Review paper
New serologic test in the diagnostics of rheumatic conditions

Wstęp

Hipokrates uważał, że dolegliwości i choroby reumatyczne powstają w wyniku zaburzeń spływu śluzu z mózgu do nosa. Chociaż ta koncepcja rozwoju reumatyzmu nie jest już aktualna, to jednak była pierwszą hipotezą, która zwróciła uwagę na rolę czynników humoralnych w patogenezie chorób reumatycznych. Początek współczesnej serologii i immunodiagnostyki chorób reumatycznych przypada na czasy znacznie późniejsze. Rozwój biochemii pozwolił na poznanie składu białkowego osocza [1]. Z czasem odkryto, że niektóre białka obecne we frakcji globulinowej osocza (przeciwciała) pełnią funkcję ochronną dla ustroju i mają właściwość wiązania obcych cząsteczek – antygenów. W stanach chorobowych mogą pojawiać się jednak nieprawidłowe przeciwciała (autoprzeciwciała), które mają właściwość rozpoznawania własnych antygenów.
Pierwszym autoprzeciwciałem wykrytym u chorych na schorzenie reumatyczne (i równocześnie pierwszym autoprzeciwciałem wykrytym u człowieka) był czynnik reumatoidalny (rheumatoid factor – RF), opisany po raz pierwszy przez Waalera u chorych na reumatoidalne zapalenie stawów (RZS). Chociaż u chorych na RZS opisano występowanie przeciwciał przeciwko wielu autoantygenom, jedynie 3 autoprzeciwciała – RF, przeciwciała przeciw cytrulinowanym białkom/peptydom (anti-cyclic citrullinated peptide – aCCP), przeciwciała przeciw białku wiążącemu immunoglobulinę (BiP) – mają wystarczającą czułość i swoistość, aby mogły być zastosowane dla potrzeb praktycznej immunodiagnostyki RZS, a jedynie dwa pierwsze takie zastosowanie znalazły [2].


Przeciwciała przeciw cyklicznym cytrulinowanym peptydom

Chociaż aCCP weszły do rutynowej diagnostyki reumatologicznej zaledwie kilka lat temu, to historia ich odkrycia i pierwszych zastosowań ma już ponad 40 lat. W 1964 r. Nienhuis i Mandema opisali nowe autoprzeciwciało (nazwane przez nich czynnikiem przeciwokołojądrowym – antiperinuclear factor – APF), wykrywane u chorych na RZS za pomocą techniki immunofluorescencji pośredniej na podstawie charakterystycznego świecenia ziarnistości okołojądowych komórek nabłonka błony śluzowej jamy ustnej [3]. Piętnaście lat później Young i wsp. opisali inne przeciwciała, które w metodzie pośredniej immunofluorescencji były wykrywane na podstawie świecenia zewnętrznych warstw nabłonka przełyku szczurzego [4]. Ponieważ początkowo sądzono, że antygenem dla tych przeciwciał jest keratyna, przeciwciała nazwano antykeratynowymi (antikeratin antibodies – AKA). Dalsze eksperymenty z wykorzystaniem technik adsorpcyjnych i enzymatycznych nie powierdziły postulowanej swoistości przeciwciał – wykazano, że AKA reagują z kilkoma antygenami o masach cząsteczkowych 210 kD, 90–120 kD i 60–130 kD oraz ludzką filagryną nabłonkową (z czasem AKA zaczęto nazywać przeciwciałami antyfilagrynowymi). W 1995 r. Sebbag i wsp. wykazali, że APF i AKA/przeciwciała antyfilagrynowe są w istocie identyczne (ryc. 1.) [5].
Należy podkreślić, że AKA/przeciwciała antyfilagrynowe nie zrobiły wielkiej „kariery” jako rutynowy test w diagnostyce zapaleń stawów.
W dalszych badaniach wykazano, że za wiązanie APF/AKA/przeciwciał antyfilagrynowych odpowiada obecność reszt cytrulinowych w cząsteczkach antygenu. Obserwacja ta dała początek poszukiwaniom nowych testów diagnostycznych opartych na cytrulinowanych białkach lub peptydach, które cechowałaby większa czułość, niski koszt i niewielka pracochłonność, poprawiona powtarzalność wyników i łatwość wykonania w warunkach każdego laboratorium. Zastosowanie syntetycznych cyklicznych peptydów zawierających cytrulinę pozwoliło na optymalizację testów. Obecnie stosowane testy wykorzystują cykliczne peptydy drugiej i trzeciej generacji [6].
W metaanalizie przeprowadzonej przez francuskich badaczy wykazano, że aCCP cechuje wysoka swoistość i czułość dla RZS (odpowiednio >95 i 68%). Zaobserwowano także, że aCCP stosunkowo rzadko występują w przebiegu chorób reumatycznych innych niż RZS, takich jak „reumatyzm palindromiczny”, łuszczycowe zapalenie stawów i toczeń rumieniowaty układowy [7].
Z kolei Rantapaa-Dahlqvist i wsp. oceniali dwie grupy szwedzkich krwiodawców, u których po latach rozwinęło się RZS. Obecność aCCP w surowicach chorych z okresu poprzedzającego rozwój choroby pozwalała na predykcję RZS z czułością sięgającą 52% i swoistością 98%. Dla porównania, czułość wyliczona w tej samej grupie dla oznaczeń RF wynosiła tylko 30% [8, 9]. Niedawno Berglin i wsp. wykazali, że obecność shared epitopes w locus HLA-DRB1 i aCCP w surowicy badanych krwiodawców pozwala na wyselekcjonowanie osób, u których w przyszłości rozwinie się RZS [10].
Johansson i wsp. wykazali związek między polimorfizmem genu PTPN22 w pozycji 1858, obecnością aCCP, czynnikiem reumatoidalnym i obecnością shared epitopes w locus DRB1 (HLA-DRB1 *0404 i *0401) a ryzykiem rozwoju RZS [11]. Wykrycie wariantu PTPN22 1858T i aCCP w surowicy chorych pozwalało na przewidywanie rozwoju RZS ze 100-procentową swoistością. Być może połączenie badań serologicznych i immunogenetycznych pozwoli w przyszłości na „przesunięcie” czasu rozpoznania RZS do bardzo wczesnej objawowej fazy choroby, a nawet rozpoznanie choroby przed wystąpieniem pierwszych uchwytnych objawów zapalenia stawów.

