Rola czynnika genetycznego w powstawaniu i przebiegu płaskonabłonkowego raka krtani

Nowotwory krtani (ogólniej: nowotwory głowy i szyi) nie są zaliczane do chorób nowotworowych o uwarunkowaniu genetycznym czy chociażby rodzinnym. Niemniej komponenta genetyczna w kształtowaniu ryzyka wystąpienia nowotworu krtani istnieje [1, 2], a celem artykułu jest zwrócenie uwagi na ten aspekt. Dotyczy to nie tylko indywidualnego ryzyka wystąpienia tej choroby, ale także zmienności jej przebiegu. Wiedza dotycząca tego zagadnienia nie jest jeszcze ostateczna, ale ustalenia dokonane technikami biologii molekularnej, epidemiologii molekularnej oraz genetyki przyniosły znaczący postęp w rozumieniu wieloetapowego procesu, jaki ma miejsce w przypadku raka krtani [2–7]. Jednym z efektów badań molekularnych i genetycznych jest uzyskanie poglądu (niekiedy wstępnego), tłumaczącego w dosyć jednolity sposób rolę niektórych genów i ich ekspresji w polimorficznym charakterze odpowiedzi na ekspozycję na kancerogeny [3, 7, 8].

W powszechnym rozumieniu, uszkodzenia materiału genetycznego decydują o przenoszeniu danej wady z pokolenia na pokolenie. Stwierdzenie to jest prawdą, jeżeli dotyczy uszkodzeń w obrębie komórek rozrodczych. Natomiast uszkodzenie DNA lub chromosomów w komórkach somatycznych – stanowiących znakomitą większość organizmu – skutkuje zakłóceniem przekazu informacji genetycznej tylko na niekorzyść osoby, u której wystąpiło i nie jest przekazywane. Efektem takiego wadliwego przekazu informacji jest niewłaściwe funkcjonowanie komórki, prowadzące dalej do przedwczesnego starzenia, mutacji cichych, pozbawionych bezpośrednich skutków fukcjonalnych i mutacji uruchamiających proces kancerogenezy. Przy rozważaniu roli czynnika genetycznego w zapadalności na nowotwory należy posługiwać się poszerzonym pojęciem wpływu genów na funkcję komórki.



Epidemiologiczne wskazania znaczenia
czynnika genetycznego
w kształtowaniu ryzyka zapadalności
na nowotwory głowy i szyi

Bardzo jednoznaczne rozpoznanie palenia papierosów jako głównego czynnika etiologicznego odpowiedzialnego za wystąpienie raka krtani (ryc. 1.) nie zamyka problemu etiologii tego nowotworu lecz zawiera w sobie kolejne pytanie o udział indywidualnej podatności na szkodliwe działanie dymu tytoniowego. Chociaż palenie papierosów czyni się odpowiedzialnym za wystąpienie co najmniej 35% wszystkich nowotworów, to nawet w grupie intensywnych palaczy papierosów tylko u części z nich rozwijają się nowotwory [9, 10]. Równocześnie porównanie wywiadów na temat palenia papierosów przez chorych pokazuje, jak zróżnicowana była intensywność nałogu przed wystąpieniem choroby.

Przekonywujące badania epidemiologiczne nad rodzinnym uwarunkowaniem występowania płaskonabłonkowych nowotworów głowy i szyi przedstawili Copper i wsp. [11]. Określono częstość występowania nowotworów u 618 krewnych 108 chorych z rakiem górnych dróg oddechowych; grupę odniesienia stanowiła grupa 619 osób niespokrewnionych z chorymi. Stwierdzono 3,5-krotnie większe ryzyko wystąpienia nowotworów górnych dróg oddechowych u krewnych, podczas gdy u rodzeństwa ryzyko wzrastało aż 14,6-krotnie. Wnioskiem autorów jest stwierdzenie, że czynnik genetyczny jest ważnym elementem ryzyka wystąpienia nowotworów górnych dróg oddechowych. Tego samego zagadnienia dotyczy wcześniejsza publikacja Bondy i wsp. [12]. Obserwacje epidemiologiczne uzupełniono określeniem współczynnika wrażliwości na mutageny (por. rozdział Niestabilność chromosomowa...). Stwierdzono, że dziedziczna, a więc występująca rodzinnie, podwyższona wrażliwość na mutageny znamiennie podnosi ryzyko wystąpienia nowotworów górnych dróg oddechowych. Autorzy interpretują własne wyniki jako pełną zgodność z teorią dwóch zdarzeń Knudsona (por. rozdział Rola protoonkogenów...). Wyniki te znalazły potwierdzenie w późniejszej publikacji tego samego ośrodka, która porównuje występowanie nowotworów u krewnych chorych na nowotwory głowy i szyi (170 osób) oraz u krewnych osób zdrowych (175 osób). Po uwzględnieniu innych czynników ryzyka (palenie tytoniu, picie alkoholu, wiek, płeć) obliczono, że ryzyko wystąpienia nowotworów u krewnych osób chorych na raka jest 3,8-krotnie większe niż u krewnych osób zdrowych. Ryzyko ulegało multiplikacji u osób o zwiększonej wrażliwości na mutageny [12].

Wnioski wyprowadzone z badań nad etiologią nowotworów głowy i szyi, a zwłaszcza wskazania na rolę indywidualnej podatności na działanie kancerogenów doprowadziły do podjęcia badań nad identyfikacją czynników genetycznych na różnych poziomach organizacji materiału genetycznego – od DNA do chromosomów.


Niestabilność chromosomowa
jako przykład genetycznego
zróżnicowania populacji ludzkiej

Zróżnicowanie genetyczne populacji ludzkiej, znane także pod nazwą polimorfizmu genetycznego, zostało systematycznie przebadane pod kątem niestabilności chromosomowej, stanowiącej odbicie szerszego pojęcia, a mianowicie niestabilności genetycznej. Uważa się, że niestabilność chromosomowa jest ukrytą, dziedziczną cechą konstytutywną, która ujawnia się dopiero w warunkach kontaktu z mutagenem (kancerogenem). Do ilościowego pomiaru niestabilności chromosomowej w laboratorium T. C. Hsu (Houston, Texas, USA) opracowano tzw. test bleomycynowy, oparty na 2 założeniach:
w komórkami reprezentatywnymi dla całego organizmu są łatwe do pozyskania leukocyty krwi obwodowej,
w podatność na działanie bleomycyny indukującej w limfocytach różnorodność uszkodzeń DNA (przerwy jedno- i dwuniciowe, miejsca apurynowe) i aberracji chromosomowych można traktować jako wrażliwość na większość mutagenów.



Test polega na hodowli leukocytów in vitro, podaniu bleomycyny w końcowej fazie hodowli i ilościowej ocenie skutków ekspozycji na bleomycynę. Oceniane są 2 parametry: liczba pęknięć chromatyd na komórkę (ang. b/c = breaks per cell) oraz udział procentowy komórek z uszkodzonymi chromosomami w całej puli badanych komórek [14]. We wczesnej fazie badań stwierdzono, że test bleomycynowy wykazuje szczególną przydatność w badaniu podatności na nowotwory, będące wynikiem ekspozycji na mutageny środowiskowe, w czym całkowicie mieszczą się nowotwory głowy i szyi.

