Review paper
Antinuclear antibodies in systemic sclerosis – antigen specificity and clinical significance

Wstęp
Twardzina układowa należy do układowych chorób tkanki łącznej, które cechuje przewlekły proces zapalny o podłożu autoimmunologicznym. Charakteryzuje się ona uogólnionym zwłóknieniem skóry oraz narządów wewnętrznych, co jest efektem m.in. nadmiernej syntezy i dojrzewania kolagenu. Wyodrębniono 2 postacie twardziny – postać ograniczoną oraz układową. W przebiegu twardziny układowej stwierdza się różnego rodzaju zaburzenia odpowiedzi immunologicznej, zarówno typu komórkowego, jak i humoralnego. Ich przejawem jest m.in. obecność przeciwciał przeciwjądrowych (ANA) w surowicy krwi i płynach ustrojowych [1]. Chociaż mechanizmy indukcji ANA nie są do końca w pełni poznane, zjawisko autoimmunizacji jest uważane za czynnik biorący istotny udział w etiologii i patogenezie twardziny układowej. Wynika to z faktu, że ANA nieomal zawsze (w ponad 95%) stwierdza się u chorych na twardzinę układową, oraz że obserwuje się swoiste dla choroby autoprzeciwciała, których nie stwierdza się w zdrowej populacji. Przeciwciała przeciwjądrowe występują u 85–97% chorych na twardzinę układową, wykazują jednak niską swoistość. Reagują głównie z antygenami jąderka (tab. I). W przeciwieństwie do tocznia układowego oraz innych układowych chorób tkanki łącznej, ANA są skierowane przeciwko jednemu antygenowi. W metodzie immunofluorescencji pośredniej ANA powodują jąderkowy (ryc. 1.), plamisty (ryc. 2.) lub centromerowy (ryc. 3.) typ fluorescencji. W zależności od swoistości antygenowej ANA mogą dawać różne typy fluorescencji (tab. II). ANA u chorych na twardzinę układową występują zwykle w wysokim mianie, są głównie klasy IgG i IgM. Znaczenie kliniczne jest uzależnione od swoistości antygenowej tych autoprzeciwciał.
Charakterystyka antygenowa wybranych autoprzeciwciał Kinetochor
Kinetochor jest trójlaminarną strukturą białkową, znajdującą się na centromerowym odcinku każdej chromatyny. Jest zbudowany z trzech płytek, z których najbardziej zewnętrzna składa się z luźnej sieci włókien i filamentów. Do kinetochorów przyczepiają się mikrotubule wrzeciona podziałowego. Kontroluje on segregację chromatyd podczas mitozy, jest rejonem zapoczątkowania polimeryzacji i depolimeryzacji mikrotubul.
Struktura antygenu
Głównym antygenem są 4 białka kinetochorów znajdujących się w obrębie centromerów, szczególnie w CENP-B (80 kD) oraz z CENP-A (17 kD), CENP-C (140 kD) i CENP-D. Wszystkie przeciwciała, określane mianem przeciwciał przeciwcentromerowych, reagują głównie z CENP-B.
Metody badania
W metodzie immunofluorescencji pośredniej przeciwciała te powodują centromerowy typ fluorescencji (ryc. 3.), który charakteryzuje się obecnością małych, jednakowej wielkości ziarnistości (zwykle powyżej 50) równomiernie rozłożonych w jądrze komórkowym.
Znaczenie kliniczne
Przeciwciała przeciwcentromerowe (kinetochor) występują u 22–36% chorych na twardzinę układową. Ich obecność koreluje z objawem Raynauda. Tego typu przeciwciała stwierdza się u 90% chorych z postacią ograniczoną twardziny układowej. Wykazano także, że ich występowanie koreluje ze wzrostem ryzyka choroby nowotworowej [2]. Przeciwciała te stwierdza się u chorych na zapalenie tarczycy typu Hashimoto, któremu towarzyszył objaw Raynauda [3] oraz u chorych z twardziną układową i z pierwotną żółciową marskością wątroby [4], a także u chorych na reumatoidalne zapalenie stawów. Większość autorów uważa, że przeciwciała przeciwcentromerowe są swoiste dla twardziny ograniczonej.
