów przeprowadzona w niniejszej pracy pozwoliła na dokonanie szczegółowej charakterystyki wykrytych w nich ANCA. Najczęściej stwierdzany, bo w 80,5% badanych płynów, był okołojądrowy typ świecenia ANCA. A-ANCA były obecne stosunkowo rzadko, bo w 19,5% badanych płynów. Częstość występowania poszczególnych typów ANCA w płynie stawowym i surowicy krwi jest podobna [10]. Można więc przyjąć, że dominującym typem ANCA u chorych na RZS jest świecenie okołojądrowe. Niemniej jednak atypowe ANCA, obserwowane także w przebiegu tej choroby, mogą być dowodem na stymulację przez różne, a nie przez jeden określony antygen komórek syntetyzujących ANCA. Œrednia wartość miana ANCA w płynie stawowym wynosiła 1/80 i była podobna do wartości uzyskanych w surowicy krwi [10]. Miano to wykazywano szczególnie u chorych we wczesnym okresie choroby, co być może jest związane ze stymulacją antygenową na początku choroby i wytworzeniem przeciwciał, które dopiero w miarę jej trwania są produkowane w większej liczbie. Kolejnym etapem badań było określenie swoistości ANCA obecnych w płynach stawowych. Wykazano, że ANCA najczęściej, czyli w 44,1%, reagowały swoiście z laktoferryną. Miały one ponadto swoistość dla mieloperoksydazy w 19,6%, dla lizozymu w 9,8%, katepsyny G w 18,6% i dla elastazy w 7,8% badanych płynów. Wyniki te są podobne do uzyskanych w badanych surowicach chorych na RZS. Potwierdzają one obserwacje dokonane przez Afeltra i wsp. [11]. Podobnie jak we wcześniejszych doniesieniach ANCA stwierdzane w przebiegu RZS wykazywały głównie swoistość dla laktoferryny [12, 13]. Vittecoq i wsp. [14] uważają, że z uwagi na brak standaryzacji ELISA w ocenie przeciwciał przeciw laktoferrynie należy ostrożnie interpretować uzyskane wyniki. Potwierdzają to obserwacje własne. Często okazuje się, że komercyjne zestawy do oznaczania LF-ANCA są zanieczyszczone innymi antygenami [15]. W obecnych wynikach interesujące jest to, że ANCA reagujące z mieloperoksydazą wykazano częściej w płynie stawowym niż w surowicy krwi [10]. Wskazuje to na możliwość syntezy MPO-ANCA w obrębie jamy stawowej jako efekt aktywacji granulocytów obojętnochłonnych, w wyniku której dochodzi do uwolnienia mieloperoksydazy – enzymu mającego istotne znaczenie w metabolizmie tlenowym aktywowanych komórek. Przy omawianiu ANCA o swoistości dla mieloperoksydazy należy pamiętać o możliwości ich reakcji krzyżowych z przeciwciałami przeciw tyreoperoksydazie (TPO). W badaniach Cambrigde i wsp. [16] wykazano, że przeciwciała przeciw TPO reagowały z mieloperoksydazą, co wywoływało okołojądrowy typ świecenia w metodzie immunofluorescencji pośredniej. Ciekawy jest fakt, że w tych badaniach MPO-ANCA pochodzące od chorych z rozpoznaniem vasculitis nie reagowały z TPO. Autorzy uważają, że pojawienie się MPO-ANCA w przypadkach, w których nie spodziewano się tego typu autoprzeciwciał, może wynikać właśnie z takiej reakcji krzyżowej. W niniejszej pracy nie badano obecności przeciwciał przeciw tyreoperoksydazie, a w grupie badanej nie stwierdzono cech chorób autoimmunologicznych gruczołu tarczowego, trudno zatem odnieść się do spostrzeżeń autorów. Obecności ANCA o swoistości dla elastazy nie obserwowano w płynach pochodzących od chorych we wczesnym okresie choroby. Pojawiły się