Pierwszym ustaleniem było spostrzeżenie znacznego rozrzutu wartości współczynnika b/c, przy czym wartość średnia obliczana dla chorych na raka przewyższała obliczaną dla grupy kontrolnej. Rozkład wartości b/c w grupie chorych na nowotwory nie miał charakteru gaussowskiego, a przynajmniej wg niektórych badań nabierał charakteru rozkładu bimodalnego. Uwagę zwracała grupa pacjentów o najwyższych wartościach współczynnika b/c, której przypisywano cechę hiperniestabilności chromosomowej. Zauważono, że z tej grupy pochodzą chorzy, u których występują drugie pierwotne nowotwory i często występują wznowy [15, 16]. Ponadto stwierdzono, że wysokie współczynniki niestabilności cechują młodych dorosłych chorych na nowotwory głowy i szyi [17]. Większość autorów donosi o przydatności oznaczania współczynniki b/c do oceny ryzyka wystąpienia raka krtani [18], ale jednocześnie kwestionuje jego użyteczność do celów prognostycznych [19]. Sprawa ta wymaga jeszcze wyjaśnienia.

W ten sposób pojęcie niestabilności chromosomowej pozwoliło na powiązanie oceny ryzyka ze strukturą i funkcjonowaniem materiału genetycznego [18, 20].

Warto dodać, że metodykę pracy za pomocą testu bleomycynowego ostatnio znacznie rozbudowano, wskazując na celowość wykorzystania innych komórek (np. keratynocytów) i kancerogenów (np. benzo(a)piren), lepiej oddających inicjację kancerogenezy w komórkach nabłonkowych regionu głowy i szyi [14, 18]. Te propozycje znacznie poszerzyły możliwości badawcze. Ponadto oceny niestabilności genetycznej nie opiera się już wyłącznie na teście bleomycynowym, lecz wprowadzono też inne techniki badawcze (m.in. elektroforezę żelową pojedynczych komórek – ang. comet assay), z powodzeniem stosowane w badaniach nad biologią nowotworów górnych dróg oddechowych [21].


Kancerogeny w etiologii
nowotworów krtani

Proces powolnego i niepełnego spalania tytoniu prowadzi do utworzenia dymu, w którym zidentyfikowano prawie 4 tys. związków chemicznych [9]. Właściwości mutagenne i kancerogenne dymu tytoniowego wynikają przede wszystkim z obecności następujących grup związków: policyklicznych węglowodorów aromatycznych (PWA), amin aromatycznych (AA),
N-nitrozoamin oraz reaktywnych form tlenu (ROS). Wymienione kancerogeny znajdują się zarówno w dymie unoszącym się z żarzącego się końca papierosa (strumień boczny), jak i w dymie wdychanym przez palacza (strumień główny). Co prawda, coraz powszechniej stosowane filtry zmniejszają stężenie wdychanych kancerogenów – głównie przez przechwytywanie substancji smolistych – ale nie likwidują ekspozycji na kancerogeny. Zawartość niektórych kancerogenów w strumieniu bocznym może przewyższać ich stężenia w strumieniu głównym, co dobitnie zwraca uwagę na rolę tzw. biernego palenia [22].

Kancerogeny penetrują komórki i dostają się do jądra komórkowego, gdzie mogą oddziaływać destrukcyjnie z materiałem genetycznym (ryc. 2.). Oddziaływanie polega na reakcji chemicznej cząsteczki kancerogenu z elementami struktury DNA i trwałym ich uszkodzeniu. Efektem reakcji PWA i AA jest dobudowanie kancerogenu do reszty guaninowej, a produkt nazywany jest adduktem kancerogen:DNA. N-nitrozoaminy alkilują resztę guanozyny, wprowadzając na jeden z atomów azotu dodatkowy ładunek dodatni.

Z czterech podstawowych zasad azotowych DNA najbardziej wrażliwa na uszkodzenia jest guanina. ROS uszkadzają poprzez utlenianie wszystkie cztery zasady. Ponadto ROS (ryc. 3.) znajdują się zarówno w fazie gazowej, jak i w substancjach smolistych i to w ilościach znacznie przewyższających poziomy innych kancerogenów. Dlatego ekspozycja na ROS wydaje się być najgroźniejsza dla komórki.

Konsekwencją uszkodzeń DNA przez kancerogeny jest zakłócenie funkcjonowania DNA poprzez:

- niewłaściwe parowanie zasad DNA, a więc nieprawidłowe przekazywanie informacji genetycznej,

- blokowanie dostępności do cząsteczki DNA enzymom uczestniczącym w procesach replikacji DNA i biosyntezy białka,

- zwiększanie niestabilności cząsteczki DNA, co prowadzi do zwiększenia podatności na kolejne uszkodzenia [23-25].


Uszkodzenia DNA znajdowane są we wszystkich tkankach organizmu eksponowanego na kancerogen. Przykładowo u chorych na raka krtani stwierdzano obecność adduktów PWA:DNA w materiale pochodzącym z nowotworu, w otaczającej nowotwór tkance prawidłowej histologicznie oraz w leukocytach krwi obwodowej [26, 27]. Również guanozyna alkilowana w wyniku ekspozycji na N-nitrozoaminy występowała w tych trzech wymienionych tkankach [28]. Ogólnie, wyższe poziomy adduktów DNA stwierdzano w tkance eksponowanej bezpośrednio (jama ustna, krtań) niż pośrednio (pęcherz moczowy, leukocyty krwi obwodowej) [29]. Natomiast w obrębie głowy i szyi w badaniach własnych stwierdzono malejący kolejno poziom adduktów PWA: DNA, przechodząc od części ustnej gardła do jamy ustnej i dalej do krtani, co wydaje się odpowiadać intensywności ekspozycji na dym tytoniowy [30]. Warto tu dodać, że poziom adduktów amin aromatycznych oznaczonych w materiale uzyskanym z nowotworów krtani koreluje lepiej z intensywnością palenia papierosów niż poziom adduktów PWA:DNA [31]. Można to tłumaczyć wszechobecnością policyklicznych węglowodorów aromatycznych, które – poza papierosami – znajdują się także w spalinach samochodowych, wyziewach przemysłowych, a nawet kuchennych.

Obecność adduktów DNA jest niewątpliwie dowodem uprzedniego kontaktu z kancerogenami. Powstaje zatem pytanie, czy stwierdzenie ich obecności dowodzi podjęcia procesu kancerogenezy. Odpowiedź na to pytanie jest negatywna z dwóch względów. Po pierwsze, komórki posiadają bardzo sprawny mechanizm wykrywania i usuwania uszkodzeń, znany jako proces naprawy DNA, przywracający normę fizjologiczną. Po drugie, uszkodzenia DNA oznacza się w całym genomowym DNA [29]. Jednak względnie niska tolerowana liczba uszkodzeń DNA nie przewyższa poziomu 1/107 adduktów PWA, AA lub N-nitrozoamin, a liczba uszkodzeń oksydacyjnych jest o 1–2 rzędy wyższa. Ponieważ znakomita większość cząsteczki DNA nie zawiera regionów kodujących (genów), to uszkodzenia w tych rejonach mogą nie prowadzić do znaczących konsekwencji. Ponadto tylko część genów jest bezpośrednio zaangażowana w proces kancerogenezy i tylko uszkodzenia w ich obrębie uruchamiają proces kancerogenezy (por. rozdział Rola protoonkogenów...) [1, 2, 7, 23, 24]. Chociaż uszkodzenia utrwalone w postaci mutacji można identyfikować w poszczególnych genach, to do tej pory nie opracowano metodyki wykrywania w nich daleko liczniejszych uszkodzeń DNA.



