Review paper
Purpose of assessment of serum autoantibodies not included in CTD diagnostic criteria

Wprowadzenie

Autoimmunizacja nieswoista narządowo (organ non-specific autoimmunity) jest zjawiskiem powszechnym i typowym dla układowych chorób tkanki łącznej. Przejawia się obecnością w krążeniu autoprzeciwciał oraz autoreaktywnych limfocytów T skierowanych przeciwko różnym antygenom gospodarza (na ogół takim, które są typowymi składnikami wszystkich jąder komórkowych), a które należałoby zbiorczo określić jako antygeny jądrowe, stąd zbiorcza nazwa przeciwciała przeciwjądrowe (ANA – anti-nuclear antibodies) [1–3]. Poza tą główną grupą autoprzeciwciał jest wiele takich, których swoistość jest skierowana przeciwko składnikom cytoplazmy (a nie jądra komórkowego), ale takim, które biorą udział w realizacji procesów sterowanych i zainicjowanych w jądrze komórkowym (np. w procesie translacji, czyli syntezy białka), a które zwyczajowo są też wliczane do przeciwciał ANA [4]. Należy także dla porządku wspomnieć o dużej grupie autoprzeciwciał skierowanych bezpośrednio przeciwko komponentom antygenowym aparatu ruchu, takim jak przeciwciała dla kolagenów, proteoglikanów oraz białek towarzyszących, a wchodzących jako elementy budulcowe w skład różnych typów tkanki łącznej, chrząstek i stawów [5, 6].
Znaczenie praktyczne tych autoprzeciwciał w diagnostyce różnicowej wynika z faktu, że obecność autoprzeciwciał może być patognomoniczna dla danej choroby, miano niektórych autoprzeciwciał odzwierciedla zaś aktywność procesu chorobowego, a obecność danego autoprzeciwciała koreluje z określonymi objawami klinicznymi [7]. Znaczenie tych autoprzeciwciał podnosi także fakt, że uczestniczą one prawdopodobnie bezpośrednio lub pośrednio w patomechanizmach charakterystycznych dla poszczególnych układowych chorób tkanki łącznej, a dyskusja nad ich udziałem w patomechanizmie nie jest zakończona. Są także autorzy, którzy uważają autoprzeciwciała za wtórny fenomen towarzyszący pojawieniu się antygenów sekwestrowanych w krążeniu lub że są one wynikiem mimikry antygenowej antygenów bakteryjnych i gospodarza [8, 9]. Niemniej jednak przynajmniej niektóre z tych autoprzeciwciał mogą bezpośrednio wpływać na ważne procesy fizjologiczne komórki poprzez zahamowanie (inhibicję) enzymów uczestniczących w realizacji tych procesów [4]. Ze względu na stosunkowo małą częstość występowania i/lub występowanie także w innych jednostkach chorobowych (tab. I), tylko kilkanaście z kilkudziesięciu z nich ma zasadnicze znaczenie w diagnostyce różnicowej chorób przebiegających z autoimmunizacją. Są one zaliczone do kryteriów diagnostycznych danych jednostek jako tzw. przeciwciała markerowe [10].
Obok ww. cech autoprzeciwciał szczególnie cenny wydaje się fakt ich wczesnego występowania na etapie, gdy brak jest jeszcze swoistych dla danej jednostki objawów klinicznych – co zwykle określa się jako niezróżnicowaną chorobę tkanki łącznej, a fakt wystąpienia wczesnego określonego przeciwciała markerowego uprawdopodabnia kierunek rozwoju niezróżnicowanej układowej choroby tkanki łącznej w określoną jednostkę. Jeśli nawet pojawienie się takiego wczesnego markera nie jest jeszcze powodem do zmiany kierunku terapii – co dotyczy autoprzeciwciał, które nie są jeszcze zaliczone do kryteriów diagnostycznych (np. przeciwciała anty-CCP) – to w każdym razie jest powodem do częstszej, dokładniejszej i uważniejszej obserwacji danego pacjenta pod kątem ewentualnego wystąpienia w przyszłości pełnoobjawowej choroby tkanki łącznej.
