Rak żołądka. Morfologia

1. Wprowadzenie

Rozpoznanie raka żołądka w większości przypadków można ustalić na podstawie badania mikroskopowego. Badanie histopatologiczne zwykle polega na ocenie preparatu barwionego hematoksyliną i eozyną (HE). Jednak w części przypadków wskazane jest zastosowanie dodatkowych metod histochemicznych (na przykład celem wykrycia produkcji śluzu w komórkach), immunohistochemicznych (celem oceny ekspresji markerów komórkowych) lub molekularnych (aby określić mutacje genów istotne dla terapii celowanej). Wynik badania patomorfologicznego oraz ocena endoskopowa zmiany wraz z badaniami obrazowymi pozwalającymi określić kliniczny stopień zaawansowania choroby, jakimi są badania radiologiczne, ultrasonograficzne i tomografia komputerowa, stanowią podstawę do wdrożenia optymalnej dla pacjenta metody leczenia. W każdym przypadku należy również uwzględnić dane kliniczne, wywiad dotyczący przebiegu choroby, współistniejące schorzenia, terapie lekami, na przykład niesteroidowymi lekami przeciwzapalnymi, oraz wyniki wcześniejszych badań histopatologicznych.
Rozpoznanie raka żołądka ustala patomorfolog na podstawie badania materiału pobranego metodami endoskopowymi w postaci małej biopsji (wycinka) lub metodami minimalnie inwazyjnymi, takimi jak endoskopowe wycięcie śluzówkowe (endoscopic mucosal resection – EMR) lub endoskopowa dysekcja podśluzówkowa (endoscopic submucosal dissection – ESD), śródoperacyjnego badania skrawków mrożonych lub materiału operacyjnego otrzymanego w wyniku całkowitej lub częściowej resekcji żołądka. W każdym wymienionym przypadku istnieją odmienne wskazania, ograniczenia i wytyczne diagnostyczne. Z uwagi na szeroki dostęp chorych z rakiem żołądka do diagnostyki zarówno przed-, jak i pooperacyjnej celowe wydaje się przyjęcie powszechnie akceptowanych zasad i procedur w ustalaniu rozpoznań histopatologicznych. Jednolity sposób opracowania raportu histopatologicznego z jednej strony prowadzi do poprawy jakości diagnostyki patomorfologicznej, z drugiej zaś strony jest bezpieczną i obiektywną podstawą wyboru przez onkologa odpowiedniej i najbardziej skutecznej terapii.

2. Materiał diagnostyczny uzyskany metodami endoskopowymi i operacyjny

Rodzaj materiału diagnostycznego, jaki patomorfolog otrzymuje do badania, determinuje sposób jego przygotowania i oceny mikroskopowej. W każdym przypadku istnieją wskazania i wytyczne do określenia klinicznie przydatnych cech histopatologicznych.