Enzymy uczestniczące w metabolizmie kancerogenów

Kancerogeny chemiczne jako substancje obce są usuwane z komórki (organizmu) w trakcie procesu detoksykacji. Organem wyspecjalizowanym w usuwaniu obcych substancji jest wątroba. Proces detoksykacji kancerogenu jest dwuetapowy (ryc. 4.). Pierwszy etap nazywany aktywacją metaboliczną polega na zmianie właściwości fizykochemicznych cząsteczki w kierunku (i) zwiększenia jej rozpuszczalności i (ii) nadania jej cechy reaktywności chemicznej. Aktywacja metaboliczna przebiega przy udziale enzymów aktywacyjnych, które należą do licznej rodziny białek zależnych od cytochromu P450. Mnogość enzymów tej grupy wiąże się z daleko posuniętą specjalizacją. Przykładowo, gen CYP1A1 koduje białka aktywujące policykliczne węglowodory aromatyczne, CYP1A2 aminy aromatyczne, CYP2D6 N-nitrozoaminy, a CYP3A7 aflatoksyny [7, 32, 33].

Dopiero aktywowany kancerogen staje się substratem dla enzymów aktywacyjnych. Do tej grupy należą transferazy S-glutationu, N-acetylotransferazy, sulfotransferazy, glukorynidazy, hydrolazy epoksydów i inne. Zadaniem tych enzymów jest sprzęganie aktywowanych kancerogenów, wydalanie z komórki i ostatecznie usuwanie wraz z moczem z organizmu. Enzymy detoksykacyjne nie posiadają tak zaawansowanej specyficzności i brak niektórych z nich może być kompensowany aktywnością innych [33–35].

Ubocznym skutkiem aktywacji metabolicznej kancerogenu jest jego reaktywność wobec DNA. Aktywowany, a nie usunięty na czas kancerogen reaguje z DNA, co omówiono w rozdz. Kancerogeny w etiologii nowotworów krtani. Jednakże powstanie uszkodzeń cząsteczki DNA powoduje natychmiastowe uruchomienie procesu naprawy, którego zadaniem jest przywrócenie stanu wyjściowego. Poznanie procesu naprawy DNA jest zaawansowane. Ustalono, że istnieje kilka mechanizmów naprawy DNA dostosowanych do typu uszkodzenia, a nawet jego poziomu oraz stanu funkcjonalnego komórki. Tym samym grupa enzymów uczestniczących w procesie naprawy DNA jest dosyć rozległa i liczy co najmniej kilkadziesiąt białek (ostatnie szacunki mówią o ok. 150 białkach). Najogólniej można je podzielić na białka rozpoznające uszkodzenie, odpowiedzialne za właściwe usunięcie uszkodzenia i białka współdziałające [33, 36].

Zarówno dwuetapowa detoksykacja, jak i naprawa uszkodzeń DNA w normie przebiegają sprawnie. Dlatego wystąpienie i kumulacja mutacji DNA inicjuje proces kancerogenezy, mimo że jest to najmniej prawdopodobny scenariusz. Innymi konsekwencjami nagromadzenia mutacji są: śmierć komórki, przyspieszenie starzenia i indukcja nienowotworowych chorób somatycznych (ryc. 4.). Jednakże zróżnicowanie wydajności wymienionych trzech procesów enzymatycznych, występujące w populacji ludzkiej, decyduje o różnej sumarycznej sprawności usuwania kancerogenów lub wywołanych przez nie uszkodzeń materiału genetycznego i tym samej różnej podatności na rozwój nowotworów. Temat ten zostanie omówiony w następnym rozdziale.


Genetyczna determinacja aktywności enzymatycznej

Wszystkie 3 grupy enzymów odpowiedzialnych za metabolizm kancerogenów cechuje polimorficzne zróżnicowanie aktywności [7, 33]. O ile jednak farmakogenetyka od dawna stykała się ze zróżnicowaniem aktywności enzymatycznej leków metabolizujących leki, to rozkład aktywności w populacji obrazowała krzywa Gaussa. Tymczasem przynajmniej dla części enzymów odpowiedzialnych za metabolizm kancerogenów populacyjny rozkład aktywności jest bi- lub trimodalny. Oznacza to, że istnieją odrębne populacje oparte na obecności izoenzymów, kodowanych przez warianty strukturalne genu. Sprowadza się to do faktu, że populacje o niskiej, średniej i wysokiej aktywności danego enzymu różnią się statusem genetycznym. Przy znanej w biologii zaawansowanej zależności między strukturą a funkcją można oczekiwać, że nawet nieznaczne różnice strukturalne prowadzą do istotnej zmiany funkcji aż po całkowity brak aktywności enzymatycznej. W omawianej sytuacji zmiana struktury genu (czasami nawet brak lub substytucja jednego (!) nukleotydu) może doprowadzić do tego, że syntezowane na jego matrycy białko jest skrócone w stosunku do prawidłowego, ulega szybkiemu rozpadowi lub, po prostu, jego aktywność enzymatyczna jest obniżona. Logicznym zatem wydaje się, że zwiększenie podatności na działanie kancerogenu będzie cechowało osoby o wyższej aktywności enzymów aktywacyjnych oraz obniżonej sprawności enzymów detoksykacyjnych i naprawczych.

Różnice aktywności enzymatycznej omawianych enzymów mogą być znaczne. Donosi się o zróżnicowaniu aktywności enzymów aktywacyjnych sięgającej dziesiątków tysięcy, setek, do tysiąca w przypadku enzymów detoksykacyjnych i względnie najmniejszym zróżnicowaniu aktywności enzymów naprawczych. Ta ostatnia grupa jest jeszcze najmniej rozpracowana.

W licznych badaniach opisano związek między aktywnością enzymów metabolizujących kancerogeny a ryzykiem wystąpienia nowotworu. Zdanie to wymaga komentarza. Po pierwsze, aby dokładniej odnieść się do statusu genetycznego analizowano rozkład genotypów tych enzymów, porównując udział tych, które determinują wysoką aktywność enzymów aktywacyjnych i niską sprawność procesów detoksykacji i naprawy DNA. Oczywistym założeniem było, że taki układ enzymów pociąga za sobą wzrost ryzyka wystąpienia nowotworu, o czym wspominano już wyżej. W nowotworach głowy i szyi po raz pierwszy zwrócono uwagę na taką zależność w ograniczonym zakresie w badaniach nad poziomami adduktów PWA: DNA w tkankach chorych na raka krtani, prowadzonych w zespole F.F. Kadlubara (Jefferson, USA) [26, 37]. Ustalono dodatnią korelację między poziomem adduktów DNA, a ogólnym poziomem enzymów aktywacyjnych zależnych od cytochromu P450, a także poziomami dwóch konkretnych enzymów (CYP1A1 i CYP2C), katalizującymi alternatywne szlaki aktywacji benzo(a)pirenu.