Spośród metod skryningowych najwyższą wartość diagnostyczną ma metoda immunofluorescencji ANA (IF), z zastosowaniem jako substratu komórek Hep-2, oraz jej modyfikacja z zastosowaniem koniugatów antyglobulinowych związanych z peroksydazą chrzanową, zwana metodą Colorzyme. Obie te metody dają kilka typowych obrazów (patterns) świecenia (w metodzie IF) lub wybarwienia (w metodzie Colorzyme), którym przyporządkowane są przeciwciała o określonej swoistości – zwykle, niestety, kilka autoprzeciwciał daje ten sam (lub zbliżony) typ świecenia [11, 12]. Ustalenie swoistości następuje zwykle testem ELISA lub Western-blotting (też DOT-blotting) [13, 14]. Zastosowanie testów o wysokiej czułości do ustalenia swoistości przeciwciał ANA zwiększyło częstość wykrywania przeciwciał markerowych i w konsekwencji wykrywania określonych jednostek chorobowych.
W prawidłowo prowadzonej strategii oznaczania przeciwciał ANA stosowana jest tzw. kaskadowa (4-etapowa) metoda oznaczania autoprzeciwciał. W pierwszym etapie stosuje się testy skryningowe (IIF-ANA-screen czy ANA-ELISA-screen). Następnie (jeśli test ANA jest dodatni) ustala się swoistość przeciwciał ANA (2. etap), a potem (3. etap) swoistości dla podtypów antygenu ANA (fine specificities). Etap 4. jest prowadzony tylko wtedy, gdy nie można wyżej opisanymi metodami opisać żadnej z typowych swoistości autoprzeciwciał i zwykle dokonuje się tego kombinowanymi metodami biochemiczno-immunochemicznymi [15].
Bez względu na to, jaką zastosuje się czułość metody, zawsze można zaobserwować grupę tzw. surowic seronegatywnych pod względem obecności danego markera serologicznego, co może mieć kluczowe znaczenie dla procesu stawiania diagnozy [16]. W tej sytuacji nie pozostaje nic innego, jak skorzystać z tej grupy autoprzeciwciał, niewprowadzonych do kryteriów diagnostycznych, gdyż także one mają określoną owymi kryteriami (częstość występowania, swoistość, wartość prognostyczną czy korelacje z aktywnością choroby i określonymi objawami klinicznymi) wartość i dlatego powinny być określone jako markery pomocnicze. Niektóre zresztą z wyżej opisanych markerów pomocniczych z czasem są włączane do kryteriów diagnostycznych danej jednostki, np. w 2005 r. przeciwciała dla b2-GP-I [17]. Zapewne niedługo stanie się tak z przeciwciałami dla CCP występującymi w RZS [18]. W tab. II przedstawiono listę tych dodatkowych markerów pomocniczych występujących w poszczególnych jednostkach chorobowych [4].


Najważniejsze autoprzeciwciała
pomocnicze niewłączone do kryteriów diagnostycznych układowych chorób tkanki łącznej

W reumatoidalnym zapaleniu stawów występuje wiele autoprzeciwciał [1, 4, 18], ale tylko jedno o ustalonym znaczeniu diagnostycznym, czyli wykryty w 1949 r. przez Waalera i Rose czynnik reumatoidalny (RF) klasy IgM (tzw. klasyczny czynnik RF-IgM), pozostający do dziś głównym serologicznym markerem choroby, zaliczonym do kryteriów diagnostycznych. RF-IgM to przeciwciało markerowe o niewielkiej dynamice poziomów (brak korelacji z intensywnością choroby), mające pewne znaczenie prognostyczne. Niestety, RF-IgM występuje też w większości jednostek chorobowych o etiologii infekcyjnej, co istotnie zmniejsza jego znaczenie diagnostyczne. Ponadto w 25–30% przypadków ewidentnego RZS brak jest RF-IgM, co zresztą stało się powodem do podziału grupy RZS na tzw. RZS seropozytywne i RZS seronegatywne. Zalicza się tu także czynniki RF klasy IgG i IgA – mające w zasadzie, aczkolwiek niesłusznie, znaczenie tylko pomocnicze.


