Współcz Onkol (2003) vol. 7, 2 (90-94)
WSTĘP>br>
Śmierć komórek, podobnie jak proliferacja, jest naturalnym procesem fizjologicznym, który zachodzi w każdym organizmie. Komórki umierają zarówno w okresie embriogenezy, jak i w dorosłym organizmie (np. komórki nabłonkowe, dojrzewające komórki krwiotwórcze, czy komórki z uszkodzonym DNA). Szczególną odmianą apoptozy jest śmierć komórki w wyniku utraty kontaktu z podłożem. Ten rodzaj śmierci komórek został nazwany anoikis [1, 2]. Anoikis spowodowane jest zaburzeniem oddziaływań komórka – macierz zewnątrzkomórkowa. Zmiany komórki, jakie są następstwem utraty kontaktu z podłożem są takie same, jak w przypadku śmierci apoptotycznej. Istnienie zjawiska anoikis wskazuje, iż adhezja wpływa na przeżywanie lub śmierć komórek. Dla komórek zależnych od przylegania (ang. anchorage dependent) zjawisko adhezji do ECM warunkuje ich przeżywanie w warunkach braku dostępu czynników troficznych [3]. Rytomaa i wsp. [4] dowiedli, że oderwanie komórek od macierzy zewnątrzkomórkowej indukuje w nich anoikis . Autorzy wskazują, iż utrata adhezji powoduje uwolnienie cytochromu c z mitochondrium, a proces ten może być blokowany przez inhibitory kaspaz. Wykazano również, iż oderwanie komórek wpływa na uaktywnienie białka Bax. Anoikis w warunkach in vivo sprawia, iż komórki oderwane od podłoża nie są zdolne do ponownego zagnieżdżenia i do wzrostu ektopowego. W komórkach nowotworowych, na skutek zmian w charakterystyce białek adhezyjnych uczestniczących w oddziaływaniach komórka-komórka, zmian dotyczących integryn, jak również białek regulatorowych apoptozy dochodzi do ujawnienia oporności na anoikis . Zmniejszona wrażliwość na anoikis ułatwia przeżywanie komórek w warunkach braku adhezji, co z kolei determinuje fenotyp inwazyjny tych komórek i rozwój choroby. W niniejszej pracy podjęto próbę kontynuowania badań dotyczących mechanizmów przeżywania komórek w warunkach braku adhezji. We wcześniejszej pracy [5] wykazano, iż oporność komórek nowotworowych na anoikis może być związana z niezależną od adhezji ekspresją białka FAK. W bieżącej pracy szczególną uwagę zwrócono na transdukcję sygnału apoptotycznego związanego z mitochondriami, stąd badano białka rodziny BCL, cytochrom c, kaspazy. Część badań poświęcono również wstępnym analizom wpływu braku adhezji na mechanizmy naprawy DNA komórek. Otrzymane wyniki wnoszą nowe informacje dotyczące przeżywania komórek w warunkach nieadhezyjnych. Pozwalają lepiej zrozumieć mechanizmy oporności komórek nowotworowych na apoptozę zależną od adhezji.
MATERIAŁ I METODY
Hodowla komórkowa
– linie komórkowe:
OVP 10 i HCV-29
Badania przeprowadzono na ludzkich liniach komórkowych: OVP 10 oraz HCV-29. Linia OVP 10 została wyprowadzona z wysięku raka jajnika [6], natomiast komórki HCV-29 pochodziły z nabłonka przejściowego pęcherza moczowego [7]. Komórki były hodowane w pożywce Eagle’a z dodatkiem 10 proc. surowicy oraz antybiotyków: penicyliny 100 jednostek/1 ml i streptomycyny 0,4 mg/1 ml w atmosferze 5 proc. CO2 i 90 proc. wilgotności, w temp. 37oC. Hodowlę prowadzono na 160 mm płytkach do momentu prawie całkowitego pokrycia dna płytki przez komórki. Wówczas komórki przepłukiwano PBS i hodowano dalej przez 24 godz. w medium bez surowicy. Komórki przepłukiwano PBS i przechowywano do czasu eksperymentów w temp. -70oC. Ponieważ badania prowadzono również na komórkach określanych dalej jako nieadhezyjne, toteż po 24 godz. inkubacji w nieobecności surowicy, część z nich pozbawiono adhezji. W tym celu komórki trypsynizowano (trypsyna 0,25 proc.) zdrapywano z płytek używając cell scrape’a, a następnie po kilku płukaniach w PBS, zawieszano w płynie hodowlanym Eagle’a. Tak przygotowane zawiesiny inkubowano przez 4 godz. w warunkach hodowlanych na kołysce laboratoryjnej. Po 4 godz. inkubacji zbierano komórki. Materiał przechowywano w temp. -70oC.