Później okazało się, że o ile można uchwycić genetyczną determinację poziomu uszkodzeń DNA, to przełożenie tego ustalenia na ocenę ryzyka genetycznego wystąpienia nowotworów jest trudne [38], bowiem uszkodzenia DNA są usuwane w procesie naprawy. Ponadto podniesiono też fakt, że genetyczna determinacja poziomu uszkodzeń DNA jest wypadkową działania dwóch grup enzymów: aktywacyjnych i detoksykacyjnych. Rozumowanie to dało impuls do dalszych badań nad udziałem wszystkich trzech grup enzymów oraz ich sumarycznego efektu. W tym miejscu trzeba przypomnieć wysoką sprawność procesów detoksykacji i naprawy DNA; ogromna większość aktywowanego enzymu podlega detoksykacji, a tylko nieliczne uszkodzenia DNA trwale zmieniają jego strukturę ulegając przekształceniu w mutacje DNA. Mimo wyłożonych tutaj zastrzeżeń udało się wykazać słabą zależność dodatnią między aktywnością CYP2D6 (aktywacja N-nitrozoamin) a ryzykiem wystąpienia nowotworu krtani; asocjacja taka była najsilniejsza u intensywnych palaczy [39]. Wyniki te znalazły potwierdzenie w późniejszej pracy na materiale pochodzącym od pacjentów z nowotworami głowy i szyi, z dużym udziałem nowotworów jamy ustnej [34]. Ciekawe jest także wykazanie istnienia biologicznie aktywnych duplikacji genu CYP2D6 u chorych na raka krtani i płuc, co świadczy o wzmożonej aktywacji kancerogennych N-nitrozoamin [40].

Wobec sprawności procesu detoksykacji uwaga badaczy przesunęła się w stronę indywidualnego zróżnicowania tego etapu metabolizmu kancerogenów. Początkowo badania skupiały się na pojedynczych izoenzymach detoksykacyjnych, ale możliwość kompensacji braku aktywności jednego z nich przez inne narzucała konieczność pracy równolegle z kilkoma. W badaniach własnych wykazano, że o poziomie adduktów DNA nie decyduje defekt pojedynczego genu, ale poziom adduktów DNA rośnie wraz z krotnością defektów genowych [41]. Ustalenia innych autorów można zreasumować następująco:

- obniżenie aktywności transferaz glutationowych (GSTM1, GSTP1, GSTM3) oraz N-acetylotransferaz (NAT1 i NAT2) w niewielkim, ale zauważalnym stopniu wpływa na podniesienie ryzyka nowotworów głowy i szyi [34, 38, 42],

- rola defektów genów enzymów detoksykacyjnych jest niższa w organach eksponowanych na dym tytoniowy miejscowo (górne drogi oddechowe) niż w organach eksponowanych pośrednio (np. pęcherz moczowy) [43],

- znaczenie czynnika genetycznego jest maskowane przez palenie tytoniu i uwidacznia się głównie u osób o niskiej lub umiarkowanej ekspozycji [42, 44].



Ostatnio badaniami objęto polimorficzne zróżnicowanie enzymów naprawczych. Chociaż od dawna wysuwano przypuszczenie znaczenia defektów naprawy DNA w zwiększaniu ryzyka zapadalności na nowotwory, dopiero niedawno uzyskano eksperymentalne potwierdzenie tej hipotezy.

Wstępne, ale sugestywne dane zamieszczone w pracy Matullo i wsp. [45] dowodzą związku między polimorfizmem trzech genów, których enzymy katalizują 3 różne mechanizmy procesu naprawy DNA a uszkodzeniami DNA w leukocytach krwi obwodowej zdrowych palaczy tytoniu. Najwyższy współczynnik korelacji między poziomem adduktów DNA a obniżeniem potencjału naprawy DNA zaobserwowano dla genu XPD, który uczestniczy w naprawie DNA wg mechanizmu z wycinaniem nukleotydów, a ten właśnie mechanizm funkcjonuje w usuwaniu większości uszkodzeń indukowanych genotoksycznym działaniem dymu tytoniowego. Potwierdzenie roli defektów naprawy DNA w zapadalności na raka płuc, a więc w nowotworze o zbliżonej etiologii uzyskała Butkiewicz i wsp. [46]. Bezpośredni dowód na związek między defektami genów odpowiedzialnych za proces naprawy DNA, a zapadalnością na nowotwory głowy i szyi podany został przez Shena i wsp. [47]. Praca dotyczyła genu XPC, który również koduje białko uczestniczące w procesie naprawy DNA przez wycinanie nukleotydu.

Powyższy opis nie wyczerpuje całości zagadnienia. Poza rodziną cytochromu P450 znaleziono inne enzymy uczestniczące w aktywacji metabolicznej kancerogenów. Należy do nich lizosomalna mieloperoksydaza. Stwierdzono, że jeden z wariantów polimorficznych tego enzymu, który wykazuje obniżoną aktywność, stanowi czynnik zabezpieczający przed wystąpieniem nowotworów płuc i krtani, ale prawdopodobnie nie odgrywa roli w etiologii nowotworów gardła [48].

Przy badaniu ryzyka genetycznego sięgnięto także po geny kodujące białka metabolizujące etanol, bowiem mocne napoje alkoholowe są rozpoznanym czynnikiem, który multiplikuje ryzyko wystąpienia nowotworów związane z paleniem tytoniu [49]. Zaskakująco, 2 niezależnie wykonane badania, przeprowadzone na różnych grupach etnicznych nie stwierdziły podwyższonego ryzyka wystąpienia nowotworów górnych dróg oddechowych (głowy i szyi) powiązanego z polimorfizmem dehydrogenazy alkoholowej 3 [50, 51].


Rola protoonkogenów i genów
supresorowych (antyonkogenów)

Mianem protoonkogenów określa się sekwencje DNA, które w warunkach fizjologicznych pozostają uśpione i dopiero pod wpływem mutacji ulegają ekspresji. Produktem onkogenu jest onkoproteina zdolna do transformacji nowotworowej komórki. Onkogeny zostały pierwotnie zidentyfikowane jako geny transformujących retrowirusów, ale później homologiczne geny odkryto u kręgowców, w tym też w komórkach ludzkich. Tym samym protoonkogeny podają sygnał start do procesu kancerogenezy. Prawdopodobnie długotrwała produkcja onkoprotein powoduje, że dodatkowo komórki tracą kontrolę nad proliferacją i podlegają niekontrolowanemu namnażaniu się.

W genomie ludzkim znajdują się równocześnie geny o całkowicie przeciwstawnym zadaniu, a mianowicie geny supresorowe (przeciwnowotworowe). Geny te również nie ulegają ekspresji w normie, ale pod wpływem czynników uszkadzających DNA zaczynają produkować białka, których funkcja sprowadza się do przekazania sygnału stop transformacji nowotworowej [52–54]. Występowanie w genomie wszystkich genów w dwóch kopiach daje dalszą implikację. Dla dysregulacji funkcji komórki konieczne jest zmutowanie jednej kopii protoonkogenu (pojawia się onkoproteina sygnalizująca podjęcie proliferacji) i obydwóch kopii genu supresorowego (całkowity brak sygnału stop). Dotyczy to wyłącznie mutacji nowych, ale możliwe jest, że zmutowany gen został odziedziczony, co zwiększa prawdopodobieństwo transformacji nowotworowej. Dodać trzeba, że w przypadku nowotworów dziedzicznych (np. zespół Li-Fraumeni) inaktywacja genów supresorowych przenoszona jest z pokolenia na pokolenie w sposób dominujący [55].

