Rodzinna transmisja Helicobacter pylori z wykorzystaniem typowania molekularnego

Wstęp
Helicobacter pylori występuje powszechnie w populacji ludzkiej na całym świecie zarówno u dorosłych, jak i dzieci, szczególnie często w krajach rozwijających się. Jest pierwotnym czynnikiem etiologicznym przewlekłego zapalenia błony śluzowej żołądka u dzieci, choroby wrzodowej żołądka i dwunastnicy, chłoniaka B-komórkowego typu MALT oraz raka żołądka u dorosłych [1, 2].
Do zakażenia dochodzi na drodze ustno-ustnej, kałowo-ustnej oraz żołądkowo-ustnej [3]. Głównym miejscem występowania H. pylori jest przewód pokarmowy człowieka [2], choć potencjalnym źródłem zakażenia mogą być również zwierzęta, takie jak psy, koty i ptaki. Niektórzy autorzy wymieniają wodę jako rezerwuar bakterii, uważając, że woda może stanowić istotną drogę zakażenia w krajach rozwijających się [3].
Przebycie zakażenia H. pylori w pierwszych latach życia jest zjawiskiem powszechnym. Nie zostało ostatecznie wyjaśnione, czy ściśle wiąże się to z czynnikami środowiskowymi czy z inną niż u osób dorosłych odpowiedzią immunologiczną na zakażenie w wieku dziecię-cym. Kluczową rolę w nabywaniu zakażenia tą bakterią, zwłaszcza we wczesnym dzieciństwie, odgrywa bliski kontakt między członkami rodziny. Jedynie w krajach rozwijających się czynniki środowiskowe mogą mieć większe znaczenie niż wewnątrzrodzinna transmisja H. pylori [1].
W 1990 r. Drumm i wsp. pierwsi opisali rodzinne występowanie zakażenia H. pylori [4]. Znacząco częstsze pojawianie się zakażenia potwierdzono u dzieci obojga zakażonych rodziców niż u dzieci pochodzących z rodzin, w których zakażony był tylko jeden rodzic [5]. Częściej zakażenie obserwowano u dziecka, jeśli zakażona była matka niż ojciec [6, 7]. Wykazano również możliwość horyzontalnej transmisji zakażenia między rodzeństwem, zwłaszcza w przypadku dzielenia łóżka lub sypialni z zakażonym rodzeństwem [8]. Rola transmisji zakażenia między współmałżonkami nie jest znana. Wiarygodnym dowodem na rozprzestrzenianie się zakażenia H. pylori w obrębie rodziny jest identyfikacja i porównanie materiału genetycznego bakterii wyizolowanych od członków rodziny [1].

Cel
Ocena transmisji wewnątrzrodzinnej na podstawie typowania genetycznego szczepów H. pylori izolowanych od członków rodziny.

Materiał i metody
Do badania zakwalifikowano łącznie 55 członków pochodzących z 22 rodzin, u których na podstawie wyniku testu oddechowego z zastosowaniem mocznika znakowanego 13C oraz wyniku badania histopatologicznego bioptatów błony śluzowej części przedodźwiernikowej i/lub trzonu żołądka rozpoznano zapalenie błony śluzowej żołądka związane z zakażeniem H. pylori. Bioptaty błony śluzowej żołądka pobierano przy użyciu szczypczyków biopsyjnych w trakcie badania endoskopowego górnego odcinka przewodu pokarmowego przeprowadzanego w Pracowni Endoskopowej Kliniki Pediatrii, Alergologii i Gastroenterologii lub Zakładzie Endoskopii Gastroenterologicznej Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu.
Izolacji materiału genetycznego bakterii H. pylori z pobranych endoskopowo wycinków błony śluzowej żołądka dokonano w Zakładzie Biotechnologii Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu przy użyciu zestawu NucleoSpin®Tissue (Macherey-Nagel). Obecność DNA bakterii w izolatach potwierdzano poprzez wykonanie rozdziału elektroforetycznego na żelu agarozowym 1%, zawierającym interkalujący w dwuniciowe DNA bromek etydyny. Po przeprowadzeniu rozdziału elektroforetycznego uzyskane dane odczytano przy użyciu transiluminatora UVP M-20 i oprogramowania Launch DocITLS. Po wyizolowaniu genomowego DNA H. pylori materiał badawczy poddano tradycyjnym reakcjom amplifikacji i reakcjom multiplex PCR w termocyklerze firmy Eppendorf. Podczas analizy szczepów H. pylori polimerazowej reakcji łańcuchowej poddano geny: glmM, cagA, cagE i iceA, oraz wykonano reakcje multiplex PCR dla vacA (s1/s2 + m1/m²).