Inne przeciwciała

Pozostałe autoprzeciwciała, tj. przeciwciała przeciwko kolagenowi II, elastynie, antygenowi RA-33 czy wreszcie z grupy przeciwciał antykeratynowych, a z ostatnio wprowadzonych – przeciwciała anty-CCP (przeciwko cyklicznemu cytrulinowanemu peptydowi) [1, 4, 18] wg danych z literatury występują aż w ok. 80% (40–60%) przypadków RZS, w tym – co ważne – w 25–30% przypadków RF-IgM seronegatywnych. Ich obecność w surowicach chorych na RZS ma znaczenie patognomoniczne dla tej jednostki. Występują one ponadto we wczesnych stadiach RZS, a ich poziomy są wskaźnikiem aktywności i wskaźnikiem prognostycznym ciężkości przebiegu choroby [18].
Z niedawno odkrytych należy wymienić przeciwciało anty-Sa, które po raz pierwszy zostało oznaczone u pacjenta o nazwisku Savoie przez Despresa i wsp. [19].
Antygen wykryto w wyciągach białkowych z ludzkiego łożyska oraz śledziony, a ostatnio wykazano jego obecność w łuszczce reumatoidalnej. Ciężar cząsteczkowy antygenu Sa z łożyska wynosi 55 kD, jest on związany z innym białkiem o ciężarze cząsteczkowym
50 kD, które także występuje w śledzionie.
Przeciwciała anty-Sa są wykrywane w surowicach ponad 40% ogółu chorych na RZS, w tym w ok. 30% przypadków wczesnego RZS i w 47% przypadków zaawansowanego RZS. Przeciwciała anty-Sa korelują z RF-IgM, są charakterystyczne dla przypadków przewlekłego RZS, towarzysząc w ok. 66% zmianom destrukcyjnym [20].
Przeciwciała te występują w surowicach ok. 22% dzieci cierpiących na młodzieńcze idiopatyczne zapalenie stawów (MIZS), a także u 7% osób bez objawów RZS. Swoistość anty-Sa jest wysoka – 92–98% [21]. Do tej pory brak jest testów komercyjnych służących do oznaczania przeciwciał anty-Sa.
W toczniu rumieniowatym układowym (SLE) pomimo bogactwa autoprzeciwciał, których jest ponad 20, podobnie jak w RZS jest niewiele pewnych autoprzeciwciał markerowych. Przeciwciała dla antygenu Sm (włączone, obok przeciwciał dla dsDNA, do kryteriów diagnostycznych) występują np. tylko w ok. 15–30% przypadków, a przeciwciała przeciw dsDNA występują przeciętnie w 60–90% przypadków, korelują z aktywnością choroby i są dobrym wskaźnikiem skuteczności leczenia [22].
Jednakże w ok. 25% przypadków SLE brak jest obu tych parametrów [23]; w tej sytuacji bardzo dobrym prognostykiem dla serodiagnostyki SLE jest pojawienie się wielu prac, a co ważniejsze, prawie jednocześnie testów do wykrywania przeciwciał dla nukleosomów (anty-Nucl). Co istotne, jednocześnie pojawiały się odpowiednie komercyjnie dostępne testy ELISA i Western-blott [24].
Przeciwciała anty-Nucl stwierdza się w ok. 60% przypadków, a w twardzinie i PM tylko w 2%. Nie występują one w grupie zdrowych dawców. Ponadto, wg Schlumbergera i wsp. [25], przeciwciała anty-Nucl są patognomoniczne dla SLE, a ich odsetek występowania (ok. 60%) przekracza częstość występowania innych markerów SLE jak anty-Sm (do 30%) i anty-rib RNP (do 15%) i jest porównywalny z przeciwciałami dla dsDNA (60–90%).