Pierwszym symptomem transformacji jest wyjście komórki z fazy spoczynkowej i podjęcie proliferacji. Tym samym produkty białkowe protoonkogenów działają na rzecz proliferacji, a genów supresorowych antyproliferacyjnie. Finalnie taką samą rolę jak protoonkogeny spełniają czynniki wzrostu, ale sygnał do ich działania następuje w prawidłowo funkcjonującej komórce. Ze względu na podobieństwo funkcji oraz fakt, że wszelka dysregulacja ich struktury i funkcji leży u podstaw procesu kancerogenezy, onkogeny i czynniki wzrostu są na ogół omawiane razem [1, 52, 53].



Ponieważ działanie protoonkogenów i genów supresorowych stanowi fragment mechanizmu kancerogenezy należy podać więcej informacji na ten temat. Punktem wyjściowym jest założenie oddziaływania czynników zewnętrznych (kancerogenów) na materiał genetyczny, który w swoisty, indywidualny sposób modyfikuje efekt działania kancerogenów. Według powszechnie przyjętej teorii Knudsona, znanej jako hipoteza dwóch zdarzeń, konieczne jest równoległe lub nieodległe w czasie zmutowanie protoonkogenu i genu supresorowego [52, 56]. Dalsze badania doprowadziły do rozwinięcia tej hipotezy oraz jej dostosowania do różnych typów nowotworów. Obecnie wiadomo, że 2 mutacje są warunkiem niewystarczającym – dla nowotworów głowy i szyi wyliczono, że do podjęcia onkogenezy konieczne jest wystąpienie 6–10 mutacji w genach odpowiedzialnych za ten proces [57, 58]. Liczba mutacji w komórkach zainicjowanych szybko rośnie i prowadzi do przybrania tzw. fenotypu mutatorowego. Pojawia się tendencja do częstego występowania amplifikacji genów, niestabilności sekwencji mikrosatelitarnych, aberracji chromosomowych i aneuploidii, co prowadzi do pogłębiającego się chaosu przekazu informacji genetycznej [59].



W kontekście powyższych rozważań wiedza na temat aktywacji protoonkogenów i czynników wzrostu w nowotworach głowy i szyi jest względnie uboga. Wiadomo, że we wstępnej fazie rozrostu błony śluzowej stwierdza się wysoką aktywność epidermalnego czynnika wzrostu (EGF) i jego receptora [3]. W fazie promocji i progresji nowotworu obserwuje się wysoką aktywność cykliny D1. Gen dla tego białka ( CCND1, poprzednio oznaczany jako PRAD1) zlokalizowano w długim ramieniu chromosomu 11 (dokładna lokalizacja: 11q13) i wiadomo, że ten region chromosomowy ulega często amplifikacji w nowotworach głowy i szyi. W tym samym regionie zidentyfikowano 2 inne geny (INT2 i HST1), ale większość danych doświadczalnych wskazuje, że rolę onkogenu pełni cyklina D1. Amplifikacja 11q13 dobrze koreluje z postępem choroby i jest bardzo złym czynnikiem prognostycznym dla pacjentów [1]. Wymieniany jest także protoonkogen eIF4E, którego rola polega na stymulacji szeregu czynników wzrostu. Podwyższony poziom ekspresji tego białka obserwuje się we wszystkich przypadkach nowotworów głowy i szyi, i w większości przypadków tkanki otaczającej, a więc jest złym czynnikiem rokowniczym [60].

Wśród białek zaangażowanych w regulację cyklu komórkowego zwrócono uwagę na grupę fosfataz CDC25. Zidentyfikowano geny CDC25A, CDC25B i CDC25C, które kodują fosfatazy czynne w różnych fazach cyklu komórkowego. Wykazano, że CDC25A i CDC25B uczestniczą w stymulacji komórek pod wpływem onkogenów H-ras i c-myc oraz dezaktywacji genu supresorowego Rb1. Nadekspresja tych 2 genów w nowotworach głowy i szyi pozwala przypisać im rolę onkogenów w tym schorzeniu [61].

W inwazyjnej fazie rozrostu nowotworu istotną rolę odgrywają geny kodujące kompleks białek o aktywności proteolitycznej degradującej matrycę pozakomórkową, a klasyfikowanych jako matrycowe metaloproteinazy (MPP) [1]. W tej klasie właściwości protoonkogenu przypisano m.in. MPP11, zlokalizowanemu w długim ramieniu chromosomu 7, chociaż początkowo traktowano go jako gen supresorowy [62].



Rola genów supresorowych w nowotworach głowy i szyi poznana jest znacznie lepiej [54]. W znacznym stopniu wiąże się to z genem p53, który ulega ekspresji w wielu nowotworach, ale w nowotworach głowy i szyi jego dysfunkcja jest szczególnie częsta [63, 64]. Ogólnie zadanie genu p53 i jego produktu białkowego sprowadza się do nadzoru nad prawidłowością przebiegu cyklu komórkowego. W normie gen p53 praktycznie nie ulega ekspresji. Biosynteza białka zaczyna się w odpowiedzi na uszkodzenia DNA, a jego poziom wzrasta od anaplazji przez hipoplazję do dysplazji, gdzie osiąga stan odpowiadający produkcji białka w komórkach transformowanych nowotworowo.

W przypadku wystąpienia uszkodzeń DNA białko p53 wydłuża fazę G1, zapewniając więcej czasu na naprawę DNA. Jeżeli nastąpi replikacja uszkodzonego DNA, to białko p53 ponownie blokuje cykl komórkowy w fazie G2/M, zabezpieczając komórki przed mitozą. W miejsce zakończenia cyklu komórki z uszkodzonym DNA są kierowane w stronę śmierci programowanej (apoptozy). Tak działa produkt prawidłowego genu, jednak mutacje w obrębie tego genu dają produkt nietrwały albo o wadliwej funkcji i komórki tracą kontrolę nad cyklem życiowym [65]. Mutacje genu p53 grupują się w charakterystycznych gorących miejscach struktury, najczęściej w eksonach 5–8. Badając profil mutacji genu p53 można było powiązać je z uprzednią ekspozycją na dym tytoniowy [65], a także wskazać na różnice między pierwotną lokalizacją w obrębie górnych i dolnych dróg oddechowych [66], czy powiązać profil mutacji genu p53 ze wznową choroby i występowaniem drugich pierwotnych nowotworów [67, 68].

Dużo uwagi poświęcono genom supresorowym: p15, p16, p21 i p27 (nazwy pochodzą od wielkości kodowanego białka wyrażonego w kilodaltonach). Cechą wspólną ich produktów białkowych jest hamujące działanie na kinazy zależne od cyklin, a więc białka odpowiedzialne za proliferację komórek. W strukturze tych genów w nowotworach głowy i szyi wykrywano liczne mutacje, prowadzące do niedoboru lub braku funkcji antyproliferacyjnej [65, 69–71]. Najwięcej dowodów doświadczalnych uzyskano dla upośledzenia funkcji supresorowej białka p16.

Zwrócono także uwagę na gen supresorowy FHIT, zlokalizowany w krótkim ramieniu chromosomu 3 w pobliżu łamliwego miejsca tego chromosomu. Wydaje się, że łamliwość tego regionu wyłącza funkcjonowanie genu FHIT, a ma to miejsce szczególnie często w nowotworach głowy i szyi [72, 73].