2.1. Mała biopsja endoskopowa

Mała biopsja endoskopowa jest podstawowym badaniem diagnostycznym w rozpoznawaniu raka gruczołowego żołądka i stanowi podstawę różnicowania z innymi zmianami, zarówno nowotworowymi, jak i nienowotworowymi rozwijającymi się w błonie śluzowej żołądka [1].
Zalecane jest, aby w każdym przypadku lekarz wykonujący gastrobiopsję, przesyłając pobrany wycinek do badania patomorfologicznego, dołączył do skierowania informację o ewentualnych wcześniej wykonywanych badaniach diagnostycznych.
W biopsji endoskopowej należy określić następujące stany patologiczne:
• zwykłe zapalenie błony śluzowej bez ryzyka rozwoju raka,
• przewlekłe zapalenie zanikowe obarczone ryzykiem rozwoju raka,
• zmiany przedrakowe (neoplazja śródnabłonkowa),
• raka inwazyjnego.
Trudne do oceny dla patomorfologa są zwłaszcza łagodne, zapalne, owrzodziałe guzy ze zmianami regeneracyjnymi błony śluzowej żołądka wywołane długotrwałą terapią lekową (na przykład w przebiegu choroby reumatoidalnej), nacieki chłoniaka i raka niezróżnicowanego, drobnokomórkowego. Diagnostyka różnicowa wymaga od patomorfologa dużego doświadczenia oraz wdrożenia dodatkowych metod badawczych.
Kolejnymi zmianami do różnicowania w biopsji endoskopowej są wysoko dojrzałe nowotwory neuroendokrynne (neuroendocrine neoplasm – NET, NEN) i nowotwory podścieliskowe (gastrointestinal stromal tumors – GIST), które zawsze wymagają wykonania badań immunohistochemicznych potwierdzających ich histogenezę. Należy podkreślić, że wynik badania histopatologicznego wraz z określeniem indeksu proliferacyjnego Ki67/MIB1 w nowotworach typu NEN może być podstawą do oceny zakresu wycięcia zmiany.
Aktualna klasyfikacja dysplazji/neoplazji śródnabłonkowej została opracowana przez Światową Organizację Zdrowia (World Health Organization – WHO) w 2010 r. [1]. Według niej terminy „dysplazja” i „neoplazja śródnabłonkowa” są synonimami i oba mogą być używane, bez preferencji żadnego z nich. Według WHO [1] powyższe zmiany dzielą się na następujące kategorie:
• wynik negatywny dla neoplazji śródnabłonkowej/dysplazji,
• nieokreślona neoplazja śródnabłonkowa/dysplazja,
• małego stopnia neoplazja śródnabłonkowa/dysplazja,
• dużego stopnia neoplazja śródnabłonkowa/dysplazja,
• wewnątrzśluzówkowy inwazyjny nowotwór/wewnątrzśluzówkowy rak.
Ostatnio międzynarodowy zespół patologów i klinicystów opracował wytyczne do diagnostyki i leczenia zmian przedrakowych w odniesieniu do raka żołądka [2]. Celem ich jest ustalenie kryteriów podziału chorych na grupy ryzyka rozwoju raka żołądka. Zgodnie z opracowanymi zaleceniami zapalenie zanikowe oraz metaplazja powinny być stopniowane według ich stadium zaawansowania. Chorzy ze zmianami o wysokim stopniu nasilenia powinni być traktowani podobnie jak chorzy z dużym ryzykiem rozwoju raka żołądka. Podkreślenia wymaga, że określenie wskazań do leczenia i monitorowania pacjentów w poszczególnych grupach ryzyka ściśle wiąże się z rozpoznaniem histopatologicznym uwzględniającym stopień zaawansowania zapalenia zanikowego błony śluzowej żołądka, metaplazji jelitowej i dysplazji. Ustalenie precyzyjnego rozpoznania przez patologa wymaga ścisłej współpracy z endoskopistą. Wycinki z błony śluzowej żołądka pobierane celem oceny stopnia nasilenia zaniku powinny pochodzić z miejsc powszechnie akceptowanych jako krytyczne: dwa wycinki z trzonu i jeden z kąta (umieszczone w jednym naczyniu) oraz dwa wycinki z odźwiernika (umieszczone osobno w drugim naczyniu). Każde naczynie należy opisać zgodnie z topografią pobranej biopsji. Informacja o liczbie i miejscu pobrania wycinków z podejrzanych zmian oraz umieszczenie materiału biopsyjnego na bibule w płaszczyźnie prostopadłej do powierzchni wycinka, tak aby można było ocenić na przekroju całą grubość błony śluzowej, są kluczowe dla ustalenia rozpoznania histopatologicznego. Nieprawidłowe położenie materiału uzyskanego z biopsji endoskopowej może także spowodować błędną interpretację struktur mikroskopowych przez patomorfologa.
W ostatnich latach, w dobie terapii celowanej molekularnie, biopsja endoskopowa z raka żołądka stała się przydatna do badania zaburzeń genu HER2 zarówno metodami immunohistochemicznymi, jak i molekularnymi.
Materiał pobrany podczas małej biopsji endoskopowej bada się w całości, utrwalając go w 10-procentowej zbuforowanej formalinie i zatapiając w parafinie. Nie zaleca się krojenia taśmowo kolejnych przekrojów. Wskazane jest skokowe krojenie, tzw. trymowanie bloczka parafinowego, oraz pozostawienie części materiału do badań dodatkowych.
W biopsji endoskopowej określany jest typ histologiczny raka żołądka i stopień jego dojrzałości oraz typ wg klasyfikacji Laurena (jelitowy, rozlany lub mieszany) [3]. Należy jednak zwrócić uwagę, że mały wycinek z guza, z uwagi na heterogenność mikroskopową raka żołądka, może nie być reprezentatywny dla masy całego nowotworu. Ostateczna diagnoza może być dopiero postawiona po badaniu histopatologicznym całego guza.