Topoizomeraza I (Scl-70) Struktura antygenu
Przeciwciała reagują z regionem katalitycznym DNA topoizomerazy I, który bierze udział w przecinaniu superheliksy w czasie procesu transkrypcji lub replikacji DNA. Enzym ten jest białkiem 100 kD, choć początkowo uważano, że jego masa cząsteczkowa wynosi 70 kD.
Metody badania
W metodzie immunofluorescencji pośredniej przeciwciała te powodują gruboziarnisty typ fluorescencji jąderek. Do ich oceny wykorzystuje się również metodę immunodyfuzji, immunoblottingu oraz ELISA [5].
Znaczenie kliniczne
Przeciwciała przeciw topoizomerazie I występują u 22–40% chorych na twardzinę. Są one wykładnikiem rozległych zmian skórnych oraz zajęcia bliższych części powłok ciała [6]. Wykazano, że u osób, które mają te przeciwciała, przebieg choroby jest długi i charakteryzuje się włóknieniem płuc oraz zajęciem serca [7]. Stwierdzenie przeciwciał jest często związane z występowaniem choroby nowotworowej. Przeciwciała te, wspólnie z przeciwciałami przeciw centromerom, służą do zróżnicowania twardziny układowej i ograniczonej. Około 40% chorych na twardzinę układową nie ma przeciwciał przeciw Scl-70 [8], a mniej niż 1% chorych może mieć przeciwciała przeciw centromerom i Scl-70. Ostatecznie jednak zarówno przeciwciała przeciw centromerom, jak i Scl-70 można stwierdzić także u chorych na inne układowe choroby tkanki łącznej.
Topoizomeraza II DNA
Jest to enzym, uczestniczący w formowaniu szkieletu chromosomowego oraz macierzy jądrowej, utrzymujących pętle chromatynowe. Enzym ten wykazuje powinowactwo do regionów DNA, określanych jako SAR i MAR. Topoizomeraza II jest uznawana za znacznik proliferacji. Jest także substratem kaspaz i uczestniczy we wstępnej fragmentacji DNA do odcinków wielkocząsteczkowych (HMW), wiąże się z chromatyną w odstępach ok. 300 tys. par zasad w procesie apoptozy.
Struktura antygenu
Wspólnie z topoizomerazą II zidentyfikowano białko SC1, należące do wielkocząsteczkowych białek szkieletu chromosomowego.
Metody badania
Przeciwciała reagujące z topoizomerazą II są oceniane przy użyciu metody ELISA. Nie zidentyfikowano typu fluorescencji, jaką wywołują te przeciwciała w metodzie immunofluorescencji pośredniej. Znaczenie kliniczne Przeciwciała przeciw topoizomerazie II obserwowane są u 22% chorych na twardzinę układową, szczególnie u tych z nadciśnieniem tętniczym [9].
Wa (NEFA/Nukleobindyna 2)
Przeciwciała przeciw Wa reagują z nukleobindyną 2, białka wiążącego jony wapnia, biorącego udział w apoptozie, utrzymaniu homeostazy wapniowej komórki oraz czynności aparatu Golgiego.
Metody badania
Do oceny przeciwciał reagujących z antygenem Wa wykorzystuje się jedynie metodę ELISA. Tego typu przeciwciała nie powodują fluorescencji jądra ani jąderka komórkowego, w klasycznej metodzie immunofluorescencji pośredniej nie wykazuje się zatem obecności ANA.
Znaczenie kliniczne
Przeciwciała przeciw Wa występują u 33% chorych na twardzinę układową. Wykazano je u nielicznych chorych na toczeń układowy, z zespołem nakładania, zapaleniem wielomięśniowym i skórno-mięśniowym oraz u chorych na reumatoidalne zapalenie stawów z cechami hipogammaglobulinemii i obniżenia stężenia składowych dopełniacza [10].
RNA polimerazy
Przeciwciała reagują z RNA polimerazami komórek eukariotycznych, które zawierają 3 klasy enzymów. RNA polimeraza I bierze udział w syntezie prekursorów rRNA w jąderku komórkowym. RNA polimeraza II bierze udział w transkrypcji genów niektórych małych RNA, RNA polimeraza III syntetyzuje niektóre małe jądrowe RNA oraz 5S rRNA i tRNA.
Struktura antygenu
Polimerazy RNA składają się z 2 wielkocząsteczkowych polipeptydów oraz z końcowych 6 mniejszych podjednostek. RNA polimeraza I składa się z ok. 13 podjednostek białkowych. Determinanta antygenowa znajduje się w białku o masie cząsteczkowej 210 kD.