Izolacja białek
Osad komórek zawieszano w buforze lizującym o następującym składzie: 10 mM TrisHCl pH 7,5; 1 proc. NP40; 0,5 proc. deoksycholan sodu; 0,1 proc. SDS z dodanymi przed użyciem inhibitorami proteaz: 30 μl/ml aprotynina; 1 mM ortowanadian sodu; 5 mg/ml pepstatyna A; 10 μg/ml leupeptyna; 100 mg/ml PMSF. Zawiesinę komórek inkubowano w 4oC przez 30 min i wirowano przez 20 min przy 12 500 rpm. Supernatanty przenoszono do nowych probówek. Stężenie białka oznaczano metodą Lowry’ego [8] wykorzystując procedurę i odczynniki firmy BioRad. Widmo absorpcyjne analizowano przy długości fali 750 nm. Do pomiarów wykorzystano spektrofotometr typu Beckman Du-65. Stężenie białek obliczono na podstawie sporządzonej wcześniej krzywej kalibracyjnej.
Izolacja frakcji mitochondrialnej i cytozolowej
Komórki lizowano w buforze S [9] (15 mM Tris pH 7,6, 0,25 mM sacharoza, 1 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1 mM EGTA, 2 mM EDTA, 2,5 μg/ml aprotynina, 10 μg/ml leupeptyna, 0,5 mM PMSF, 0,1 mM ortowanadian sodu, 2 mM pirofosforan sodu, 1,25 μg/ml pepstatyna) przez 30 min w lodzie. Wirowano następnie w 4oC, przy 700 rpm przez 10 min. Supernatant przeniesiono do nowych probówek i wirowano w 4oC, w 13 500 rpm przez 20 min uzyskując w osadzie frakcję mitochondrialną (Mt), zaś w supernatancie fazę cytoplazmatyczną (C). Frakcję Mt zawieszono w buforze S.
Western blotting
Białkowe ekstrakty poddano analizie metodą Western blotting. W tym celu po określeniu stężenia białka całkowitego w próbie przystąpiono do przeprowadzenia rozdziału elektroforetycznego, a następnie elektrotransferu białek z żelu na błonę nitrocelulozową. Rozdział wykonano w żelu poliakrylamidowym: 4 proc. żelu zagęszczającym i 12 proc. żelu rozdzielającym. Próby mieszano z buforem SDS (0,185 M. TrisHCl pH 6,8; 14,8 proc. glicerol; 4,44 proc. SDS; 7,41 proc. 2-merkaptoetanol; 0,015 błękit bromofenolowy) w stosunku 1:1 i gotowano 1–2 min. Nanoszono po 50 mg białka do studzienki. Elektroforezę przeprowadzono w temperaturze pokojowej. Następnie przystąpiono do elektrotransferu. Proces przeprowadzono w buforze do elektrotransferu (48 mM Tris pH 9,2, 39 mM glicyna, 20 proc. metanol) w 4oC. Blotowano na filtr nitrocelulozowy Hybond-ECL firmy Amersham 60 min przy napięciu 100 V (aparat do blotowania BioRad). Stężenia przeciwciał: I-rzędowe (100–200 μg/ml) rozcieńczano 100–200 razy; II-rzędowe (200 μg/0,5 ml) rozcieńczano 2 000 razy. Błonę blokowano 5 proc. mlekiem, następnie po przepłukaniu PBST inkubowano z przeciwciałami I-rzędowymi godzinę (anty-blc-2, anty-bax, anty-cytochrom c-Santa Cruz; anty-rad51, anty-msh-2 – Oncogene). Przepłukiwano PBST i inkubowano z przeciwciałami II-rzędowymi (Santa Cruz). Do detekcji metodą chemiluminescencji zastosowano odczynniki firmy Amersham. Po kolejnym płukaniu w PBST błonę inkubowano minutę z odczynnikami A i B do detekcji, według zaleceń producenta. Kliszę naświetlano 1–3 min, wywoływano, płukano w wodzie i utrwalano w utrwalaczu.