2.2. Zmiany w całości usuwane za pomocą metod endoskopowych

Polipy oraz zmiany płaskie lub płasko-wyniosłe z wczes­nym rakiem żołądka to zmiany usuwane w całości metodami endoskopowymi minimalnie inwazyjnymi, takimi jak endoskopowe wycięcie śluzówkowe (endoscopic mucosal resection – EMR) lub endoskopowa dysekcja podś­luzówkowa (endoscopic submucosal dissection – ESD). Do tradycyjnych wskazań do usuwania zmian w całości w jednym bloku metodą EMR należą makroskopowo typ wyniosły bez owrzodzenia, o średnicy poniżej 2 cm i typ jelitowy raka wg Laurena. Dodatkowo bierze się pod uwagę obecność zatorów z komórek raka w świetle naczyń chłonnych i krwionośnych. Wymieniane parametry są jednak pomijane w wypadku użycia technik ESD. Bogate doświadczenia japońskie oraz coraz częściej europejskie [4–6] pozwalają rozszerzać wskazania do wycięcia metodą dysekcji podśluzówkowej do następujących: 1) raka wewnątrzśluzówkowego typu jelitowego bez owrzodzenia niezależnie od wielkości, 2) raka wewnątrzśluzówkowego typu jelitowego z owrzodzeniem o średnicy poniżej 3 cm, 3) raka podśluzówkowego typu jelitowego o średnicy poniżej 3 cm z inwazją poniżej 500 m. Zalecenia koreańskie dopuszczają ESD również w przypadku raka śluzowokomórkowego (signet-ring cell carcinoma) wielkości poniżej 2,5 cm i bez inwazji naczyń limfatycznych. Wymienione kryteria mają zapewnić usunięcie wczesnego raka żołądka metodą małoinwazyjną z minimalnym ryzykiem wznowy i powstania przerzutów do węzłów chłonnych. Poza opisanymi wytycznymi do wykonania ESD wymieniane są inne zmiany, istotne z klinicznego punktu widzenia, do wycięcia metodami endoskopowymi. Zaliczają się do nich: dysplazja, podśluzówkowe guzki typu podścieliskowego (GIST) i wysoko dojrzałe nowotwory neuroendokrynne typu 1.
Materiał po endoskopowej dysekcji podśluzówkowej należy rozpiąć na płytce korkowej, drewnianej lub parafinowej i utrwalić w 10-procentowej zbuforowanej formalinie. Następnie należy go w całości pokroić, a kolejne przekroje zbadać mikroskopowo. Raport histopatologiczny w przypadku zmian w żołądku usuwanych metodami EMR i ESD uwzględnia ocenę marginesu bocznego w obrębie błony śluzowej i marginesu w głębi, uznając odległość 2 mm za margines doszczętny mikroskopowo (R0). W razie trudności w ocenie ognisk mikroinwazji można zastosować metodę immuno­histochemiczną z przeciwciałem przeciwko keratynie, która pozwala wykryć pojedyncze rozproszone komórki raka.

2.3. Badanie śródoperacyjne skrawków mrożonych

Przydatność badania śródoperacyjnego skrawków mrożonych w czasie resekcji pierwotnych lub przerzutowych raków żołądka jest dyskutowana w różnych ośrodkach klinicznych. Rzadko się zdarza, aby pierwotne rozpoznanie raka żołądka ustalano na podstawie diagnostyki małych, incydentalnych zmian w wątrobie, guzków sieci lub jajnika podejrzanych o przerzuty tego nowotworu. W niektórych szpitalach wykonuje się ocenę marginesu chirurgicznego żołądka z rakiem. W przypadku typu rozlanego raka z obecnością rozproszonych małych grup lub pojedynczych komórek naciekających w rozproszeniu podścielisko, łatwo jest jednak je pominąć w preparacie mrożonym. Dlatego też badanie skrawków mrożonych z marginesu chirurgicznego ma ograniczenia w interpretacji mikroskopowej.

2.4. Materiał operacyjny pobrany z żołądka z rakiem

Materiał operacyjny pobrany z żołądka z rakiem pochodzi z całkowitej lub częściowej dystalnej i proksymalnej resekcji żołądka (gastrektomii całkowitej lub częściowej). Przedstawione poniżej wytyczne do badania makroskopowego i mikroskopowego uwzględniają standardy japońskie, europejskie i amerykańskie [3, 7–9].

2.4.1. Utrwalenie materiału

Przygotowanie materiału operacyjnego do wykonania badania histopatologicznego wymaga zastosowania prawidłowego utrwalacza i optymalnego czasu utrwalania. W celu odpowiedniego przygotowania usuniętego żołądka z guzem należy go rozciąć wzdłuż przedniego brzegu krzywizny większej, rozpiąć na płytce korkowej lub innej i włożyć do pojemnika z 10-procentową zbuforowaną formaliną na 8 godzin do maksymalnie 48 godzin. Po 24 godzinach wskazane jest zdjęcie go z płytki celem utrwalenia od strony surowicówki. Jeżeli rozcięcie żołądka wzdłuż krzywizny większej nie jest możliwe ze względu na obecność guza w tym miejscu, to należy przeciąć ścianę żołądka łukiem dookoła guza lub wzdłuż przedniego brzegu krzywizny mniejszej. Margines proksymalny i dystalny oraz ewentualny naciek raka w obrębie surowicówki należy oznaczyć tuszem.