Metody badania
W metodzie immunofluorescencji pośredniej przeciwciała przeciw RNA polimerazie powodują punktową fluorescencję jąderek w komórkach w okresie spoczynku, a w metafazie fluorescencję punktową w miejscach kondensacji chromatyny. Ocenia się je także z wykorzystaniem metody immunoprecypitacji oraz immunoblottingu.
Znaczenie kliniczne
Przeciwciała przeciw RNA polimerazie występują u 4–23% chorych na twardzinę układową, ich obecność jest związana z uogólnionym stwardnieniem skóry [11]. Spośród przeciwciał reagujących z RNA polimerazami, najbardziej swoiste dla twardziny układowej są przeciwciała reagujące z RNA polimerazą I i III. Te ostatnie są uważane za wykładnik serologiczny przełomu nerkowego u chorych na twardzinę układową [12].
Fibrylaryna (U3snoRNP)
Nazwa pochodzi od powiązania białka z fibrylarnymi strukturami jąderka. Białko to znajduje się w ciałkach zwiniętych jądra komórkowego i uczestniczy w dojrzewaniu prekursorowego rRNA [13].
Struktura antygenu
Antygenem jest białko34 kD, bogate w NG, NG-dwumetyloargininę, będące składową U3 małych jąderkowych rybonukleoprotein (snRNP).
Metody badania
W metodzie immunofluorescencji pośredniej przeciwciała przeciw fibrylarynie powodują bryłowaty typ fluorescencji jąderek. Często współwystępują razem z przeciwciałami przeciw Scl-70 oraz przeciwcentromerowymi. Można je także wykazać przy użyciu metody immunoblottingu oraz immunoprecypitacji.
Znaczenie kliniczne
Przeciwciała reagujące z fibrylaryną występują u 8–10% chorych na twardzinę. U 90% chorych mających te autoprzeciwciała stwierdza się zajęcie serca oraz płuc. Przyjmuje się, że ich występowanie jest związane z układową postacią twardziny, charakteryzującą się zajęciem narządów miąższowych [14]. Wykazano ich istnienie również u chorych na postać ograniczoną twardziny [15], jednak nie obserwowano żadnej korelacji klinicznej ani laboratoryjnej.
Th snRNP (RNaza MRP, 7-2 RNA)
Przeciwciała te reagują z Th snRNP, znajdującą się głównie w jądrze komórkowym, która bierze udział w tworzeniu prekursorów tRNA, replikacji mitochondrialnego DNA oraz biogenezie rybosomów [16].
Struktura antygenu
Antygenem jest 40 kD białko, wchodzące w skład kompleksu Th snRNP.
Metody badania
W metodzie immunofluorescencji pośredniej przeciwciała te powodują homogenny typ fluorescencji jąderek.
Znaczenie kliniczne
Przeciwciała przeciw Th występują u 4–10% chorych na twardzinę układową. Stwierdzono, że u osób mających tego typu przeciwciała częściej obserwuje się cechy twardziny ograniczonej, obrzęki palców, zajęcie jelita cienkiego, niedoczynność tarczycy oraz zapalenie stawów lub ich bóle [17].
PM-Scl
Struktura antygenu Przeciwciała reagują zwykle z kompleksem 11–16 białek jąderkowych o masie cząsteczkowej 100 kD, 70 kD, 75 kD i 37 kD, wykazujących właściwości 3’- do 5’-eksorybonukleazy i biorących udział w tworzeniu i degradacji rybosomalnego RNA [18].
Metody badania
W metodzie immunofluorescencji pośredniej przeciwciała te powodują homogenny typ fluorescencji jąderek.
Znaczenie kliniczne
Tego typu przeciwciała stwierdza się u 3% chorych na twardzinę układową. Zwykle występują one u osób z twardziną układową z towarzyszącymi zmianami w obrębie ścięgien i zajęciem nerek [19]. Około 50% chorych z zespołem nakładania twardziny i zapalenia wielomięśniowego ma te przeciwciała.
NOR90 (hUBF) Struktura antygenu
Wykazano, że antygenem jest ludzki jąderkowy czynnik transkrypcji wiążący się powyżej startu (hUBF), który występuje w dwóch postaciach, tj. cząsteczki 97 kD i 94 kD.