one natomiast w płynach uzyskanych od osób z wieloletnim czasem trwania RZS. Fakt ten można tłumaczyć tym, że elastaza nie jest enzymem dominującym w ziarnistościach granulocytów obojętnochłonnych, a zatem do jej pojawienia się prawdopodobnie predysponuje: przewlekanie się procesu zapalnego i ciągła aktywacja komórek uwalniających enzymy w procesie fagocytozy, stymulacja PMN przez immunoglobuliny, a także ich apoptoza. Staje się ona następnie autoantygenem. Hipoteza ta wymaga jednak potwierdzenia z doborem odpowiedniej grupy chorych. W badanych płynach stawowych nie wykazano obecności ANCA o swoistości dla proteinazy 3. Jest to zgodne z obserwacjami innych autorów [17]. ANCA o swoistości dla proteinazy 3 występują głównie u chorych z ziarniniakiem Wegenera. Niezmiernie rzadko spostrzega się je w innych zapaleniach naczyń [18, 19]. Wykrycie ich u chorych na przewlekłe choroby zapalne wynikało prawdopodobnie z zanieczyszczeń innymi antygenami, co mogło prowadzić do uzyskania fałszywie dodatnich wyników. W pracy ocenie poddano klasy i podklasy immunoglobulin ANCA obecnych w płynie stawowym. Wykazano, że występują one w 24,5% w klasie IgM, co jest wartością wyższą w porównaniu z ANCA obserwowanymi w surowicy krwi (7,5%) [10]. Tłumaczyć to można faktem wcześniejszej syntezy ANCA w obrębie zmienionej zapalnie jamy stawowej w przebiegu choroby. Ekspozycja antygenów pochodzących z PMN prowadzi do syntezy początkowo IgM ANCA, w póŸniejszym okresie IgG ANCA. Przeciwciała w klasie IgG wykazano w 75% badanych płynów, co w porównaniu z surowicami, gdzie obecne były w 92,% jest wartością niższą. Występowały one w podklasach IgG1 i IgG3, jednak proporcje ich były nieco zmienione na korzyść IgG3. Nie stwierdzono MPO-ANCA w klasie IgM. Można to tłumaczyć stymulacją MPO zachodzącą wcześniej w rozwoju choroby, co mogło nastąpić w fazie nacieków zapalnych w błonie maziowej. Jednak są to jedynie przypuszczenia. Wyjaśnienie ich wymaga zebrania grupy chorych składającej się z osób z nawracającym zapaleniem stawów we wczesnym okresie choroby, okresowego pobierania płynu stawowego i poszukiwania w nim obecności ANCA oraz charakterystyki klasy immunoglobulin. W badaniu autorów nie przeprowadzono takich obserwacji, nie dokonano ich również poprzednio. Jednocześnie z oceną ANCA poszukiwano innych autoprzeciwciał, szczególnie czynnika reumatoidalnego, przeciwciał przeciwjądrowych i GS-ANA. Obecność czynnika reumatoidalnego wykazano w 92,6% płynów stawowych, w których były także obecne ANCA. W 83% przypadków były to P-ANCA. W płynach, w których obecne były A-ANCA, czynnik reumatoidalny obserwowano u 17%. Jednoczesne występowanie ANCA i ANA w płynach stawowych wykazano u 7,69% badanych, co było porównywalne z wynikami uzyskanymi w badanych surowicach, gdzie współwystępowanie ANCA i ANA obserwowano w 6,25% przypadków. Podobne wyniki uzyskali Afeltra i wsp.[11], którzy tłumaczą brak korelacji niezależną odpowiedzią immunologiczną w stosunku do antygenów jądrowych i enzymów PMN, natomiast Rother i wsp. [20] obserwowali ANA częściej, bo u 59% ANCA+ chorych na RZS w porównaniu z 23% osób ANCA-. Autorzy ci wykazali także, że miano ANA było wyższe w grupie ANCA+. Wyniki te jednak nie wykazywały statystycznie istotnych różnic.