2.4.2. Badanie makroskopowe

Badanie makroskopowe usuniętego żołądka wraz z rakiem polega na określeniu następujących parametrów:
1. Wymiarów materiału operacyjnego: długości żołądka (wzdłuż krzywizny większej i mniejszej), długości przeły-ku i/lub dwunastnicy, jeżeli narządy te nadesłano do badania.
2. Lokalizacji guza w żołądku w okolicy:
• wpustu, dna, trzonu, części odźwiernikowej,
• krzywizny większej, krzywizny mniejszej,
• ściany przedniej i ściany tylnej żołądka.
3. Największego wymiaru guza.
4. Makroskopowego typu guza.
Rak żołądka ze względu na stopień zaawansowania i głębokość naciekania dzieli się na dwie główne kategorie: raka wczesnego i zaawansowanego. Rak wczesny jest ograniczony do błony śluzowej i/lub podśluzowej, niezależnie od stanu węzłów chłonnych. Rak zaawansowany nacieka co najmniej warstwę mięśniową ściany żołądka oraz tkanki otaczające. Typ makroskopowy wczesnego raka żołądka został określony w klasyfikacji Japanese Research Association for Gastric Cancer dla stopnia zaawansowania T1 nowotworu w klasyfikacji TNM. W tabelach I i II przedstawiono makroskopowe typy wczesnego i zaawansowanego raka żołądka. Na szczególną uwagę zasługuje typ 0 III raka wczesnego, w którym naciek raka ograniczony jest do brzegów owrzodzenia. W rzadkich przypadkach wycinek pobrany podczas biopsji endoskopowej z brzegu owrzodzenia może zawierać cały naciek raka, a w materiale operacyjnym, mimo dokładnego i seryjnego zbadania całego guza, można nie wykryć nowotworu. Cechą tą wczesny rak żołądka różni się od podobnego typu 0 III powierzchownego raka przełyku, gdy naciek raka stwierdza się również w dnie owrzodzenia.
Szczególną postać stanowi typ 4 zaawansowanego raka żołądka, który rozlegle i szeroko szerzy się śródściennie, zajmując często całą grubość ściany narządu. W początkowych stadiach rozwoju ta postać raka może być łatwa do przeoczenia w badaniu endoskopowym, a powierzchownie pobrane wycinki nie będą zawierały utkania nowotworu. W przypadkach tych brzeg guza jest niemożliwy do oceny i dlatego w niektórych ośrodkach klinicznych w trakcie operacji wykonuje się badania śródoperacyjne celem dokładniejszej oceny resekcyjności nowotworu. W zaawansowanym stadium rak równomiernie nacieka ścianę żołądka, znacznie zwężając jego światło.
5. Przybliżoną głębokość nacieku nowotworowego w ścianie żołądka z określeniem warstw ściany żołądka objętych tym naciekiem i stwierdzeniem, czy naciek obejmuje tkanki otaczające żołądek.
6. Stan marginesu proksymalnego i dystalnego z zaznaczeniem, czy marginesy są zajęte przez proces nowotworowy, i podaniem odległości marginesu od nacieku nowotworowego.
7. Opis zmian na powierzchni surowicówki z zaznaczeniem ich tuszem.
8. Stan, lokalizację i liczbę węzłów chłonnych z określeniem liczby powiększonych węzłów chłonnych podejrzanych o przerzuty nowotworowe.
9. Stan sieci mniejszej, większej i otaczających tkanek.
10. Opis śledziony, jeżeli jest obecna w materiale operacyjnym.

2.4.3. Określenie miejsc i minimalnej liczby pobranych wycinków

W celu ustalenia pełnego rozpoznania histopatologicznego patomorfolog zobowiązany jest do pobrania następujących wycinków z materiału pooperacyjnego:
a) margines proksymalny;
b) margines dystalny;
c) margines radialny (zawsze oznaczony tuszem), który w żołądku stanowią tkanki miękkie niepokryte otrzewną w najbliższym sąsiedztwie najgłębszego nacieku raka. W żołądku jedynymi marginesami radialnymi mogą być również marginesy w obrębie sieci mniejszej (więzadła wątrobowo-dwunastnicze i wątrobowo-żołądkowe) oraz krzywizny większej;
d) przynajmniej 3 wycinki z guza zawierające:
• najgłębszy naciek w ścianie żołądka,
• najbliższy naciek od strony marginesu proksymalnego/ dystalnego,
• zajęcie surowicówki,
• zajęcie marginesu obwodowego w guzach wpustu;
e) węzły chłonne (ważna jest liczba usuniętych węzłów chłonnych – minimum 15) mogą być usunięte w grupach przez chirurga i przysłane w oddzielnych pojemnikach lub w jednym bloku z żołądkiem;
f) jeżeli usunięta jest śledziona, to należy pobrać dodatkowo węzły chłonne wnęki śledziony;
g) wycinki ze ściany żołądka spoza guza;
h) wycinki z innych zmian w błonie śluzowej i/lub ścianie żołądka.
Ryciny 1., 2A i 2B przedstawiają sposoby pobrania wycinków w raku wczesnym i zaawansowanym żołądka [7].

2.4.4. Zasady badania mikroskopowego materiału operacyjnego

W badaniu mikroskopowym materiału operacyjnego należy określić typ histologiczny i stopień dojrzałości wg klasyfikacji Światowej Organizacji Zdrowia (World Health Organization – WHO), typ histologiczny wg Laurena, stopień kliniczno-patologicznego zaawansowania raka wg systemu pTNM AJCC/UICC oraz stopień resekcyjności R [1].