Nie ma zgodności poglądów na temat roli genu supresorowego Rb1. Chociaż funkcja supresorowa tego białka została opisana w siatkówczaku już dawno [52, 53], to badania utraty heterozygotyczności oraz delecji w regionie chromosomu 13, kodującym ten gen przynoszą sprzeczne wyniki. Porównanie delecji w grupie chorych na raka krtani i określenie najmniejszego wspólnego deletowanego regionu techniką porównawczej hybrydyzacji genomów (ang. comparative genomic hybridization – CGH) zdawało się wskazywać, że locus Rb1 pozostaje poza tym regionem. Jednak zastosowanie bardziej precyzyjnej techniki fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) nie tylko potwierdziło rolę genu Rb1 w progresji nowotworów krtani, ale wskazało na udział tego właśnie genu w przechodzeniu do fazy przerzutów do okolicznych węzłów chłonnych, chociaż w pobliżu są zlokalizowane inne prawdopodobne geny supresorowe [74].

Również w kategoriach działania pro- i antyonkogennego rozpatruje się geny kodujące białka uczestniczące w procesie programowanej śmierci komórki, czyli apoptozy. Jak już wspomniano przy omawianiu genu p53, rolą tego procesu jest eliminacja komórek zawierających uszkodzony materiał genetyczny. Gen bcl-2 działa hamująco na apoptozę, a gen bax przyspiesza ten proces. Określenie ekspresji obu tych genów u pacjentów z rakiem krtani wykazało dobrą korelację z parametrami klinicznymi i ekspresją p53, co pozwala sugerować ich wykorzystanie jako niezależnych markerów prognostycznych [75].

Szczególnie cenne w tej dziedzinie są równoległe badania ekspresji protoonkogenów i genów supresorowych, bowiem dopiero wypadkowa przeciwstawnych aktywności obu grup genów decyduje o progresji choroby [52, 53, 65].


Aberracje chromosomów w przebiegu choroby nowotworowej

Informacji o znaczeniu protoonkogenów i genów supresorowych nie można omawiać w oderwaniu od przeglądu aberracji chromosomowych. W głównej mierze wiąże się to z faktem, że znaczącą część ustaleń na temat zmian struktury i funkcji genomu dokonano albo ze wskazań albo metodami cytogenetyki. W tym miejscu należy zaznaczyć, że cytogenetyka konwencjonalna w ostatnich latach zyskała nowy zasięg poznawczy dzięki wprowadzeniu metod molekularnych (ryc. 5.). Największy postęp uzyskano dzięki technice fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH), malowaniu chromosomów oraz porównawczej hybrydyzacji genomów (ang. comparative genomic hybridization – CGH). Podstawową nową jakością jest osiągnięcie znacznie lepszej zdolności rozdzielczej, co pozwala na coraz bardziej precyzyjną ocenę wszelkich uszkodzeń chromosomów.




Podstawowe pojęcia cytogenetyczne:

– chromosom – stopień organizacji materiału genetycznego stanowiący kompleks DNA i białek, widoczny w mikroskopie świetlnym podczas podziału komórkowego; chromosomy są zbudowane z ramion długich i krótkich, łączących się w przewężeniu pierwotnym zwanym centromerem,

– kariotyp – zestaw wszystkich chromosomów cechujących dany organizm, do celów porównawczych przyjęto stosowanie zapisu graficznego uporządkowanego wg ustalonych zasad,

– aberracja chromosomowa – jakakolwiek nieprawidłowość liczby lub struktury chromosomu (-ów).

Prawidłowy kariotyp człowieka stanowi 46 chromosomów złożonych z 22 par autosomów oraz dwóch chromosomów płciowych, co daje zapis 46, XX dla kobiety i 46, XY dla mężczyzny.




W odróżnieniu od hematologicznych chorób nowotworowych, gdzie dopracowano się dosyć przejrzystego obrazu uszkodzeń chromosomów, cytogenetyka guzów litych nie ma tak jednoznacznych ustaleń z racji mnogości, stopnia skomplikowania oraz zmienności profilu uszkodzeń w przebiegu choroby nowotworowej. Dlatego tylko w nielicznych guzach litych udaje się wskazać aberrację chromosomową, typową dla danej jednostki chorobowej. Przykładem jest translokacja regionu q24, q12 między chromosomami 11 a 22 w guzie Ewinga czy translokacja regionu p11, q11 między chromosomem płciowym X a autosomem 18 w maziówczaku złośliwym. W tej sytuacji w nowotworach głowy i szyi pozostaje poszukiwanie najczęstszych aberracji chromosomowych i odnoszenie ich do opisu klinicznego [76].



W nowotworach głowy i szyi najczęściej występują następujące aberracje: amplifikacje 3q, 8q, 9q, 20q, 7p, 11q13, i 5p, delecje 3p, 9p, 21q, 5q, 13q, 18q i 8p oraz miejsca łamliwe 1p36, 3p21, 8p11 [1, 77]. Próbowano korelować występowanie aberracji chromosomowych z ekspozycją na dym tytoniowy. Uzyskano przekonywujący dowód związku między tą ekspozycją a indukcją aberracji dla utraty krótkiego ramienia chromosomu 3 lub jego fragmentu [78, 79] i 8q [80]. W przypadku chromosomu 3p stwierdzono podwyższoną wrażliwość tego regionu na działanie szeregu mutagenów [78] i asocjację z występowaniem raka płuc [79]. Natomiast badania dotyczące chromosomu 8, przeprowadzone na liniach komórkowych, wykazały obecność izochromosomu 8q, co prowadzi do zwiększenia ekspresji onkogenu c-myc [80].

Ponieważ cytogenetyka nowotworów, w tym również nowotworów głowy i szyi jest przedmiotem licznych opracowań (również w języku polskim) [76, 77, 81], dlatego omówienie zostanie zawężone do aberracji chromosomowych towarzyszących przebiegowi choroby nowotworowej i (potencjalnie) pełniących rolę markerów prognostycznych.

- Utrata regionu 9p21 jest najczęstszą obserwowaną aberracją chromosomową w nowotworach głowy i szyi. W tym regionie zlokalizowano kilka genów supresorowych (p15, p16, p18, p19) kodujących białka będące inhibitorami kinaz zależnych od cykliny. Delecja tego regionu prowadzi do utraty kontroli nad cyklem komórkowym i jest wczesnym wydarzeniem w cyklu transformacji nowotworowej. Ta aberracja jest wykrywana głównie w pierwotnych nowotworach [82–84].

- Utratę długiego ramienia chromosomu 18 stwierdzano co najmniej w 60% badanych przypadków. Występowanie tej aberracji nie jest ograniczone do nowotworów głowy i szyi. Można przypuszczać, że zlokalizowane w tym regionie geny są odpowiedzialne za powstawanie i progresję różnych typów nowotworów. Przy zastosowaniu technik CGH oraz analizy heterozygotyczności zidentyfikowano 3 regiony najczęściej deletowane w nowotworach głowy i szyi wskazując na obecność trzech różnych genów supresorowych. Wysoki poziom utraty 18q jest złym wskazaniem prognostycznym, bowiem wykrywany jest głównie w wysoko odróżnicowanych nowotworach i wskazuje na szybką wznowę [85–87].