WYNIKI
Badanie wpływu utraty adhezji
na naprawę DNA w komórkach OVP 10 i HCV-29
– analiza białek RAD51 i MSH-2
W celu sprawdzenia czy brak adhezji powoduje uszkodzenia DNA w komórkach OVP 10 i HCV-29, badano ekspresję białek uczestniczących w naprawie DNA. Analizowano białka biorące udział w naprawie podwójnoniciowych pęknięć DNA (Rad51) i usuwaniu błędnie sparowanych zasad (MSH-2). O ile w przypadku białka MSH-2 nie są zauważalne różnice w jego ekspresji między komórkami adhezyjnymi i nieadhezyjnymi obu linii komórkowych, to ekspresja białka Rad51 jest niższa w komórkach nieadhezyjnych HCV-29 niż w adhezyjnych HCV-29, zaś w komórkach OVP
10-adhezyjnych i nieadhezyjnych – pozostaje na takim samym poziomie. Na podstawie powyższych danych można jedynie przypuszczać, iż dla komórek HCV-29 utrata adhezji do podłoża może ujawniać się również w zaburzeniu naprawy DNA tych komórek. Wyniki badań przedstawiają ryc. 1. i 2.
Badanie wpływu adhezji
na proapoptotyczny
szlak mitochondrialny
w komórkach OVP 10 i HCV-29 – ekspresja białek BCL-2, BAX,
Cytochrom c, Kaspaza 3
Poszukując mechanizmów odpowiedzialnych za przeżywanie komórek w warunkach braku adhezji zwrócono uwagę na szlaki transdukcji sygnału apoptotycznego, który wiązany jest z mitochondriami. Stąd w komórkach adhezyjnych i nieadhezyjnych obu linii komórkowych charakteryzowano białka rodziny Bcl, cytochrom c oraz kaspazę 3. Wyniki pokazano na ryc. 3.–6.
OMÓWIENIE WYNIKÓW
Zdolność komórek nowotworowych do przeżywania w krwiobiegu jest jednym z głównych czynników, które sprzyjają tworzeniu wtórnego ogniska nowotworzenia, czyli przerzutu. Inwazja komórek nowotworowych przez bariery macierzy zewnątrzkomórkowej wymaga adhezji komórek do śródbłonka, sekrecji enzymów proteolitycznych, uruchomienia mechanizmów sprzyjających migracji komórek, wiąże się zatem z aktywacją określonych kaskad wewnątrzkomórkowych reakcji [10, 11]. W niniejszej pracy przedstawiono wyniki badań przeprowadzonych na dwóch ludzkich liniach komórkowych – OVP 10 – linii komórek raka jajnika oraz HCV-29, która została wyprowadzona z komórek nabłonka przejściowego pęcherza moczowego. We wcześniejszej pracy [5] wykazano, iż komórki OVP 10 w przeciwieństwie do komórek linii HCV-29 ujawniają fenotyp komórek wyraźnie niezależny od zakotwiczenia (ang. anchorage independent). Badania odsetka komórek apoptotycznych wykazały, iż oderwanie od podłoża jest istotnym czynnikiem indukującym apoptozę wśród komórek HCV-29, które barwione odczynnikiem Hoechsta wykazały ok. 3–4--krotnie wyższą liczbę komórek apoptotycznych niż komórki OVP10. Również procent komórek TUNEL pozytywnych był wyraźnie wyższy dla komórek HCV-29 [5]. Tak znaczące różnice w oporności komórek na anoikis wiązano głównie z ekspresją białka FAK. Komórki OVP 10 eksprymowały FAK niezależnie od adhezji, zaś w komórkach HCV-29 FAK był obecny jedynie w warunkach adhezyjnych [5]. Nieobecność FAK w komórkach HCV-29 pozbawionych adhezji sugerowała potranslacyjne modyfikacje FAK, ponieważ mRNA dla genu FAK stwierdzono w komórkach HCV-29 zarówno adhezyjnych, jak i nieadhezyjnych [5]. Niniejsza praca jest kontynuacją badań dotyczących mechanizmów przeżywania komórek w warunkach braku adhezji. Skądinąd wiadomo [5], iż w warunkach pozbawienia adhezji nie dochodzi do aktywacji transkryptów genów p21 i GADD45. Wobec tego można