Metody badania
W metodzie immunofluorescencji pośredniej przeciwciała przeciw NOR90 powodują fluorescencję jednego lub kilku małych punktów w jąderkach komórek, będących w metafazie.
Znaczenie kliniczne
Uważa się, że przeciwciała przeciw NOR90 występują głównie u chorych na twardzinę układową, jednak w nielicznych przypadkach można je stwierdzić u osób chorych na toczeń układowy czy reumatoidalne zapalenie stawów, a także na choroby nowotworowe [20].
Inne przeciwciała
Spośród przeciwciał stwierdzanych u chorych na twardzinę układową należy wymienić przeciwciała przeciwhistonowe, przeciwciała reagujące z anhydrazą węglową, przeciw HMG [21], przeciw hsp 90, przeciw ku [16], przeciw Ro, przeciw tRNA, przeciw su. Opisano także przeciwciała przeciw Sp1 – aktywatorowi transkrypcji RNAPII. Wykazano, że przeciwciała te korelują z występowaniem objawu Raynauda [22]. Goldblatt i wsp. stwierdzili przeciwciała blokujące receptory muskarynowe M3, wykazując, że ich obecność może prowadzić do zaburzeń czynności przewodu pokarmowego u chorych na twardzinę układową [23]. Natomiast Lee i wsp. u chorych na twardzinę układową wykazali przeciwciała reagujące z białkiem B, wiążącym DNA (dbpB), uważając je za marker serologiczny o znaczeniu prognostycznym [24]. Obserwowano także przeciwciała reagujące z aneksyną V oraz ich związek ze zmianami niedokrwiennymi w obrębie palców [25]. U chorych na twardzinę układową stwierdza się również przeciwciała ANCA [26]. Uważa się jednak, że ich obecność jest raczej wynikiem działania leków lub zapalenia naczyń, a nie samej choroby. Ostatnio opisano również przeciwciała reagujące z epitopem znajdującym się w obrębie ciałka pośredniego (midbody antibodies), których występowanie jest związane z postacią ograniczoną twardziny [27].
Aspekty praktyczne
W praktyce klinicznej, aby rozpoznać twardzinę układową, wykorzystuje się miano i rodzaj fluorescencji jądra komórkowego. Miano ANA jest zwykle powyżej 1/160, natomiast typy fluorescencji są na tyle swoiste, że umożliwiają ustalenie prawidłowego rozpoznania. Szczególnie przydatny jest typ jąderkowy – charakterystyczny dla twardziny układowej, oraz centromerowy – występujący u osób z zespołem CREST. W wypadku, gdy objawy kliniczne sugerują rozpoznanie twardziny układowej, a w metodzie immunofluorescencji pośredniej stwierdza się ANA o plamistym typie fluorescencji, należy ocenić swoistość antygenową autoprzeciwciał. Do tego celu służy metoda ELISA i określenie za jej pomocą występowania przeciwciał reagujących z topoizomerazą I (Scl-70). W praktyce klinicznej istotne jest także różnicowanie układowej i ograniczonej postaci twardziny. Występowanie ANA, rodzaj fluorescencji oraz określenie swoistości antygenowej umożliwia odpowiednie rozpoznanie (tab. III).