Wyniki
W toku badań rodzinnych zapalenie błony śluzowej żołądka wywołane zakażeniem H. pylori rozpoznano u 55 członków 22 rodzin, w tym u 13 matek, 11 ojców i 30 mieszkającego we wspólnym gospodarstwie rodzinnym potomstwa (tab. I). Wiek rodziców mieścił się w przedziale 31–54 lat (średnia wieku 39,1 roku), a potomstwa 4–26 lat (średnia wieku 11,9 roku).
Zgodność typów genetycznych H. pylori stwierdzono tylko w 18 spośród 44 par osób będących członkami tej samej rodziny (40,9%). Najczęściej (70,6%) zakażenie tym samym typem genetycznym H. pylori wykazano w parach matka–dziecko. Tylko 1 z 7 par małżeńskich była zakażona tym samym typem genetycznym bakterii (14,3%). Podobnie rzadko obserwowano zakażenie tym samym typem H. pylori między ojcem a jego dzieckiem (27,3%), a także wśród rodzeństw (22,2%) (tab. II).
Wśród 11 rodzin z 3 osobami zakażonymi H. pylori tylko w 3 rodzinach wszyscy członkowie rodziny uczestniczący w badaniu (2-krotnie matka i 2 dzieci, w jednym matka–ojciec–syn) byli zakażeni tym samym typem genetycznym bakterii. W grupie 55 zakażonych H. pylori członków rodziny obecność genu cagA stwierdzono u 45 z nich (81,8%), genu cagE – u 13 (23,6%), genu iceA – u 7 (12,7%), genu vacAs – u 17 (30,9%), a genu vasAm – u 7 (12,7%).

