Review paper
An assessment of large bowel bacterial fermentation processes in children bowel diseases

Wstęp
Mikroflorze jelitowej poświęca się coraz więcej badań zarówno eksperymentalnych, jak i klinicznych [1–3]. Obecność w świetle przewodu pokarmowego tak licznej populacji drobnoustrojów o potencjalnym działaniu chorobotwórczym jest wiązana z występowaniem wielu schorzeń układu trawiennego. Procesy fermentacyjne zachodzące w świetle jelita mogą stanowić pierwotny czynnik patogenetyczny lub być konsekwencją innego schorzenia, zwłaszcza zaburzeń motoryki przewodu pokarmowego [4–6]. Najwięcej doniesień w literaturze dotyczy badań nad składem i metabolizmem bakteryjnej flory jelitowej u chorych na nieswoiste zapalenia jelit, zespół jelita drażliwego oraz raka okrężnicy [7–9]. Dynamika fermentacji bakteryjnej zachodzącej w świetle okrężnicy zależy od składu mikroflory jelitowej, ilości i składu resztek pokarmowych oraz czasu pasażu jelitowego. Wszelkie zaburzenia trawienia i wchłaniania prowadzą do nasilenia przemian bakteryjnych, a ich rodzaj zależy od rodzaju bakterii dominujących w okrężnicy [10, 11]. Produktem wspomnianych procesów fermentacyjnych jest wolny wodór. Około 20% tego gazu wydalane jest z wraz z wydychanym powietrzem z płuc i drogą naturalną. Reszta podlega kolejnym przemianom i jest wykorzystywana głównie przez trzy rodzaje bakterii: acetogenne, metanogenne i redukujące siarczany [12, 13]. Przypuszcza się, że te dwa ostatnie rodzaje mają swój udział w etiopatogenezie niektórych schorzeń przewodu pokarmowego. Bakterie redukujące siarkę (SRB – sulphate-reducing bacteria) należą do grupy Desulfovibrio i wykorzystują siarczany jako akceptory elektronowe w procesie oddychania, w efekcie syntetyzując toksyczny siarkowodór [14]. Dotychczas niewielu badaczom udało się stwierdzić podwyższone stężenie tego gazu u chorych na wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC – ulcertive colitis) [15]. Produkcja metanu jest natomiast procesem dominującym, wykorzystującym ok. 75% wodoru i pozwala na pięciokrotną redukcję jego objętości. Metan stwierdza się w wydychanym powietrzu u 50% zdrowych dorosłych, których określa się mianem wydzielaczy metanu lub metanododatnich. Obecność metanu jest wiązana z występowaniem raka odbytnicy u dorosłych. Wśród najczęściej izolowanych gatunków bakterii wytwarzających ten gaz wymienia się Methanobacterium i Methanobrevibacter [16]. Do analizy procesów fermentacyjnych zachodzących w jelicie grubym wykorzystuje się wodorowy test oddechowy (WTO). Jest to badanie proste i łatwe do wykonania, nieobciążające chorego, a przede wszystkim nieinwazyjne. Między innymi dlatego technika ta znalazła powszechne zastosowanie w diagnostyce schorzeń przewodu pokarmowego u dzieci [17, 18].


Cel pracy
Celem pracy była ocena bakteryjnych procesów fermentacyjnych zachodzących w jelicie grubym u dzieci z wybranymi, przewlekłymi schorzeniami przewodu pokarmowego i porównanie tych chorych z grupą kontrolną.