Typ histologiczny raka żołądka:
• rak gruczołowy (adenocarcinoma):
– rak gruczołowy brodawkowaty (papillary adenocarcinoma) (ryc. 3.),
– rak gruczołowy cewkowy (tubular adenocarcinoma) (ryc. 4.),
– rak gruczołowy śluzowy (mucinous adenocarcinoma) (ryc. 5.),
– rak o małej spoistości, w tym rak śluzowokomórkowy i inne warianty (poorly cohesive carcinoma including signet ring cell carcinoma and other variants) (ryc. 6.),
– rak gruczołowy mieszany (mixed adenocarcinoma) (ryc. 7.);
• rak gruczołowo-płaskonabłonkowy (adenosquamous carcinoma);
• rak z naciekiem limfocytarnym w podścielisku (rak rdzeniasty) [carcinoma with lymphoid stroma (medullary carcinoma)] (ryc. 8.);
• rak gruczołowy podobny do wątrobowokomórkowego (hepatoid adenocarcinoma);
• rak płaskonabłonkowy (squamous cell carcinoma);
• rak niezróżnicowany (undifferentiated carcinoma).
W tabelach III, IV i V przedstawiono charakterystykę typów histologicznych raka żołądka.

Stopień dojrzałości (zróżnicowania) raka żołądka Określenie stopnia histologicznej złośliwości (stopnia zróżnicowania) nowotworu dotyczy wg klasyfikacji WHO z 2010 r. jedynie raków gruczołowych cew-kowych i brodawkowatych. W wypadku innych typów histologicz­nych raka żołądka klasyfikacji tej się nie stosuje. W tabeli VI przedstawiono kryteria oceny stopnia dojrzałości (zróżnicowania) raka gruczołowego żołądka [1].

Stopień kliniczno-patologicznego zaawansowania nowotworu
W ramce na stronie s34 przedstawiono kryteria oceny stopnia zaawansowania raka żołądka wg siódmego wydania klasyfikacji pTNM AJCC/UICC [1, 9].
Dodatkowo w klasyfikacji pTNM stosuje się następujące oznaczenia:
• pT (m)NM – liczne guzy,
• rTNM – guz nawrotowy stwierdzany, kiedy udokumentowany jest okres bez obecności nacieku nowotworowego,
• aTNM – guz stwierdzany w trakcie autopsji.

Ocena marginesów chirurgicznych Kolejnym elementem rozpoznania histopatologicznego w wypadku raka żołądka jest ocena resekcyjności guza wg klasyfikacji R, w której dla raka żołądka przyjęto kryteria przedstawione w tabeli VII.
W celu uzupełnienia informacji podanych w tabeli VIII należy dodać, że jeśli guz zlokalizowany jest we wpuście, to ocenia się margines obwodowy (circumferential surgical resection margin – CRM) w obrębie dolnego odcinka prze-łyku wg klasyfikacji raka przełyku. Jeżeli guz (naciek raka, ogniska depozytowe w tkankach miękkich lub przerzuty w węzłach chłonnych) znajdują się w odległości mniejszej niż 1 mm od CRM, to ten margines jest określany jako mikroskopowy naciek (R1). Patomorfolog poza określeniem resekcyjności guza (klasyfikacja R) powinien podać (w milimetrach) odległość nacieku nowotworowego od linii cięcia.

Inne czynniki prognostyczne oceniane w prepara-tach barwionych hematoksyliną i eozyną
W badaniu histopatologicznym powinno się również uwzględnić inne prognostyczne cechy, takie jak: inwazję naczyń krwionośnych i limfatycznych oraz nacieki nowo-tworowe wzdłuż naczyń i nerwów.
Jeżeli pacjent przed zabiegiem chirurgicznym był le-czony metodami neoadiuwantowymi, patomorfolog po­winien opisać morfologiczne rezultaty leczenia i określić odpowiedź na leczenie wg kryteriów przedstawionych w tabeli VIII.

3. Czynniki predykcyjne w raku żołądka

3.1. Rak żołądka zaawansowany miejscowo leczony operacyjnie bez chemioradioterapii przedoperacyjnej

Czynniki prognostyczne i predykcyjne dzielą chorych ze względu na konieczność zastosowania lub odstąpienia od leczenia uzupełniającego w postaci adiuwantowej chemioradioterapii. Dlatego też tak ważna jest prawidłowa ocena materiału operacyjnego oraz współpraca z chirurgiem, warunkująca jakość badania histopatologicznego. Kluczowa jest ocena patomorfologiczna operacyjnie usuniętego narządu wraz z guzem, którą przedstawiono powyżej. Kli­nicznie przydatne czynniki prognostyczne i predykcyjne w raku żołądka leczonym operacyjnie przedstawiono w tabeli IX.

3.2. Rak żołądka zaawansowany miejscowo leczony operacyjnie oraz chemioradioterapią przedoperacyjną

W wypadku osób z rakiem żołądka leczonych przed operacją, po chemioradioterapii przedoperacyjnej, wymaga się dodatkowo określenia odpowiedzi terapeutycznej nowotworu na leczenie. Kryteria tej oceny przedstawiono w tabeli X.