Omówienie
Bakteria H. pylori zakaża błonę śluzową żołądka około połowy populacji na świecie, będąc tym samym jedną z najczęstszych infekcji bakteryjnych u człowieka [9]. Rozprzestrzenianie się zakażenia jest nadal przedmiotem wielu badań. Transmisję zakażenia H. pylori między członkami rodziny uważa się obecnie za główną drogę zakażenia tą bakterią, zwłaszcza w krajach rozwiniętych, gdzie przestrzeganie zasad higieny, kształtowanie właściwych nawyków higienicznych oraz poprawa warunków socjoekonomicznych znacząco zmniejszyła częstość zakażeń [1, 9].
W badaniach własnych podjęto próbę oceny wewnątrzrodzinnej transmisji zakażenia H. pylori poprzez typowanie genetyczne szczepów bakteryjnych pochodzących od członków rodzin. Zgodność typów genetycznych bakterii H. pylori, którą było zakażonych 55 osób z 22 rodzin, oceniano na podstawie identyfikacji genów: glmM, cagA, cagE, iceA i vacA, izolowanych z bioptatów błony śluzowej żołądka.
Wykazano, że największa (70,6%) zgodność genetyczna w zakresie badanych genów dotyczyła bakterii izolowanych od matek i ich dzieci. Jest to obserwacja zgodna z danymi z piśmiennictwa, w których matkę uważa się za odgrywającą kluczową rolę w przekazywaniu zakażenia H. pylori dzieciom. W szwedzkich badaniach epidemiologicznych z udziałem 162 dzieci i 480 członków ich rodzin zakażenie matki było silnym niezależnym czynnikiem ryzyka wystąpienia zakażenia H. pylori u dziecka, podczas gdy posiadanie zakażonego bakterią ojca nie było istotne po uwzględnieniu innych czynników ryzyka [10]. Porównywalne wyniki badań uzyskali również Rocha i wsp. [6], badając rodziny zamieszkujące obszary wiejskie w Brazylii. W badaniach Rothenbachera i wsp. [7] częstość występowania zakażenia tej bakterii u dzieci matek z obecnymi specyficznymi przeciwciałami przeciwko H. pylori w klasie IgG w ślinie była znacząco większa w porównaniu z dziećmi matek seronegatywnych (17,3 vs 5,1%). Płeć, liczba starszego rodzeństwa, stopień wykształcenia matki i ojca nie wpływały na status H. pylori dziecka, podczas gdy zaludnienie miejsca zamieszkania oraz brak antybiotykoterapii w przeszłości wykazywały silny związek z zakażeniem H. pylori. W badaniach Kivi i wsp. [11] te same szczepy bakteryjne u matki i przynajmniej jednego jej dziecka wykryto w 10 spośród 18 badanych rodzin. Zakażenie tym samym szczepem H. pylori występowało w 40% par matka–dziecko. Obecność identycznych szczepów H. pylori wykazali również Han i wsp. [12] u matek i ich dzieci oraz wśród rodzeństwa. W badaniach rodzinnych przeprowadzonych na terenie północno-wschodniej Polski w 68% rodzin członkowie rodziny byli zakażeni szczepem bakterii o tym samym genotypie, najczęściej s1mx (35,5% rodzin) lub s1m² (34,3% rodzin). Znaczenie zakażenia matczynego wskazuje na rolę bliskich kontaktów w transmisji infekcji w grupie pediatrycznej.
Wyniki badań epidemiologicznych potwierdzają, że dzieci są skolonizowane szczepem bakteryjnym pochodzącym od matki częściej niż od ojca [12], choć wydaje się, że ojcowie mogą również odgrywać pewną rolę w transmisji zakażenia H. pylori [7]. W badaniach własnych tylko w 3 parach ojciec–dziecko na 11 stwierdzono obecność identycznych szczepów H. pylori. Był to odsetek znacząco mniejszy niż w przypadku par matka–dziecko. Podobną zależność stwierdzili również Rothenbacher i wsp. [7], którzy co prawda wykazali zwiększone ryzyko wystąpienia zakażenia H. pylori u dzieci, których ojcowie mieli podwyższony poziom swoistych przeciwciał w klasie IgG w ślinie, ale związek ten nie był tak silny, jak w przypadku seropozytywnych matek. Kivi i wsp. [11] nie odnotowali zgodności genotypów H. pylori w żadnej parze ojciec–dziecko.
W badaniach Kivi i wsp. [11] aż 14 spośród 17 badanych rodzeństw (82%) miało ten sam typ genetyczny H. pylori. Co więcej, w 6 rodzinach, w których matka była zakażona innym szczepem bakteryjnym niż jej dzieci, wykazano zgodność genetyczną bakterii występujących u rodzeństw. Znaczenie zakażeń między rodzeństwem potwierdzają również wyniki badań przeprowadzonych w grupie obejmującej 684 2–9-letnich kolumbijskich dzieci sugerujące, że posiadanie starszego rodzeństwa zakażonego H. pylori istotniej zwiększa ryzyko wystąpienia zakażenia niż zakażone rodzeństwo młodsze. Ryzyko wystąpienia zakażenia zwiększa również mała różnica wieku między rodzeństwem [13]. W badaniach własnych tylko u 2 par rodzeństw wykryto zakażenie tym samym typem genetycznym H. pylori. Biorąc pod uwagę, że w obu przypadkach również matka dzieci była zakażona tym samym szczepem bakteryjnym, prawdopodobieństwo transmisji zakażenia wśród rodzeństwa wykazane w badaniach własnych wydaje się niewielkie.
Pojedyncze doniesienia wskazują na możliwość nabywania zakażenia H. pylori przez osoby dorosłe od zakażonych współmałżonków [14]. Wyniki badań własnych oraz badań Kivi i wsp. [10], w których zgodność genetyczną szczepów H. pylori izolowanych od współmałżonków oszacowano odpowiednio na 14,3 i 22% par, sugeruje możliwość takiej transmisji. Bez wątpienia posiadanie większej liczby dzieci jest czynnikiem ryzyka wystąpienia zakażenia u osób dorosłych, a duży odsetek reinfekcji po osiągniętej eradykacji u osób dorosłych zamieszkujących obszary o dużym odsetku osób zakażonych prawdopodobnie wiąże się z ryzykiem wystąpienia wewnątrzrodzinnej transmisji bakterii [15].
W analizach epidemiologicznych oceniających drogi wewnątrzrodzinnej transmisji H. pylori, opierających się na molekularnym typowaniu szczepów bakterii, należy również pamiętać, że u tego samego człowieka można stwierdzić kilka różnych szczepów tej bakterii różnią-cych się istotnie materiałem genetycznym. U 8 spośród 104 osób pochodzących z rodzin zakażonych H. pylori badanych przez Kivi i wsp. [10] z trzonu i części przedodźwiernikowej żołądka izolowano różne szczepy bakteryjne. W badaniach własnych izolowano bakterię z bioptatu pobranego z części przedodźwiernikowej żołądka, co należy uwzględnić w interpretacji wyników badania.