przypuszczać, iż najprawdopodobniej śmierć komórek nieadhezyjnych obu linii – a zwłaszcza HCV-29 – nie jest związana z uszkodzeniem DNA i zatrzymaniem komórek w cyklu. W celu sprawdzenia czy rzeczywiście brak adhezji nie powoduje uszkodzeń DNA w komórkach OVP 10 i HCV-29, w niniejszej pracy badano ekspresję białek uczestniczących w naprawie DNA. Analizowano białka biorące udział w naprawie podwójnoniciowych pęknięć DNA (Rad51) i usuwaniu błędnie sparowanych zasad (MSH-2). O ile w przypadku białka MSH-2 nie są zauważalne różnice w jego ekspresji między komórkami adhezyjnymi i nieadhezjnymi obu linii komórkowych (ryc. 2.), to ekspresja białka Rad51 jest niższa w komórkach nieadhezyjnych HCV-29 niż w adhezyjnych HCV-29, zaś w komórkach OVP 10 – adhezyjnych i nieadhezyjnych – pozostaje na takim samym poziomie (ryc. 1.). Można zatem przypuszczać, iż oderwanie komórek HCV-29 od podłoża może wpływać na zaburzenia naprawy DNA w tych komórkach.
Rozważając różne mechanizmy, które mogą ułatwiać przeżywanie komórek w warunkach braku adhezji zwrócono również uwagę na szlaki transdukcji sygnału apoptotycznego, który obejmuje czynniki związane bezpośrednio lub pośrednio z mitochondriami. Wielu badaczy podkreśla zdolność białka Bax do zwiększania przepuszczalności błon mitochondrialnych. Następstwem tego procesu może być translokacja cytochromu c do cytoplazmy i aktywacja apoptotycznych prokaspaz efektorowych, w tym i prokaspazy 3 [12–14]. Rytomaa i wsp. [4] dowiedli, iż oderwanie komórek od podłoża powoduje uwolnienie cytochromu c z mitochondrium do cytoplazmy i indukuje w tych komórkach proces apoptotyczny. W niniejszej pracy wykazano, iż niespodziewanie komórki HCV-29 cechuje niższa ekspresja białka Bax niż komórki OVP 10 (ryc. 4.). Badając natomiast cytochrom c we frakcji mitochondrialnej i cytozolowej komórek obu linii zauważono, że w przypadku komórek OVP 10 oderwanie od podłoża powoduje translokację cytochromu c do cytoplazmy, zaś we frakcji cytozolowej nieadhezyjnych komórek HCV-29 nie stwierdzono obecności tego białka (ryc. 5a.–b.). Powyższe wyniki wydają się sugerować, iż w przypadku pozbawienia adhezji uwolnienie cytochromu c jest bardziej widoczne w komórkach OVP 10 niż HCV-29. Jednakże jak dalej wykazano komórki te nie posiadają kaspazy 3 (ryc. 6.), dlatego proces apoptotyczny wynikający z uwolnienia cytochromu c do cytoplazmy nie może być dalej realizowany. Można także wnioskować, iż dla komórek HCV-29 czynnikiem strategicznym dla przeżycia jest kontakt z podłożem i ekspresja FAK. Są one bardziej zależne od zakotwiczenia niż OVP 10, dlatego adhezja determinuje w sposób bezpośredni oporność tych komórek na anoikis [5]. W pracy badano także białko Bcl-2 w komórkach OVP 10 i HCV-29. Wykazano wyższą jego ekspresję w komórkach HCV-29 niż OVP 10 (ryc. 3.). W świetle wielu danych literaturowych o proproliferacyjnym i antyapoptotycznym charakterze tego białka uzyskano w ten sposób nieco zaskakujący wynik. Warto jednak wspomnieć, iż dosyć niedawno zostały opublikowane przez Saintigny i wsp. [15] dane, które wskazują, iż białko BCL-2 może również hamować procesy rekombinacji kierowane przez Rad51. Można – z dużym jednak przybliżeniem – wiązać te informacje i wnioskować, iż wyższa ekspresja Bcl-2 w HCV-29 pozostaje w związku z wykazaną wcześniej niską ekspresją Rad51 w tych komórkach.