Badania serologiczne w diagnostyce układowych chorób tkanki łącznej

Badania serologiczne, w szczególności wykrywanie przeciwciał przeciwjądrowych, stanowią podstawę immunodiagnostyki układowych chorób tkanki łącznej. Chociaż znane i stosowane od lat najważniejsze techniki badawcze (metoda immunofluorescencji pośredniej, metody immunoenzymatyczne, western blot) są ciągle doskonalone w celu poprawienia powtarzalności, czułości i swoistości oznaczeń, to nadal często zdarzają się znaczne różnice w wynikach oznaczeń wykonywanych w różnych ośrodkach diagnostycznych. Fakt ten wskazuje na pilną potrzebę standaryzacji i walidacji oznaczeń.
Podstawową zasadą immunodiagnostyki układowych chorób tkanki łącznej jest odpowiedni dobór testów diagnostycznych opierający się na następujących przesłankach:
1. Badane autoprzeciwciało jest charakterystyczne/patognomoniczne dla danej jednostki chorobowej lub określonej grupy chorób.
2. Miano autoprzeciwciała odzwierciedla aktywność procesu chorobowego.
3. Obecność autoprzeciwciała koreluje z określonymi objawami klinicznymi i/lub profilem zmian narządowych w przebiegu choroby.
4. Obecność autoprzeciwciała ma znaczenie rokownicze w danej jednostce chorobowej.

We współczesnej immunodiagnostyce wykorzystuje się różne metody oznaczeń, z których najpowszechniej używane to metoda immunofluorescencji pośredniej, metody immunoenzymatyczne (ELISA), technika „colorzyme” (metoda immunoperoksydazowa, połączenie metody immunoenzymatycznej z techniką immunofluorescencji pośredniej), techniki line blot, dot blot i western blot.
Pełna immunodiagnostyka obejmuje zwykle 3–4 etapy [12]:
1. Ustalenie, czy w badanej surowicy znajdują się przeciwciała przeciwjądrowe za pomocą czułych testów przeglądowych (najczęściej wykorzystuje się w tym celu metodę immunofluorescencji pośredniej lub immunoenzymatyczną przy użyciu mieszaniny wysoko oczyszczonych antygenów jądrowych).
2. Ustalenie swoistości autoprzeciwciał w surowicach ANA+ (zwykle za pomocą metody immunoenzymatycznej, immunoperoksydazowej, dot blot lub western blot).
3. Sprawdzenie, czy w badanej surowicy znajdują się przeciwciała przeciw podtypom (fine specificities) poszczególnych autoantygenów (np. U_1-snRNP – 68 kD, A i C, SSA – 60 kD, SSA – 52 kD), których występowanie koreluje z określonym zespołem objawów klinicznych. Niekiedy na tym etapie potrzebne jest także rozszerzenie diagnostyki o wykrywanie przeciwciał przeciw niektórym antygenom cytoplazmatycznym, takim jak rybosomalne białko P, Jo-1 czy białka cytoszkieletu.
4. W kilku procentach przypadków konieczna może być dodatkowa immunodiagnostyka, z wykorzystaniem bardziej złożonych technik, o ile nie udało się ustalić swoistości przeciwciał w surowicach ANA+ za pomocą standardowych procedur diagnostycznych.