3.3. Rak żołądka wymagający adiuwantowej chemioradioterapii

Chorzy z rakiem żołądka kwalifikowani są do radio­chemioterapii na podstawie źle rokujących mikrosko­powych czynników prognostycznych w materiale operacyjnym lub już w momencie rozpoznania jako pacjenci z nieoperacyjnym i nieresekcyjnym nowo­tworem, wymagający leczenia paliatywnego. Należy podkreślić, że na terapię uzupełniającą kierowani są chorzy leczeni chirurgicznie, ale w sposób nieradykalny, z resekcją żołądka typu R1 lub R2, lub gdy nie ma podanych przez patologa marginesów chirurgicznych w raporcie histopatologicznym. Również zbyt mała liczba węzłów chłonnych zweryfikowanych w materiale operacyjnym powoduje traktowanie pacjentów jako leczonych nieradykalnie. Rokowanie wymienionej grupy chorych, mimo stosowania chemioradioterapii, jest jednak nadal niepomyślne, a mediana przeżycia wynosi 11 miesięcy. U części pacjentów z nieresekcyjnym zaawansowanym rakiem żołądka z przerzutami nadzieję budzi terapia celowana trastuzumabem (Herceptin), przeciwciałem monoklonalnym ukierunkowanym na zewnątrzko-mórkową domenę receptora HER2 z klasyczną chemiote­rapią. W badaniu klinicznym III fazy ToGA Trial (2009 ASCO) wykazano wzrost mediany przeżycia chorych do 16 miesięcy.