Piśmiennictwo
1. Falk RJ, Jennette JC. Anti-neutrophil cytoplasmic autoantibodies with specificity for myeloperoxidase in patients with systemic vasculitis and idiopathic necrotizing and crescentic glomerulonephritis. N Eng J Med 1988; 318: 1651-7.
2. Arnett FC, Edworthy SM, Bloch DA, et al. The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 1988; 31: 315-24.
3. Altman R, Asch E, Bloch G. Development of criteria for the classification and reporting of osteoarthritis: classification of osteoarthritis of the knee. Arthritis Rheum 1986; 29: 1039-49.
4. Wiik A. Delineation of a standard procedure for indirect immunofluorescence detection of ANCA. APMIS 1989; 97: 12-3.
5. Wiik A, Rasmussen N, Wislander J. Methods to detect autoantibodies to neutrophilic granulocytes. In: Manual of biological markers of disease. A9,1-14. Kluwer Academic Publishers, 1994.
6. Zimmermann-Górska I, Białkowska-Puszczewicz G, Puszczewicz M. Atlas płynu stawowego. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 1995.
7. Abad E, Carbonell M, Tural C, et al. ANCA antibodies in rheumatoid arthritis. Clin Exp Immunol 1993; 93: 46-51.
8. Bosch X, Liena J, Collado A, et al. Occurrence of antineutrophil cytoplasmic and antineutrophil (peri) nuclear antibodies in rheumatoid arthritis. J Rheumatol 1995; 22: 2038-45.
9. Braun M, Csernok E, Schmitt WH, et al. Incidence, target antigens, and clinical implications of antineutrophil cytoplasmic antibodies in rheumatoid arthritis. J Rheumatol 1996; 23: 826-30.
10. Puszczewicz M. Przeciwciała przeciw cytoplazmie granulocytów obojętnochłonnych u chorych na reumatoidalne zapalenie stawów. Reumatologia 2006; 44: 119-27.
11. Afeltra A, Sebastiani GD, Galeazzi M, et al. Antineutrophil cytoplasmic antibodies in synovial fluid and in serum of patients with rheumatoid arthritis and other types of synovitis. J Rheumatol 1996; 23: 10-5.
12. Mulder AH, Horst G, van Leeuwen MA, et al. Antineutrophil cytoplasmic antibodies in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 1993; 36: 1054-6.
13. Mustila A, Paimela L, Leirisalo-Repo M, et al. Antineutrophil cytoplasmic antibodies in patients with early rheumatoid arthritis: an early marker of progressive disease. Arthritis Rheum 2000; 43: 1371-7.
14. Vittecoq O, Jouen-Beades F, Krzanowska K, et al. Prospective evaluation of the frequency and clinical significance of antineutrophil cytoplasmic and anticardiolipin antibodies in community cases of patients with rheumatoid arthritis. Rheumatology 2000; 39: 481-9.

15. Audrain MA, Baranger AR, Lockwood CM, et al. High immunoreactivity of lactoferrin contaminating commercially purified myeloperoxidase. J Immunol Method 1994, 176: 23-31.
16. Cambridge G, Williams M, Leaker B, et al. Anti-myeloperoxidase antibodies in patients with rheumatoid arthritis: prevalence, clinical correlates, and IgG subclass. Ann Rheum Dis 1994; 53: 24-9.
17. Guang LS. ANCA in RA patients. Br J Rheumatol 1996; 35: 1328-9.
18. Gross WL, Schmitt WH, Csernok E. Antineutrophil cytoplasmic autoantibody –associated diseases: A rheumatologist’s prospective. Am J Kidney Dis 1991; 18: 175-9.
19. Guilllevin L, Cohen P, Gayraud M, et al. Churg-Strauss syndrome. Clinical study and long-term follow-up of 96 patients. Medicine 1999; 78: 26-37.
20. Rother E, Schochat TH, Peter HH. Antineutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA) in rheumatoid arthritis:a prospective study. Rheumatol Int 1996; 15: 231-7.