W surowicach ANA+ pewną pomocą w ustaleniu swoistości autoprzeciwciał może być ocena typu świecenia jąder komórkowych. Opisane wyżej wieloetapowe procedury są czasochłonne i pracochłonne oraz dość kosztowne, z tego względu poszukuje się dziś nowych metod diagnostycznych, które mogłyby przyspieszyć i zautomatyzować immunodiagnostykę chorób układowych tkanki łącznej. Rozwiązanie tego problemu może przynieść wykorzystanie metod i zasad proteomiki.


Proteomika – przyszłość immunodiagnostyki chorób reumatycznych?

Proteomika jest dziedziną nauki zajmującą się badaniem białek – ich struktury, sprawowanych przez nie funkcji i zależności między nimi. Termin ten jest zwykle używany do określenia badań białek prowadzonych na dużą skalę (analizy całych proteomów). Należy podkreślić, że proteomika jest dziedziną szerszą i bardziej złożoną niż genomika, ponieważ genom zmienia się w stosunkowo małym stopniu w porównaniu z białkami, których skład zmienia się nieustannie wskutek działania czynników wewnątrzpochodnych i środowiskowych.
Liczba genów kodujących białka u człowieka jest znacznie mniejsza niż całkowita liczba białek w ludzkim proteomie (odpowiednio 22 tys. i ok. 400 tys.). Przypuszcza się, że przyczynami tej różnicy są procesy alternatywnego splicingu oraz modyfikacje potranslacyjne. Badanie genomu jest zatem niewystarczające, aby w pełni scharakteryzować różnorodność proteomu [13–18].
W uproszczeniu można powiedzieć, że zastosowanie technik proteomicznych w immunodiagnostyce układowych chorób tkanki łącznej sprowadza się do zastosowania technologii pozwalających na jednoczesne wykonanie oznaczeń autoprzeciwciał przeciwko wielu antygenom pochodzenia jądrowego i cytoplazmatycznego, co pozwala określić pełny profil zaburzeń immunologicznych stwierdzanych u danego chorego w pojedynczym oznaczeniu. Najważniejsze zalety takich metod to:
• możliwość pełnej automatyzacji oznaczeń i zmniejszenia ich pracochłonności,
• skrócenie czasu oczekiwania na wynik,
• poprawa powtarzalności i lepsza kontrola jakości oznaczeń,
• poprawa czułości i swoistości oznaczeń pojedynczych autoprzeciwciał poprzez zastosowanie zestawu alternatywnych antygenów (np. zestawu kilkudziesięciu różnych cyklicznych cytrulinowanych peptydów i cytrulinowanych białek, pozwalającego wykryć różne swoistości przeciwciał antycytrulinowych, obecne w surowicach chorych),
• możliwość jednoczesnego oznaczenia przeciwciał o znaczeniu diagnostycznym, różnicowym, predykcyjnym i prognostycznym, co pozwala na uzyskanie pełnej oceny statusu serologicznego u danego pacjenta,
• możliwość automatycznej analizy za pomocą komputerowych systemów wspomagania diagnozy, co umożliwia uzyskanie danych co do prawdopodobieństwa rozpoznania danej choroby w badanym przypadku,
• jednoczesna ocena czynników, które potencjalnie mogą interferować z wynikami oznaczeń (np. obecność RF),
• łatwość kontrolowania zmian w profilu autoprzeciwciał związanych z rozwojem choroby lub zastosowanym leczeniem,
• możliwość prowadzenia badań przesiewowych w populacjach z podwyższonym ryzykiem autoimmunizacji.
Najczęściej stosowane techniki multipleksowe to:
• liniowe techniki immunoblot – pozwalają na jakościową lub półilościową ocenę od kilku do kilkunastu autoprzeciwciał w jednym oznaczeniu; technika wykorzystuje paski nośnika (zwykle nitrocelulozy), z naniesionymi w określonych miejscach wysoko oczyszczonymi antygenami w postaci cienkich linii; sposób przeprowadzenia inkubacji i interpretacji wyników jest zbliżony do powszechnie znanej techniki western blot;
• cytometria przepływowa – pozwala na wykrywanie od kilkunastu do kilkudziesięciu autoprzeciwciał przy użyciu opłaszczonego nośnika, w postaci kulistych mikrocząstek (microbeads) różnej wielkości;
• mikromacierze – technika pozwala na równoczesne oznaczenie nawet do kilkuset autoprzeciwciał na podstawie naniesionych na fazę stałą antygenów tworzących rodzaj macierzy o określonym położeniu poszczególnych swoistości;
• czipy antygenowe (antigen chip) – technologia podobna do techniki mikromacierzy, która dzięki jeszcze większej miniaturyzacji pozwala na jednoczesne oznaczenie jeszcze większej ilości autoprzeciwciał; czip antygenowy powstaje w wyniku naniesienia za pomocą precyzyjnych robotów znikomych ilości antygenów na odpowiednio przygotowaną szklaną płytkę, dzięki czemu możliwe jest wykrywanie olbrzymiej liczby autoprzeciwciał w znikomej ilości materiału biologicznego (ryc. 2.).