3.3.1. Ekspresja receptora HER2 w raku żołądka

Receptor HER2 należy do rodziny ludzkiego na­skórkowego czynnika wzrostu. Amplifikacja genu HER2 wiąże się z nadekspresją białka HER2. HER2 jest przezbłonowym receptorem o aktywności kinazy tyrozynowej, zaangażowanym w przewodzenie sygnałów prowadzących do indukcji wzrostu i różnicowania komórek. Trastuzumab ma zdolność do specyficznego wiązania się z domeną IV pozakomórkowej części białka HER2. Poprzez blokowanie receptora, hamuje nadmierną proliferację komórek, które wykazują jego nadeks­presję. Receptor HER2 jest czynnikiem predykcyjnym w odniesieniu do leczenia trastuzumabem raka żołądka. Nadekspresja receptora HER2 stwierdzana jest w 13–23% wszystkich przypadków raka żołądka, w 16–34% raków typu jelitowego wg Laurena i w 24–34% przypadków zmian usytuowanych w połączeniu przełykowo-żołądkowym.
Istotą oceny amplifikacji jest oznaczenie wskaźnika R (ratio), czyli stosunku liczby kopii genu HER2 do liczby centromerów chromosomu 17, na którym gen ten jest po­łożony. Ekspresja immunohistochemiczna białka HER2 (3+) oraz wskaźnik ISH > 2,2 z ekspresją HER2 określoną na 2+ lub 3+ świadczą o obecności amplifikacji genu HER2, która jest czynnikiem predykcyjnym terapii trastuzumabem osób chorych na raka żołądka. Ocena czynników predykcyjnych metodami immunohistochemicznymi i molekularnymi będących podstawą do zastosowania drogiej terapii celowanej wymaga doświadczenia osób wykonujących badania. Bardzo ważna jest także walidacja i kontrola jakości stosowanych metod. Zgodnie z zaleceniami światowymi powinien być prowadzony rejestr zakładów oraz pracowni histopatologicznych dokonujących oceny HER2, walidacja warunków pracy i stosowanych metod badawczych IHC i hybrydyzacji in situ oraz kontrola jakości wykonywanych badań.
Podstawą oceny jakości badania jest standaryzacja procedur badania, która uwzględnia:
A. Przygotowanie materiału tkankowego.
B. Wykonanie badania HER2 metodą immunohistochemiczną i/lub ISH.
C. Ocenę ekspresji immunohistochemicznej HER2 lub badania ISH u chorych na raka żołądka lub połączenia przełykowo-żołądkowego.
D. Walidację i kontrolę jakości badania statusu HER2 metodami IHC i ISH w raku żołądka.
Ad A. Materiał należy utrwalić w 10-procentowej zbuforowanej formalinie (wodny nasycony ok. 35–40-pro­centowy roztwór aldehydu mrówkowego (inaczej formaldehydu) zbuforowany do pH = 7,2) w czasie minimum 8 godz. i maksimum 48 godz.
Ad B. Wykonanie badania immunohistochemicznego wymaga standaryzacji protokołu metody i aparatury (wyposażenie pracowni). Do kolejnych etapów postępowania z materiałem tkankowym należą:
• odwodnienie i prześwietlenie, kolejno w etanolu i ksylenie,
• zatopienie w parafinie w temp. 55–60°C,
• krojenie na skrawki ok. 4 mm,
• położenie skrawków na szkiełkach z właściwościami przylegania (superfrost slides, poly-L-lysine-coated slides),
• suszenie preparatów ze skrawkami przez 12–24 godz. w temperaturze pokojowej lub godzinę w 60°C,
• całkowite odparafinowanie i prześwietlenie w ksylenie w temperaturze pokojowej.
Walidacja metody oceny immunohistochemicznej HER2 wymaga:
A. Użycia komercyjnie dostępnych dwóch zestawów do IHC: Ventana anti-HER-2/neu Rabbit Monoclonal Primary Antibody kit (Ventana/Roche Tissue Diagnostics) i HercepTest (Dako). Inne przeciwciała nie są zalecane.
B. Wiarygodności i powtarzalności metody, na które składa się czas przechowywania ukrojonych preparatów (2–4 tygodnie), oraz uwzględnienia w technice odkrywania antygenu aktywacji endogennej biotyny jako nieswoistego tła reakcji.
C. Wykonania (z zastosowaniem tych samych warunków reakcji) kontroli dodatniej i ujemnej.
Ad C. Ocena statusu receptora HER2 jest domeną patomorfologa. Najpierw należy zastosować metodę immunohistochemiczną. W przypadkach problematycznych w immunohistochemii rekomendowane jest badanie FISH (fluorescence in situ hybridization) i SISH (silver in situ hybridization). Wynik pozytywny potwierdza amplifikacja genu HER2.
Na patomorfologu spoczywa odpowiedzialność za wybór właściwego skrawka tkankowego do badania ekspresji receptora HER2 (lub amplifikacji jego genu). Ze względu na heterogenny charakter odczynu na HER2 w komórkach raka żołądka w przypadku materiałów biopsyjnych zalecane jest testowanie całego dostępnego materiału tkankowego. W przypadku materiałów operacyjnych patomorfolog winien wybrać do badania ekspresji HER2 wycinek tkankowy o najlepszej jakości (pozbawiony artefaktów), zawierający jak najmniejsze ogniska martwicy. W przypadku mieszanego histologicznego utkania guza do badania HER2 należy wybrać skrawki zawierające komponent raka typu jelitowego.
Kryteria oceny receptora HER2 w raku żołądka: Badanie immunohistochemiczne ekspresji HER2 wymaga zastosowania jakościowych i ilościowych akceptowanych standardowych kryteriów oceny reakcji w preparacie. Zaliczają się do nich: lokalizacja reakcji barwnej, liczba komórek z pozytywną reakcją, intensywność reakcji barwnej i powiększenie w mikroskopie świetlnym. W raku żołądka za prawidłową reakcję ekspresji HER2 uznawany jest błonowy odczyn obecny na powierzchni podstawno-bocznej lub bocznej komórki przy braku reakcji od strony światła gruczołów. Zasadnicza różnica w interpretacji badania IHC statusu receptora HER2 w raku żołądka w porównaniu z rakiem piersi polega na określeniu granicznej liczby komórek uznanych za reakcję pozytywną. Kryterium oceny pozytywnej reakcji IHC stanowi grupa co najmniej 5 komórek w biopsji endoskopowej raka żołądka oraz 10% komórek w materia­le operacyjnym usuniętego nowotworu. Należy zaznaczyć, że w raku żołądka amplifikacja genu HER2 nie zawsze koreluje z ekspresją ocenianą immunohistochemicznie. Wymieniane są przypadki, w których nie ma ekspresji HER2 lub jest ona oceniona na HER2 1+ i jednocześnie stwierdza się amplifikację genu HER2. Z kolei w części raków z ekspresją HER2 3+ nie stwierdza się amplifikacji genu. Dlatego też wykonanie oceny amplifikacji genu HER2 w raku żołądka jest kluczowe do podjęcia leczenia. W tabelach XI i XII przedstawiono kryteria oceny barwienia immunohistochemicznego HER2 i amplifikacji genu HER2 wraz z ich interpretacją [10].
Ocena ekspresji receptora HER2 metodą immunohistochemiczną i amplifikacji genu HER2 metodą hybrydyzacji in situ (ISH) jest rekomendowana do stosowania w diagnostyce patomorfologicznej raka żołądka. Zawarta jest w raporcie histopatologicznym wg wytycznych Amerykańskiego Towarzystwa Patologów (College of American Pathologist), co przedstawiono w tabeli XIII [11, 12].
Oceniając status receptora HER2 metodami IHC i ISH, należy zawsze przestrzegać omówionych wyżej standar­dowych kryteriów. Należy jednak być ostrożnym w interpretacji trudnych i dyskusyjnych przypadków z graniczną reakcją IHC, którą stwierdza się w następujących przypadkach:
1. 1+/2+ w barwieniu IHC.
2. Obecność artefaktycznego zabarwienia na brzegu wycinka.
3. Nieswoiste zabarwienie cytoplazmy komórek raka lub tkanki prawidłowej.
4. Heterogenność barwienia HER2 w przypadkach operacyjnych z silną reakcją HER2 przy powiększeniu 2,5×/5× w < 10% komórek lub przy obecności małych ognisk raka IHC 3+.
Ad D. W lipcu 2010 r. międzynarodowy zespół patologów opracował wytyczne dotyczące diagnostyki i leczenia trastuzumabem osób z rakiem żołądka i rakiem połączenia przełykowo-żołądkowego z przerzutami. Wynik HER2 pozytywny jest czynnikiem predykcyjnym w wyborze tej terapii. Za wynik pozytywny uznaje się ekspresję IHC HER2 (3+) lub IHC HER2 (2+) i potwierdzenie amplifikacji genu HER2 metodami hybrydyzacji in situ FISH lub SISH. W tabelach XIV i XV przedstawiono wytyczne dotyczące badania i kontroli jakości oceny IHC ekspresji receptora HER2 wg European Medicines Agency 2010 [13].