Materiał i metody
W badaniach uczestniczyło 40 dzieci hospitalizowanych w 2006 r. w Klinice Pediatrii, Gastroenterologii i Onkologii Dziecięcej AM w Gdańsku z powodu przewlekłych bólów brzucha, z podejrzeniem zespołu jelita drażliwego, manifestującego się zaparciami lub biegunką i z powodu brudzenia bielizny. Grupę kontrolną stanowiło 20 dzieci hospitalizowanych z innych powodów niż schorzenia przewodu pokarmowego. Na udział w badaniu uzyskano zgodę pacjentów i ich opiekunów. W badanej grupie było 26 chłopców i 34 dziewczęta w wieku od 5,2 do 17,1 lat (średnia wieku 10,1; mediana 10,2). Wszystkich poddano badaniu podmiotowemu, które poszerzono o wypełnienie formularza dotyczącego ewentualnego występowania objawów ze strony przewodu pokarmowego i nawyków żywieniowych, ze szczególnym uwzględnieniem spożycia mleka i jego przetworów. Następnie wszystkim dzieciom wykonano wodorowy test oddechowy po doustnym obciążeniu laktozą. Do testu użyto laktozy (1,75 g/kg masy ciała, maksymalnie 50 g) rozpuszczonej w 250 ml wody. Próbkę powietrza pobierano na czczo, a następnie trzykrotnie w odstępach godzinnych, licząc od momentu wypicia roztworu. Analizę powietrza wydechowego przeprowadzono za pomocą aparatu MicroLyzer SC firmy QuinTron z USA. Specjalny system gwarantował eliminację gazów zawartych w tzw. przestrzeni martwej dróg oddechowych. Za patologiczny wynik testu przyjęto taki, w którym obserwowano przyrost minimum 20 cząsteczek wodoru na milion cząsteczek powietrza (PPM) między maksymalnym odczytem a wartością na czczo. Ponadto sprawdzano, czy w powietrzu znajduje się metan. Za wynik patologiczny testu przyjęto, zgodnie z zaleceniami producenta urządzenia, wykrycie metanu we wszystkich próbkach. Następnie grupie badanych wykonywano wodorowy test oddechowy, po doustnym podaniu 15 ml laktulozy, w celu określenia czasu pasażu jelitowego. Powietrze pobierano na czczo, po 30 minutach i następnie dziesięciokrotnie w 15-minutowych odstępach. Czas pasażu jelitowego ustalano, oceniając minimalny przyrost wodoru lub metanu o 3 PPM w trzech kolejnych próbkach. Interpretację wyników wodorowego testu oddechowego porównywano z oceną kliniczną chorych w ciągu doby po wykonaniu badania. Wszystkich pytano, czy wystąpiły u nich jakiekolwiek objawy kliniczne nietolerancji laktozy lub laktulozy użytej do testu (bóle brzucha, gazy, biegunka). Wszystkim dzieciom dwukrotnie wykonano ogólne badanie kału (przed i po WTO), ze szczególnym uwzględnieniem jego pH i obecności ciał redukujących. Z badania wykluczono dzieci poddawane antybiotykoterapii w ostatnich 6 tygodniach poprzedzających hospitalizację. Analizę statystyczną wyników dokonano z wykorzystaniem programu Statistica. Analiza wariancji ANOWA posłużyła do oceny porównawczej, a za wynik istotny uznano wartość p<0,05.


Wyniki
Analizą objęto 40 dzieci chorych i 20 dzieci z grupy kontrolnej. Na podstawie danych z wywiadu, badania przedmiotowego i wyników badań dodatkowych postawiono ostateczne rozpoznania. W 20 wypadkach rozpoznano zaparcia stolca o charakterze nawykowym, w 10 zespół jelita drażliwego i w pozostałych 10 nieswoiste zapalenie jelit o umiarkowanym stopniu aktywności. Zbiorcze zestawienie danych przedstawiono w tabeli I. Ze względu na niewielką liczbę uczestniczących w badaniu porównywano zbiorczo całą grupę badaną z grupą kontrolną. Analiza statystyczna danych dzieci z zaparciami stolca wykazała znamienną istotnie zależność między wydłużeniem czasu pasażu jelitowego a obecnością metanogenezy. Towarzyszyła ona również wydłużonemu czasowi pasażu jelitowego w grupie dzieci z zespołem jelita drażliwego z przewagą zaparć, ale bez statystycznej znamienności. Tylko u jednego badanego z grupy z rozpoznanym nieswoistym zapaleniem jelit stwierdzono metanogenezę. Natomiast w tej grupie chorych stwierdzano statystyczną istotnie zależność między nieprawidłowym wynikiem wodorowego testu oddechowego a wystąpieniem objawów klinicznych po jego wykonaniu. W grupie kontrolnej występowanie metanogenezy stwierdzono u 5 (25%) chorych, a wykonaniu wodorowego testu oddechowego nie towarzyszyły żadne objawy niepożądane.