Poza przeciwciałami dla nukleosomów pod uwagę należy brać grupę antygenów dających tak częsty w SLE typ homogenno-plamisty ANA, do której zalicza się następujące antygeny: PCNA, Ku, HMG-17 i ubikwitynę. Przeciętne częstości występowania przeciwciał dla tych antygenów wynoszą: 34–70% dla HMG-17, ok. 3% dla PCNA, 1–13% dla antygenu Ku i 20–30% dla ubikwityny. Niestety, poza przeciwciałami dla antygenu PCNA i Ku, które charakteryzują się nieco wyższymi swoistościami dla SLE, przeciwciała te występują także w innych układowych chorobach tkanki łącznej [4, 29]. Z nowych (niepublikowanych) danych wynika, że te autoprzeciwciała są swoistościami, za pomocą których można wyjaśnić znaczną część przypadków SLE ANA-dodatniego, w którym nie udaje się oznaczyć swoistości.
Z grupy przeciwciał antykofaktorowych lub związanych z pulą przeciwciał antyfosfolipidowych (aPL) warto zwrócić uwagę na przeciwciała dla aneksyny V i dla oxy-LDL
ze względu na fakt, że częstość ich występowania w SLE wynosi: dla anty-ANX-V przeciętnie 30%, a dla oxy-LDL 30–40% [26]. Wartość diagnostyczna tych przeciwciał wynika z faktu, że udowodniono ich bezpośredni związek z patomechanizmami (choć dla obu przeciwciał różnymi) występującymi w SLE, SAPS i PAPS.
W związku z tym, że dotychczas nie udowodniono bezpośredniego udziału przeciwciał aPL w patomechanizmie zespołów neuropsychiatrycznych występujących w toczniu, przedmiotem intensywnych badań jest grupa przeciwciał wprowadzanych do serodiagnostyki SLE. Są nimi przeciwciała antyneuronalne, tj. skierowane przeciwko komponentom komórek nerwowych (mielinie – MAG, dekarboksylazie glutaminianowej – GAD, komórkom Purkiniego – Yo, jądrom neuronów – Hu, Ri), ale ich znaczenie dla patomechanizmów występujących w SLE jest jeszcze dalekie od wyjaśnienia [27].
W diagnostyce zespołu Sjögrena wykorzystuje się
2 ważne autoprzeciwciała markerowe: anty-SSA i anty SS-B, których częstość występowania jest stosunkowo duża (ok. 90% przypadków pierwotnego i ok. 60–70% przypadków wtórnego zespołu Sjögrena). Znacznie gorsza jest sytuacja w dziecięcym zespole Sjögrena: w ponad 30% przypadków nie stwierdza się ani przeciwciała anty-SSA, ani anty-SSB, a na dodatek w ok. 75% przypadków brak jest pełnych objawów klinicznych; dlatego ograniczone tych markerów w diagnostyce dziecięcego zespołu Sjögrena jest znaczenie.
Nadzieją w serodiagnostyce zespołu Sjögrena (szczególnie u dzieci) jest przeciwciało dla a-fodryny, stwierdzane w ok. 60% surowic dorosłych i w zbliżonym odsetku surowic dzieci z tym zespołem [28]. Jest to białko o ciężarze cząsteczkowym 240 kD (podjednostka fodryny), wchodzące w skład cytoszkieletu komórek ślinianek. W pierwszych, nielicznych jeszcze pracach sugeruje się, że przeciwciała dla a-fodryny mają także znaczenie prognostyczne, gdyż wyprzedzają zarówno objawy kliniczne, jak i zmiany patomorfologiczne obserwowane w śliniankach.