- Amplifikacja regionu 11q13 (ryc. 6.) cechuje przede wszystkim zaawansowane etapy choroby oraz stopień histologiczny G3. Gen CCND1 koduje cyklinę D1 odpowiedzialną za przejście komórki z fazy G1 do S i pośrednio wpływa negatywnie na wydajność procesu naprawy DNA. Mechanizm, za którego udziałem amplifikacja 11q13 zwiększa progresję i wpływa na inwazyjność nowotworu nie jest jasny. W każdym razie wartość diagnostyczna ilościowej oceny amplifikacji 11q13 jest bardzo duża, a wysoki poziom amplifikacji jest bardzo złym czynnikiem rokowniczym [87, 88].

- Chromosom 3 ulega najsilniejszym rearanżacjom spośród wszystkich chromosomów somatycznych poprzez częstą utratę ramienia krótkiego i amplifikację ramienia długiego. Najmniejszy amplifikowany region 3q26–q27 zawiera protoonkogen AIS, któremu przypisuje się rolę w transformacji nowotworowej. Natomiast w ramieniu krótkim uwagę zwracają 3 subregiony w regionie 3p12–p21. Występuje tu m.in. gen supresorowy FHIT (3p14.2). Ponadto utratę 3p notowano w komórkach dysplastycznych, co sugeruje udział tego regionu we wczesnych etapach kancerogenezy [87, 89, 90].

- Utrata 13q przyciąga uwagę, ponieważ w regionie 13q14 znajduje się gen supresorowy Rb1. W badaniach własnych prowadzonych w oparciu o technikę CGH stwierdzono częstą utratę tego regionu, zarówno w guzach pierwotnych nieprzerzutowych, jak i nasilenie tej aberracji w guzach dających przerzuty do okolicznych węzłów chłonnych [91]. Potwierdzenie udziału genu supresorowego Rb1 w progresji nowotworu krtani neguje rolę znajdującego się w pobliżu (13q34) genu supresorowego ING1. Jest to zgodne z wykazaniem braku mutacji w genie ING1 u chorych na nowotwory głowy i szyi, co świadczy o niezaangażowaniu tego genu w progresję tego typu nowotworów [92]. Wobec przeciwstawnych wyników innego zespołu dowodzącego występowania nonsensownych mutacji (prowadzących do syntezy niefunkcjonalnego białka) w genie ING1 sprawa wymaga dalszych badań [93].

- Utrata chromosomu płciowego Y ma miejsce w wielu guzach litych, a w tym w nowotworach głowy i szyi [94, 95]. Chociaż u starszych mężczyzn obserwuje się pewien ubytek tego chromosomu, m.in. w leukocytach krwi obwodowej, to ubytek nie przekracza kilkunastu promili [96]. Natomiast w komórkach guza krtani u większości pacjentów obserwowano w badaniach własnych całkowitą utratę tego chromosomu (ryc. 7.). Podobnie obserwacje zanotowano przy kariotypowaniu linii komórkowych wyprowadzonych z raka krtani (M. Kujawski, M. Jarmuż – manuskrypt w przygotowaniu). Utrata tego chromosomu pozostaje niezrozumiała, bowiem chromosom Y jest ubogi informacyjnie. Nie można jednak wykluczyć obecności genów supresorowych. Ponadto w chromosomie Y wykryto gen kodujący białko związane z adhezją, a więc można spekulować na temat wpływu utraty Y na odrywanie się komórek od podścieliska. Próbowano też odnosić utratę Y do dysproporcji zachorowalności mężczyzn i kobiet na nowotwory krtani [82, 94].


Porządkowanie informacji o aberracjach chromosomowych doprowadziło także do rozpatrywania dynamiki uszkodzeń chromosomów, a więc zmienności profilu aberracji wraz z przebiegiem choroby. Jak już wykazano wyżej, pewne uszkodzenia dają się dosyć ściśle przypisać etapom choroby. Na podstawie analizy dotychczasowych ustaleń zaproponowano kilka modeli, korelujących pojawianie się uszkodzeń chromosomów z przebiegiem choroby. Na użytek nowotworów głowy i szyi najlepiej został przyjęty model Califano skonstruowany w zespole D. Sidransky’ego [98, 99]. Ta propozycja stała się punktem wyjścia wielu badań. Wysiłki skupiono m.in. na próbach identyfikacji chromosomu markerowego etapu przechodzenia guza w fazę przerzutów. Kwestia ta nie została do dzisiaj rozwiązana.


Uwagi końcowe

Prowadzone od lat badania nad genetyką i biologią molekularną nowotworów głowy i szyi przyniosły ogromną wartość poznawczą [1, 4]. Jednym z ważniejszych ustaleń pozostaje stwierdzenie akumulacji uszkodzeń materiału genetycznego w progresji choroby nowotworowej, która od pewnego etapu rozwija się samoczynnie, nawet w warunkach ustania ekspozycji na kancerogeny (ryc. 8.).



Użyteczność badań genetycznych i biologicznych pozostaje jeszcze ciągle ograniczona. Przykładem może być ocena ryzyka genetycznego wystąpienia raka głowy i szyi. Niewielki wzrost ryzyka towarzyszący defektom genów niskiej penetracji przy dużej liczbie tych genów praktycznie uniemożliwia prowadzenie szerokiego screeningu ze względów organizacyjnych i kosztów badań. Natomiast rozpoznanie szeregu markerów na poziomie genów, ich produktów genowych, a zwłaszcza aberracji chromosomowych pozwala na stosowanie ich w charakterze markerów przebiegu choroby i prognozy. Na etapie badań modelowych oraz I fazy są protokoły terapii genowej [7].


Piśmiennictwo

1. Sidransky D. Molecular genetics of head and cancer. Current Opinion Oncol 1995; 7: 229-233.

2. Szyfter K, Jaskuła-Sztul R, Kujawski M, Kita S, Jarmuż M, Dąbrowski P. Czynnik genetyczny w raku krtani. Post Biol Kom 1998; 25, supl. 10: 123-136.

3. Papadimitrakopoulou VA, Shin DM, Hong WK. Molecular and cellular biomarkers and multistep process in head and neck tumorigenesis. Cancer Metast Rev 1996; 15: 53-76.

4. Szyfter K, Szmeja Z, Szyfter W, Hemminki K, Banaszewski J, Jaskuła-Sztul R, Louhelainen J. Molecular and cellular alterations in tobacco smoke-associated larynx cancer. Mutat Res 1999; 445: 259-274.

5. Petruzzelli GJ. The biology of tumor invasion, angiogenesis and lymph node metastasis. ORL 2000; 62: 178-185.

6. Petruzzelli GJ. The biology of distant metastases in head and neck cancer. ORL 2001; 63: 192-201.

7. Partridge K. Current status of genetics for prediction, prognosis and gene therapy. Cur Opinion Otolar Head Neck Surg 2000; 8: 69-79.

8. Au WW, Oh HY, Grady J, Salama SA, Heo MY. Usefulness of genetic susceptibility and biomarkers for evaluation of environmental
health risk. Environ Molec Mutagenesis 2001; 37: 215-223.

9. International Agency for Research on Cancer. Tobacco smoking. IARC, Lyon 1995.

10. Zatoński W, Becher H, Lissowska J, Wahrendorf J. Tobacco, alcohol and diet in the etiology of laryngeal cancer: a population based case-control study. Cancer Cause & Control 1991; 2: 3-10.