Wydaje się, że rosnąca wiedza na temat autoimmunizacji i konieczność oznaczania stale rosnącej liczby autoprzeciwciał w krótkim czasie u dużej liczby chorych będzie skutkować coraz powszechniejszym stosowaniem technik multipleksowych w rutynowej immunodiagnostyce układowych chorób tkanki łącznej.


Piśmiennictwo

1. Plebani M. Proteomics: the next revolution in laboratory medicine? Clin Chim Acta 2005; 357: 113-122.
2. Nell VP, Machold KP, Stamm TA, et al. Autoantibody profiling as early diagnostic and prognostic tool for rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 2005; 64: 1731-1736.
3. Nienhuis RL, Mandema E. A new serum factor in patients with rheumatoid arthritis; the antiperinuclear factor. Ann Rheum Dis 1964; 23: 302-305.
4. Young BJ, Mallya RK, Leslie RD, et al. Anti-keratin antibodies in rheumatoid arthritis. Br Med J 1979; 2: 97-99.
5. Sebbag M, Simon M, Vincent C, et al. The antiperinuclear factor and the so-called antikeratin antibodies are the same rheumatoid arthritis-specific autoantibodies. J Clin Invest 1995; 95: 2672-2679.
6. Mewar D, Wilson AG. Autoantibodies in rheumatoid arthritis: a review. Biomed Pharmacother 2006; 60: 648-655.
7. Avouac J, Gossec L, Dougados M. Diagnostic and predictive value of anti-cyclic citrullinated protein antibodies in rheumatoid arthritis: a systematic literature review. Ann Rheum Dis 2006; 65: 845-851.
8. Rantapaa-Dahlqvist S, de Jong BA, Berglin E, et al. Antibodies against cyclic citrullinated peptide and IgA rheumatoid factor predict the development of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 2003; 48: 2741-2749.
9. Rantapaa-Dahlqvist S. Diagnostic and prognostic significance of autoanti-bodies in early rheumatoid arthritis. Scand J Rheumatol 2005; 34: 83-96.
10. Berglin E, Padyukov L, Sundin U, et al. A combination of autoantibodies to cyclic citrullinated peptide (CCP) and HLA-DRB1 locus antigens is strongly associated with future onset of rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther 2004; 6: R303-R308.
11. Johansson M, Arlestig L, Hallmans G, et al. PTPN22 polymorphism and anti-cyclic citrullinated peptide antibodies in combination strongly predicts future onset of rheumatoid arthritis and has a specificity of 100% for the disease. Arthritis Res Ther 2006; 8: R19.
12. Ząbek J. Podstawowe zasady racjonalnej serodiagnostyki autoprzeciwciał markerowych w układowych chorobach tkanki łącznej. Reumatologia 2005; 43: 335-340.
13. Binder SR, Hixson C, Glossenger J. Protein arrays and pattern recognition: new tools to assist in the identification and management of autoimmune disease. Autoimmun Rev 2006; 5: 234-241.
14. Binder SR. Autoantibody detection using multiplex technologies. Lupus 2006; 15: 412-421.
15. Hueber W, Kidd BA, Tomooka BH, et al. Antigen microarray profiling of autoantibodies in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 2005; 52: 2645-2655.
16. Quintana FJ, Merbl Y, Sahar E, et al. Antigen-chip technology for accessing global information about the state of the body. Lupus 2006; 15: 428-430.
17. Robinson WH. Antigen arrays for antibody profiling. Curr Opin Chem Biol 2006; 10: 67-72.
18. Wu T, Mohan C. Proteomics on the diagnostic horizon: lessons from rheumatology. Am J Med Sci 2007; 333: 16-25.