Omówienie
Jelito grube skolonizowane jest przez wiele szczepów bakterii. Rutynowe badanie mikrobiologiczne pozwala na identyfikację zaledwie 30% z nich. Pozostałe są niesklasyfikowane, nawet u ludzi zdrowych. By dokładniej ocenić mikroflorę jelitową, wykorzystuje się coraz nowocześniejsze techniki laboratoryjne, chociażby PCR, cytometrię przepływową czy analizę DNA i rybosomów [19, 20]. Niezbędny jest do tego specjalistyczny sprzęt, a co za tym idzie, kosztowne inwestycje. Dlatego technika wodorowego testu oddechowego, wsparta wywiadem lekarskim, oceną kliniczną badanych po wykonaniu testu i badaniem ogólnym kału (pH, ciała redukujące), wydaje się wystarczająca do analizy procesów fermentacyjnych zachodzących w jelicie. Wiemy, że rodzaje bakterii zasiedlających przewód pokarmowy i ich wzajemne korelacje mogą odpowiadać za wystąpienie stanów zapalnych. Nadal nie wiadomo, czy zmiany składu mikroflory jelitowej powodują wystąpienie nieswoistego stanu zapalnego czy dochodzi do niej jako do zjawiska wtórnego w przebiegu tego zapalenia [21]. Dane z literatury dowodzą, że czynniki środowiskowe i predyspozycje genetyczne gospodarza wpływają na jego relacje z mikroflorą jelitową. Szczegółów tej relacji i tego, który z czynników odgrywa rolę inicjującą, nie udało się jeszcze poznać [22, 23]. Wstępne dane przemawiają za tym, że mikroflora jelitowa odgrywa rolę w procesach inicjacji i utrzymywaniu procesu zapalnego w jelicie [24]. Na podstawie wyników naszej pracy można z dużym prawdopodobieństwem wypowiadać się na temat dominującego szlaku metabolicznego w okrężnicy. Nasze wyniki dotyczące częstości występowania bakteryjnej metanogenezy i czasu pasażu jelitowego są zgodne z innymi doniesieniami. Wydaje się, że występowanie metanogenezy jest sprzężone z wydłużeniem czasu pasażu. Obserwowaliśmy to zarówno u dzieci z zaparciem stolca, jak i w grupie z zespołem jelita drażliwego z dominacją zaparć. Drugim ciekawym spostrzeżeniem jest to, że prawie nie występuje wspomniana metanogeneza u dzieci ze skróconym czasem pasażu jelitowego, co obserwowaliśmy u dwóch pacjentów z postacią biegunkową zespołu jelita drażliwego oraz u dziewczynki z nieswoistym zapaleniem jelit o niewielkim stopniu aktywności. W tej grupie obserwowano trudny do interpretacji przebieg wodorowego testu oddechowego. Polegał on na znacznym wzroście stężenia cząsteczek wodoru w wydychanym powietrzu w pierwszej i/lub drugiej godzinie po spożyciu laktozy. Później następowała jego szybka normalizacja. U dzieci tych w ciągu 24 godzin od wykonania WTO wystąpiło wiele niezależnych od stopnia aktywności zapalenia jelit objawów klinicznych: złe samopoczucie, bóle brzucha, wzdęcia i biegunka. Wynika to najprawdopodobniej z szybkiego namnożenia bakterii redukujących siarczany, spowodowanego dużą podażą wodoru [18]. Bakterie te mają bowiem największe powinowactwo do wodoru i w wypadku jego nadmiaru mogą szybko zdominować mikroflorę jelitową. Jak wspomniano wcześniej, ich obecność sprzyja nasileniu procesu zapalnego. Dlatego należy szczególnie rozważyć wykonanie wodorowego testu oddechowego u chorych na nieswoiste zapalenia jelit, zwłaszcza o umiarkowanym i ciężkim stopniu aktywności. Uzasadnione wydaje się poprzedzenie go badaniem ogólnym kału w celu ewentualnego wykrycia zaburzeń trawienia węglowodanów. Dokładne poznanie opisanych relacji zachodzących w jelicie grubym wymaga dalszych badań na większych grupach chorych. Zasadnym wydaje się również poszerzenie panelu badań o analizę składu chemicznego kału, ze szczególnym uwzględnieniem obecności związków siarki.


Wnioski
Na podstawie przeprowadzonych badań można wnioskować, że: • metanogeneza jelitowa stwierdzana metodą wodorowego testu oddechowego może sugerować wydłużenie czasu pasażu jelitowego, • wykonanie wodorowego testu oddechowego u dzieci chorych na nieswoiste zapalenia jelit może być pomocne w poszukiwaniu czynnika etiopatogenetycznego pierwotnie lub wtórnie wpływającego na przebieg tego schorzenia, • podając laktozę dzieciom z nieswoistym zapaleniem jelit, należy zachować szczególną ostrożność ze względu na możliwe nasilenie biegunki.