Piśmiennictwo
1. Tan EN. Antinuclear antibodies: Diagnostic markers for autoimmune diseases and probes for cell biology. Adv Immunol 1989; 44: 93-8. 2. Higuchi M Horiuchi T, Ishibashi N, et al. Anticentromere antibody as a risk factor for cancer in patients with systemic sclerosis. Clin Rheumatol 2000; 19: 123-7. 3. Weiner ES, Earnshow WC, Senecal JL, et al. Clinical associations of anticentromere antibodies and antibodies to topoisomerase I. A study of 355 patients. Arthritis Rheum 1988; 31: 378-85. 4. Akimoto S, Ishikawa O, Takagi H, et al. Immunological features of patients with primary biliary cirrhosis (PBC) overlapping systemic sclerosis: a comparision with patients with PBC alone. J Gastrenterol Hepatol 1998; 13: 897-901. 5. Hildebrandt S, Weiner ES, Senecal JL, et al. Autoantibodies to topoisomerase I (Scl-70): analysis by gel diffusion, immunoblot, and enzyme-linked immunosorbent assay. Clin Immunol Immunopathol 1990; 57: 399-410. 6. Steen VD, Powell DL, Medsger TA Jr. Clinical correlation and prognosis based on serum autoantibodies in patients with systemic sclerosis Arthritis Rheum 1988; 31: 196-203. 7. Murata I, Takenaka K, Shinohara S, et al. Diversity of myocardial involvement in systemic sclerosis: an 8-year study of 95 Japanese patients. Am Heart J 1998; 135: 960-9. 8. Spencer-Green G, Alter D, Welech HG. Test performance in systemic sclerosis: anti-centromere and anti-Scl-70 antibodies. Am J Med 1997; 103: 242-8. 9. Grigolo B, Mazzetti I, Meliconi R, et al. Anti-topoisomerase II alpha autoantibodies in systemic sclerosis – association with pulmonary hypertension and HLA-B35. Clin Exp Immunol 2000; 121: 539-42. 10. Yamauchi Y, Nojima T, Shirai Y, et al. Molecular cloning of the Wa autoantigen and clinical features of anti-Wa autoantibodies (abstract). Arthritis Rheum 2002; 46: S130. 11. Kuwana M, Kaburaki J, Mimori T, et al. Autoantibody reactive with three classes of RNA polymerases in sera from patients with systemic sclerosis. J Clin Invest 1993; 91: 1399-403. 12. Phan TG, Cass A, Gillin A, et al. Anti-RNA polymerase III antibodies in the diagnosis of scleroderma renal crisis sine scleroderma. J Rheum 1999; 26: 2489-92. 13. Dragon F, Gallagher JE, Compagnone-Post PA, et al. A large nucleolar U3 ribonucleoprotein required for 18S ribosomal RNA biogenesis. Nature 2002; 417: 967-70. 14. Tormey VJ, Bunn CC, Denton CP, et al. Anti-fibrillarin antibodies in systemic sclerosis. Rheumatology (Oxford) 2001; 40: 1157-62. 15. Yimane K, Ihn H, Kubo M, et al. Anti-U3 snRNP antibodies in localised scleroderma. Ann Rheum Dis 2001; 60: 1157-8. 16. Lee B, Craft JE. Molecular structure and function of autoantigens in systemic sclerosis. Int Rev Immunol 1995; 12: 129-44. 17. Yamane K, Ihn H, Kubo M, et al. Antibodies to Th/To ribonucleoproteine in patients with localized scleroderma. Rheumatology 2001; 40: 683-6. 18. Brouwer R, Pruijn GJ, van Venrooij WJ. The human exosome: an autoantigenic complex of exoribonucleases in myositis and scleroderma. Arthritis Res 2001; 3: 102-4. 19. Reimer G, Steen VD, Penning CA, et al. Correlates between autoantibodies to nucleolar antigens and clinical features in patients with systemic sclerosis (scleroderma). Arthritis Rheum 1988; 31: 525-8. 20. Fujii T, Mimori T, Akizuki M. Detection of autoantibodies to nucleolar transcription factor NOR90/hUBF in sera of patients with rheumatic diseases by recombinant autoantigen – base assays. Arthritis Rheum 1996; 39: 1313-7. 21. Ayer LM, Senecal JL, Martin L, et al. Antibodies to high mobility group proteins in systemic sclerosis. J Rheum 1994; 21: 2071-4. 22. Spain TA, Sun R, Gradzka M, et al. The transcriptional activator Sp1, a novel autoantigen. Arthritis Rheum 1997; 40: 1085-8. 23. Goldblatt FG, Gordon TP, Watermann SA. Antibody mediated gastrointestinal dysmobility in scleroderma. Arthritis Rheum 2002; 390: S178. 24. Jeoung DI, Bong Lee E, et al. Autoantibody to DNA binding protein B as a novel serologic marker in systemic sclerosis. Biochem Biophys Res Commun 2002; 299: 549-54. 25. Sigiura K, Muro Y. Anti-annexin V antibodies and digital ischemia in patients with scleroderma. J Rheum 1999; 26: 2168-72. 26. Endo H, Hosono T, Kondo H. Antineutrophil cytoplasmic autoantibodies in 6 patients with renal failure and systemie sclerosis. J Rheum 1994; 21: 864-7. 27. Tausche AK, Conrad K, Seidel W, et al. Anti-midbody antibodies as a possible predictive factor for special limited or abortive form of systemic sclerosis? Ann Rheum Dis 2005; 64: 1237-8.