Szczególnie trudnymi w diagnostyce serologicznej jednostkami z układowych chorób tkanki łącznej są: twardzina układowa (scleroderma), zapalenie wielomięśniowe (polymiositis – PM), czy zespoły nakładania twardziny i zapalenia wielomięśniowego, w których jest szczególnie mało autoprzeciwciał markerowych. W ich przypadku właściwie dysponujemy tylko trzema wartościowymi autoprzeciwciałami markerowymi, tj. przeciwciałami dla antygenu Scl-70 (30% w twardzinie, wysoka swoistość), przeciwciałem dla centromerowego białka B (ok. 30% w twardzinie ograniczonej) oraz przeciwciałami dla aminoacylo-tRNA syntetaz [4]. Przykładowo częstość występowania przeciwciał dla antygenu Jo-I (histydyno-tRNA syntetaza) w zapaleniu wielomięśniowym wynosi ok. 25% [4, 29]. W zapaleniu wielomięśniowym wskazane jest, w przypadku braku przeciwciał dla antygenu Jo-I, oznaczanie przeciwciał dla innych amino-acylo/RNA syntetaz (alanylowej anty-PL-7 czy treonylowej PL-12) [4 oraz dane własne niepublikowane], a także przeciwciał dla antygenu Mi-2, który w PM występuje w ok. 10% przypadków i jest to przeciwciało o stosunkowo wysokiej swoistości dla tej jednostki. Już od dłuższego czasu do oznaczania przeciwciała dla antygenu PM-Scl, które jest wysoce swoiste dla zespołu nakładania PM i DM, a częstość jego występowania wynosi średnio 5–10%, można wykorzystać testy ELISA.
Podsumowując, trzeba stwierdzić, że ciągły postęp w serodiagnostyce autoprzeciwciał oraz antygenów, polegający na wprowadzeniu niezwykle czułych i złożonych technicznie metod, zmusza do szczególnego przestrzegania standardowych warunków oznaczeń oraz rozwinięcia szerokiego programu standaryzacji, obejmującego nie tylko standaryzację metodyki, ale także stosowanych reagentów i surowic wzorcowych.


Piśmiennictwo

1. Systemic Autoimmunity. Bigazzi PE, Reichlin M (red.). Mariel Dekller Inc, NewYork, Basek, Honkong 1991.
2. Organ-specific Autoimmunity. Bigazzi PE, Wick G, Wicher K (red.). Mariel Dekller Inc., New York, Basel, Honkong 1991.
3. Wańkowicz A. Zjawiska autoimmunologiczne. W: Immunologia.. Jakóbisiak M (red.). PWN, Warszawa 1995: 499.
4. von Muhlen CA, Tan EM. Autoantibodies in the diagnosis of systemic rheumatic diseases. Semin Arthritis Rheum 1995; 24: 323-58.
5. Smolen JS. Autoantibodies in rheumatoid arthritis. In: Autoantibody, Manual CI.I., Kluwer Academic Publishers 1996; 1-18.
6. Manual of Biological Markers of Disease. van Venrooij WJ, Maini RN (eds). Kluwer Academic Publishers. Dordrecht, Boston, London 1994.
7. Puszczewicz M. Przeciwciała przeciwjądrowe w diagnostyce różnicowej chorób układowych. Reumatologia 1998; 36: 30-41.
8. Horsfall AC. Molecular mimicry and autoantigens in connective tissue diseases. Mol Biol Rep 1992; 16: 139-47.
9. Ząbek J. Rola antygenów bakteryjnych w indukcji procesów autoimmunizacyjnych związanych z patogenezą reaktywnego zapalenia stawów. Alergia Astma Immunologia 1999; 4: 41.
10. Ząbek J. Metody wykrywania autoprzeciwciał „markerowych” w chorobach z autoimmunizacją. W: Immunologia kliniczna. Kowalski ML (red.). Mediton Oficyna Wydawnicza, Łódź 2000; 787.
11. Fitzler MJ. Immunofluorescent antinuclear antibody tests. Autoimmune Disease. In: Manual of Clinical Laboratory Immunology. Rose NR, Friedman H, Fahey JL (eds). American Society for Microbiology, Washington DC 1986; 733.