Piśmiennictwo
1. Guarner F. Enteric flora in health and disease. Digestion 2006; 73 S1: 5-12. 2. Christl SU, Gibson GR, Cummings JH. Role of dietary sulphate in the regulation of methanogenesis in the human large intestine. Gut 1992; 33: 1234-8. 3. Yang SC, Chen JY, Shang HF i wsp. Effect of synbiotics on intestinal microflora and digestive enzyme activities in rats. World J Gastroenterol 2005; 11: 7413-7. 4. Christl SU, Murgatroyd PR, Gibson GR i wsp. Production, metabolism, and excretion of hydrogen in the large intestine. Gastroenterology 1992; 102: 1269-77. 5. Fiedorek SC, Pumphrey CL, Casteel HB. Breath methane production in children with constipation and encopresis. J Pediatr Gastroenterol Nutr 1990; 10: 473-7. 6. Soares AC, Lederman HM, Fagundes-Neto U i wsp. Breath methane associated with slow colonic transit time in children with chronic constipation. J Clin Gastroenterol 2005; 39: 512-5. 7. Pimentel M, Mayer AG, Park S i wsp. Methane production during lactulose breath test is associated with gastrointestinal disease presentation. Dig Dis Sci 2003; 48: 86-92. 8. Levine J, Ellis CJ, Furne JK i wsp. Fecal hydrogen sulfide production in ulcerative colitis. Am J Gastroenterol 1998; 93: 83-7 9. McGarr SE, Ridlon JM, Hylemon PB. Diet, anaerobic bacterial metabolism, and colon cancer: a review of the literature. J Clin Gastroenterol 2005; 39: 98-109. 10. Montes RG, Saavedra JM, Perman JA. Relationship between methane production and breath hydrogen excretion in lactose-malabsorbing individuals. Dig Dis Sci 1993; 38: 445-8. 11. Strocchi A, Furne JK, Ellis CJ i wsp.Competition for hydrogen by human faecal bacteria: evidence for the predominance of methane producing bacteria. Gut 1991; 32: 1498-501 12. Peyrin-Biroulet L, Bigard MA. Digestive gas, EMC-Hépato- -Gastroentérologie 2005; 2: 370-87. 13. Kamińska B, Landowski P, Szarszewski A i wsp. Udział beztlenowej flory bakteryjnej w patogenezie wrzodziejącego zapalenia jelita grubego. Przegl Pediat 2002; 32: 275-9. 14. Roediger WE, Moore J, Babidge W. Colonic Sulfide in Pathogenesis and Treatment of Ulcerative Colitis. Dig Dis Sci 1997; 42: 1571-9. 15. Jorgensen J, Mortensen PB. Hydrogen sulfide and colonic epithelial metabolism: Implications for ulcerative colitis. Dig Dis Sci 2001; 46: 1722-6. 16. Perman JA Methane and colorectal cancer. Gastroenterology 1984; 87: 728-30. 17. Veligati LN, Treem WR, Sullivan B i wsp. Delta 10 ppm versus delta 20 ppm: a reappraisal of diagnostic criteria for breath hydrogen testing in children. Am J Gastroenterol 1994; 89: 758-61. 18. Di Stefano M, Missanelli A, Miceli E i wsp Hydrogen breath test in the diagnosis of lactose malabsorption: accuracy of new versus conventional criteria. J Lab Clin Med 2004; 144: 313-8. 19. Andus T, Gross V. Etiology and pathophysiology of inflammatory bowel disease-environmental factors. Hepatogastroenterology 2000; 47: 29-43. 20. Cummings JH, Macfarlane GT, Macfarlane S. Intestinal bacteria and ulcerative colitis. Curr Issues Intest Microbiol 2003; 4: 9-20. 21. Marteau P, Lepage P, Mangin I i wsp. Gut flora and inflammatory bowel disease. Alimentary Pharmacology & Therapeutics 2004; 20: 4-18. 22. Hendrickson BA, Gokhale R, Cho JH. Clinical Aspects and Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease. Clinical Microbiology 2002; 15: 79-94. 23. Kamińska B, Landowski P, Korzon M, i wsp. Zależność pomiędzy składem beztlenowej flory bakteryjnej jelita grubego a stopniem aktywności nieswoistych zapaleń jelit u dzieci. Pediatria Współczesna 2003; 5: 113-9. 24. Blumberg RS, Strober W. Prospects for research in inflammatory bowel disease. JAMA 2001; 285: 643-7.