Otrzymane w tej pracy wyniki wnoszą nowe informacje dotyczące biologicznych procesów uczestniczących w zachowaniu komórek w warunkach nieadhezyjnych. Praca uwidacznia możliwy mechanizm oporności komórek nowotworowych (OVP 10 – rak jajnika) na apoptozę zależną od adhezji. Utrata zdolności do przylegania inicjuje w komórkach OVP 10 szereg procesów proapoptotycznych – uwalniany jest m.in. cytochrom c z mitochondrium do cytoplazmy, jednak charakterystyczna dla tych komórek nieobecność białka efektorowego – kaspazy 3 sprawia, iż dalsze, wykonawcze etapy apoptozy są utrudnione. W tym świetle, wykazana wcześniej wysoka oporność komórek OVP 10 na anoikis [5] wydaje się być lepiej wytłumaczalna.
PIŚMIENNICTWO
1. Assioan RK. Anchorage – dependent cell cycle progression. Mini-review. J Cell Biology 1997; 136: 1-4.
2. Janik P, Małecki M. The homeless tumor cells. Adv Clin Exp Med 2000; 9: 103-6.
3. Ilić D, Almeida EA, Schlaepfer DD, Dazin P, Aizawa S, Damsky CH. Extracellular matrix survival signals transduced by focal adhesion kinase suppress p53-mediated apoptosis. J Cell Biol 1998; 143: 547-60.
4. Rytomaa M, Lehmann K, Downward J. Matrix detachment induces caspase-dependent cytochrome c release from mitochondria: inhibition by PKB/Akt but not Raf signalling. Oncogene 2000; 9: 4461-8.
5. Małecki M, Soroczyńska P, Janik P. Badania mechanizmu przeżywania komórek w warunkach braku adhezji. Wspóczesna Onkologia 2000; 4: 51-4.
6. Szaniawska B, Gawrychowski K, Janik P. The effect of protein kinase c inhibitors on invasion of human ovary cancer cells. Neoplasma 1998; 45: 7-11.
7. Christensen B, Kieler J, Vilien M, Dong P, Wang CY, Wolf H. A classification of human urothelial cells propagated in vitro. Anticancer Res 1984; 4: 319-38.
8. Lowry CH, Rosenbrough MR, Randall RJ. Protein measurment with the Folin phenol reagent. J Biol Chem 1951; 193: 265-75.
9. Siesjo BK, Hu B, Kristian T. Is the cell death pathway triggered by the mitochondrion or the endoplasmic reticulum? J Cereb Blood Flow Metab 1999; 19: 19-26.
10. Liotta LA, Steeg PS, Stetler-Stevenson WG. Cancer metastasis and angiogenesis: an imbalance of positive and negative regulation. Cell 1991; 64: 327-36.
11. Bohle AS, Kalthoff H. Molecular mechanisms of tumor metastasis and angiogenesis. Langenbeck’s Arch Surg 1999; 384: 133-40.
12. Oltvai ZN, Milliman CL, Korsmeyer SJ. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, Bax, that accelerates programmed cell death. Cell 1993; 74: 609-19.
13. Green DR., Reed JC. Mitochondria and apoptosis. Science 1998; 281: 1309-12.
14. Shimizu S, Narita M, Tsujimoto Y. Bcl-2 family proteins regulate the release of apoptogenic cytochrome c by the mitochondrial channel VDAC. Nature 1999; 399: 483-7.
15. Saintigny Y, Dumay A, Lambert S, Lopez BS. A novel role for the Bcl-2 protein family: specific suppression the RAD51 recombination pathway. EMBO J 2001; 20: 2596-607.
ADRES DO KORESPONDENCJI
dr med. Maciej Małecki
Zakład Biologii Komórki
Centrum Onkologii – Instytut
im. M. Skłodowskiej-Curie
ul. Roentgena 5
02-781 Warszawa
tel. 0 (prefiks) 22 546 26 21
e-mail: mahan@poczta.wp.pl
Autor jest stypendystą
Fundacji na rzecz
Nauki Polskiej 2002 i 2003