12. Reis J. Współczesne metody szybkiej indykacji i immunodiagnostyki rozpuszczalnych antygenów bakteryjnych. Post Mikrobiol 1989; 28: 17.
13. Ząbek J. Wykrywanie autoprzeciwciał występujących w surowicach chorych na układowe choroby tkanki łącznej z zastosowaniem techniki „immunoblotting”, czyli efektroforezy białek w żelu poliakrylamidowym połaczonej z immunodetekcją. W: Metody diagnostyki serologicznej w reumatologii. Luft S (red.). PWN Warszawa 1996; 101.
14. Metody diagnostyki serologicznej w reumatologii. Luft S (red.). PWN, Warszawa 1996.
15. Ząbek J. Podstawowe zasady racjonalnej serodiagnostyki autoprzeciwciał markerowych w układowych chorobach tkanki łącznej. Reumatologia 2005; 43: 335-40.
16. Ząbek J. Przyczyny niepowodzeń w identyfikacji swoistości autoprzeciwciał ANA w surowicach pobranych od pacjentów z układowymi chorobami tkanki łącznej. Reumatologia 2004; 42: 416-26.
17. Zimmermann-Górska I. Kryteria klasyfikacyjne dla zespołu antyfosfolipidowego – kolejna modyfikacja. Pol Arch Med Wewn 2006; 115: 396-400.
18. Meyer O. Evaluating inflammatory joint disease: how and when can autoantibodies help? Joint Bone Spine 2003; 70: 433-47.
19. Despres N, Boire G, Lopez-Longo FJ, et al. The Sa system: a novel antigen-antibody system specific for rheumatoid arthritis. J Rheumatol 1994; 21: 1027-33.
20. Hayem G, Chazerain P, Combe B, et al. Anti-Sa antibody is an accurate diagnostic and prognostic marker in adult rheumatoid arthritis. J Rheumatol 1991; 26: 7-13.
21. Biernacka E, Ząbek J. Celowość oznaczania czynnika reumatoidalnego w zestawieniu z wartością wykrywania innych przeciwciał występujących w reumatoidalnym zapaleniu stawów. Reumatologia 2003; 43: 55-68.
22. Pickering MC, Walport MJ. Links between complement abnormalities and systemic lupus erythematosus. Rheumatology 2000; 39: 133-41.
23. Ząbek J, Palacz A, Musiej-Nowakowska E i wsp. Porównanie wartości diagnostycznej przeciwciał dla nukleosomów z innymi markerami serologicznymi występującymi w toczniu rumieniowatym układowym. Reumatologia 2004; 42: 507-14.
24. Cervera R, Vinas O, Ramos-Casals M, et al. Anti-chromation antibodies in systemic lupus erythematosus: a useful marker for lupus nephropathy. Ann Rheum Dis 2003; 62: 431-4.
25. Schlumberger W, Daehnricg C, Frahm S, et al. Diagnostic relevance of autoantibodies against nucleosomes, 3rd International Congress on Autoimmunity, Genewa, Szwajcaria 2002.
26. Ząbek J, Wojciechowska B, Alekberova Z i wsp. Przeciwciała dla aneksyny V jako nowy wskaźnik ryzyka zakrzepic i poronień w toczniu rumieniowatym układowym (SLE) oraz w zespole antyfosfolipidowym pierwotnym (PAPS) i wtórnym (SAPS). Reumatologia 2003; 41: 12-24.
27. Meyer W, Schneider B, Klotz M, et al. EUROLINE anti-
-ganglioside profile: a New membrane test for detection of antibodies against gangliosides. 5th Dresden Sympodium on Autoantibodies. Dresden, Germany, October 2002.
28. Haneji N, Nakamura T, Takio K, et al. Identification of a-fodrin as a candidate autoantigen in primary Sjõgren’s syndrome. Science 1997; 276: 604-7.
29. van Venrooij WJ. Autoantigens In connective tissue diseases. Immunology of the connective tissue diseases, ed. GS Panayi. Kluwer Academic Publisher. Dordrecht, Boston, London 1994; 22: 305-34.