4. Podsumowanie

Rak żołądka jest rozpoznawany w Polsce w stadiach zaawansowanych i często są to nieresekcyjne guzy wymagające stosowania chemioradioterapii uzupełniającej. Dlatego też, aby poprawić przeżycie i jakość życia chorych, oczekuje się dalszego pogłębienia współpracy między patomorfologami i gastroenterologami w zakresie wykrywania dobrze rokujących postaci raka wczesnego, między patomorfologami i chirurgami onkologicznymi celem poprawy jakości leczenia i oceny mikroskopowej materiału operacyjnego oraz między patomorfologami, biologami molekularnymi i onkologami klinicznymi przy wyborze metod chemioradioterapii opie­rających się na czynnikach predykcyjnych. Rozdział opracowano na podstawie zaleceń do diagnostyki mających rekomendację Polskiego Towarzystwa Patologów [14] i opierając się na klinicznym konsensusie raka żołądka [15].

Piśmiennictwo

 1. Lauwers GY, Carneiro F, Graham DY, et al. Gastric carcinoma. In: Bosman FT, Carneiro F, Hruban RH, Theise ND (eds). WHO Classification of tumours of the digestive system, 4th ed. IARC, Lyon 2010; 48-58.  
2. Dinis-Ribeiro M, Areia M, de Vries AC, et al. Management of precancerous conditions and lesions in the stomach (MAPS): guideline from the European Society of Gastrointestinal Endoscopy (ESGE), European Society of Helicobacter Study Group (EHSG), European Society of Pathology (ESP), and the Sociedade Portuguesa de Endoscopia Digestiva (SPED). Virchows Arch 2012; 460: 19-46.  
3. Okines A, Verheij M, Allum W, et al. Gastric cancer: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up On behalf of the ESMO Guidelines Working Group. Ann Oncol 2010; 21 Suppl 5: v50-v54.  
4. Fujishiro M. Perspective on the practical indications of endoscopic submucosal dissection of gastrointestinal neoplasms. World J Gastroenterol 2008; 14: 4289-4295.  
5. Akahoshi K, Akahane H. A new breakthrough: ESD using a newly developed grasping type scissor forceps for early gastrointestinal tract neoplasms. World J Gastrointest Endosc 2010; 16: 90-96.  
6. Probst A, Pommer B, Golger D, et al. Endoscopic submucosal dissection in gastric neoplasia – experience from a European center. Endoscopy 2010; 42: 1037-1044.  
7. Japanese Gastric Cancer Association. Japanese classification of gastric carcinoma: 3rd English edition. Gastric Cancer 2011; 14: 101-112.  
8. Sano T, Aiko T. New Japanese classifications and treatment guidelines for gastric cancer: revision concepts and major revised points. Gastric Cancer 2011; 14: 97-100.  
9. Washington K. 7th edition of the AJCC cancer staging manual: stomach. Ann Surg Oncol 2010; 17: 3077-3079.
10. Olszewski WP, Olszewski WT. Rola patomorfologa w doborze terapii ukierunkowanej na receptor czynnika wzrostu naskórka (EGFR) u chorych na nowotwory. Onkol Prakt Klin 2010; 6: 228-235.
11. Hofmann M, Stoss O, Shi D, et al. Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer: results from a validation study. Histopathology 2008; 52: 797-805.
12. Ruschoff J, Dietel M, Baretton G, et al. HER2 diagnostics in gastric cancer – guideline validation and development of standardized immunochistochemical testing. Virchov Arch 2010; 457: 2999-2307.
13. Rüschoff J, Hanna W, Bilous M, et al. HER2 testing in gastric cancer: a practical approach. Mod Pathol 2012; 25: 637-650.
14. Majewski P. Rak żołądka. W: Zalecenia do diagnostyki histopatologicznej nowotworów. Nasierowska-Guttmejer A, Górnicka B (red.). Centrum Onkologii, Oddział Gliwice, Gliwice 2013; 91-98. 15. Kulig J, Wallner G, Drews M, et al. Polish Consensus of treatment of gastric cancer; Update 2013. Pol Przegl Chir 2013; 9: 544-562.