Wnioski
1) Typowanie genetyczne szczepów H. pylori izolowanych od członków rodziny potwierdza istotną rolę matki w transmisji zakażenia dzieciom.
2) Zakażenia innych członków rodziny, zwłaszcza współmałżonków, wydają się mieć mniejsze znaczenie w przekazywaniu zakażenia.

Piśmiennictwo  
1. Maciorkowska E, Kaczmarski M, Roszko I i wsp. Postępy diagnostyczno-terapeutyczne w zakażeniu H. pylori u dzieci. Pediatria po Dyplomie 2008 (wyd. specjalne): 113-20.  
2. Zhang Z. The risk of gastric cancer in patients with duodenal and gastric ulcer: research progresses and clinical implications. J Gastrointest Canc 2007; 38: 38-45.  
3. Czerwionka-Szaflarska M, Parzęcka M. Rodzinne występowanie zakażenia Helicobacter pylori – aktualny stan wiedzy. Pediatr Pol 2006; 81: 679-83.  
4. Drumm B, Perez-Perez GI, Blaser MJ, et al. Intrafamiliar clustering of Helicobacter pylori infection. N Eng J Med 1990; 322: 359-63.  
5. Dominici P, Bellentani S, Di Biase AR, et al. Familiar clustering of Helicobacter pylori infection: population based study. BMJ 1999; 319: 537-40.  
6. Rocha GA, Rocha AM, Silva LD, et al. Transmission of Helicobacter pylori infection in families of preschool-aged children from Minas Gerais, Brazil. Trop Med Int Health 2003; 8: 987-91.  
7. Rothenbacher D, Winkler M, Gonser T, et al. Role of infected parents in transmission of Helicobacter pylori to their children. Pediatr Infect Dis J 2002; 21: 674-9.  
8. Farrell S, Doherty GM, Milliken I, et al. Risk factors for Helicobacter pylori infection in children: an examination of the role played by intrafamiliar bed sharing. Pediatr Infect Dis J 2005; 24: 149-52.  
9. Kivi M, Rodin S, Kupershmidt I, et al. Helicobacter pylori genome variability in a framework of familial transmission. BMC Microbiology 2007; 7: 54-61.
10. Kivi M, Johansson AL, Reilly M, et al. Helicobacter pylori status in family members as risk factors for infection in children. Epidemiol Infect 2005; 133: 645-52.
11. Kivi M, Tindberg Y, Sörberg M, et al. Concordance of Helicobacter pylori strains within families. J Clin Microbiol 2003; 41: 5604-8.
12. Han SR, Zschausch HC, Meyer HG, et al. Helicobacter pylori: clonal population structure and restricted transmission within families revealed by molecular typing. J Clin Microbiol 2000; 38: 3646-51.
13. Goodman KJ, Correa P. Transmission of Helicobacter pylori among siblings. Lancet 2000; 355: 358-62.
14. Brenner H, Rothenbacher D, Bode G, et al. Active infection with Helicobacter pylori in healthy couples. Epidemiol Infect 1999; 122: 91-5.
15. Kivi M, Tindberg Y. Helicobacter pylori occurrence and transmission: a family affair? Scand J Infect Dis 2006; 38: 407-17.