11. Copper MP, Jovanovic A, Nauta JJP, Braakhuis BJM, de Vries M, van der Waal I, Snow GB. Role of genetic factors in the etioloy of squamous cell carcinoma of the head and neck. Arch Otolaryng Head Neck Surg 1995; 121: 157-160.

12. Bondy ML, Spitz MR, Halabi S, Feuger JJ, Schantz SP, Sample D, Hsu TC. Association between family history of cancer and mutagen sensitivity in upper aerodigestive tract cancer patients. Cancer Epidemiol Biomark Prevent 1993; 2: 103-106.

13. Yu GP, Zhang ZF, Hsu TC, Spitz MR, Schantz SP. Family history of cancer. mutagen sensitivity, and increased risk of head and neck cancer. Cancer Lett 1999; 146: 93-101.

14. Jarmuż M, Szyfter K. Zastosowanie testu bleomycynowego do określania predyspozycji genetycznej do zachorowania na nowotwory. Wsp Onkol 1999; 3: 188-190.

15. Spitz MR, Hoque A, Trizna Z, Schantz SP, Amos ChI, King TM, Bondy ML, Hong WK, Hsu TC. Mutagen sensitivity as a risk factor for second malignant tumors following malignancies of the upper aerodigestive tract. J Natl Cancer Inst 1994; 86: 1681-1684.

16. Spitz MR, Lippman SM, Jiang H, Lee JJ, Khuri F, Hsu TC, Trizna Z, Benner S, Hong WK. Mutagen sensitivity as a predictor of tumor recurence in patients with cancer of the upper aerodigestive tracts. J Nat Cancer Inst 1998; 90: 243-245.

17. Schantz SP, Hsu TC, Ainslie N, Moser RP. Young adults with head and neck cancer express increased susceptibility to mutagen-induced chromosome damage. JAMA 1989; 262: 3313-3315.

18. Cloos JM, Nieuwenhuis EJC, Boomsma DI, Kuik DJ, van der Sterre MLT, Arwer F, Snow GB, Braakhuis BJM. Inherited susceptibility to bleomycin-induced chromatid breaks in cultured peripheral blood lymphocytes. Review. J Natl Cancer Inst 1999; 91: 1125-1130.

19. Kręcicki T, Schlade K, Blin N, Sąsiadek M. Chromosome instability in head and neck cancer patients. Oncol Rep 1997; 4: 1383-1385.

20. Pandita TK, Hittelman WN. Evidence of a chromatin basis for increased mutagen sensitivity associated with multiple primary malignancies of the head and neck. Int J Cancer 1995; 61: 738-743.

21. Kleinsasser NH, Wallner BC, Kastenbauer ER, Muenzerieder RK, Harreus UA. Comparing the genotoxic sensitivities of human peripheral blood lymphocytes and mucosa cells of the upper aerodigestive tract using the comet assay. Mutat Res 2000; 467: 21-30.

22. Bermudez E, Stone K, Carter KM, Pryor WA. Environmental tobacco smoke is just as damaging to DNA as mainstream smoke. Environ Health Perspect 1994; 102: 870-874.

23. Gray JW, Collins C. Genome changes and gene expression in human solid tumors. Carcinogenesis 2000; 21: 443-452.

24. Shields PG, Harris CC. Principles of carcinogenesis: Chemical. In: Cancer: Principles & Practice of Oncology, V. T. DeVita, S. Hellman, S. A. Rosenberg (red.), wyd. 4, J. B. Lippincott Co, Philadelphia 1993.

25. Marnett L. Oxyradicals and DNA damage. Carcinogenesis 2000; 21: 361-370.

26. Stern SJ, Degawa M, Martin MV, Guengerich FP, Ilett KF, Kaderlik RK, Breau R, McGheeM, Montague D, Lyn-Cook B, Kadlubar FF. Metabolic activation, DNA adducts, and H-ras mutations in human neoplastic and non-neoplastic laryngeal tissue. J Cell Biochem 1993; suppl. 17F: 129-137.

27. Szyfter K, Hemminki K, Szyfter W, Szmeja Z, Banaszewski J, Yang K. Aromatic DNA adducts in larynx biopsies and leukocytes. Carcinogenesis 1994; 15: 2195-2199.

28. Szyfter K, Hemminki K, Szyfter W, Szmeja Z, Banaszewski J, Pabiszczak M. Tobacco smoke-associated N7-alkylguanine in DNA of larynx tissue and leukocytes. Carcinogenesis 1996; 77: 501-506.

29. Phillips DH. Detection of DNA modifications by the 32P-postlabelling assay. Mutat Res 1997; 378: 1-12.

30. Pabiszczak M, Banaszewski J, Szmeja Z, Szyfter K, Szyfter W. Porównanie poziomu adduktów kancerogen: DNA w rakach jamy ustnej, gardła i krtani. Otolaryng Pol 2001; 45: 551-554.

31. Flamini G, Romano G, Curigliano G, Chiominto A, Capelli G, Boninsegna A, Signorelli C, Ventura L, Santella RM, Sgambato A, Cittadini A 4-aminobiphenyl-DNA adducts in laryngeal tissue and smoking haits: an immunohistochemical study. Carcinogenesis 1998; 19: 353-357.

32. Paine AJ. Heterogeneity of cytochrome P450 and its toxicological significance. Human ExpToxicol 1995; 14: 1-7.

33. Houlston RS, Tomlinson IPM. Detecting low penetrance genes in cancer: The way ahead. J Med Genet 2000; 37: 161-167.

34. Olshan AF, Weissler MC, Watson MA, Bell DA. GSTM1, GSTT1, GSTP1, CYP1A1 and NAT1 polymorphisms, tobacco use and the risk of head and neck cancer. Cancer Epidemiol Biomark Prevent 2000; 9: 185-191.

35. Strange RS, Spiteri MA, Ramachandran S, Fryer AA. Glutathione S-transferase family of enzymes. Mutat Res 2001; 482: 21-26.

36. Sancar A. DNA repair in human. Annual Rev Genet 1995; 29: 69-105.

37. Degawa M, Stern SJ, Martin MV, Guengerich FP, Fu PP, Ilett KF, Kaderlik RK, Kadlubar FF. Metabolic activation and carcinogen-DNA adduct detection in human larynx. Cancer Res 1994; 54: 4915-4919.

38. Jahnke V, Strange R, Matthias C, Fryer A. Glutathione S-transferase and cytochrome P450 genotypes as risk factors for laryngeal carcinoma. Eur Arch Otorhinolaryg 1997; 254, suppl. 1: S147-S149.

39. Benhamou S, Bouchardy Ch, Paoletti C, Dayer P. Effects of CYP2D6 activity and tobacco on larynx cancer risk. Cancer Epidemiol Biomark Prevent 1996; 5: 683-686.

40. Agundez JAG, Gallardo L, Ledesma MC, Locano L, Rodriquez-Lescure A, Pontes JC, Iglesias-Moreno MC, Poch J, Ladero Jm, Benitez J. Functionally active duplications of the CYP2D6 are more prevalent among larynx and lung cancer patients. Oncology 2001; 61: 59-63.

41. Szyfter K, Jaskuła-Sztul R, Banaszewski J, Möller L, Szyfter W, Szmeja Z. Wykazanie roli czynnika genetycznego w raku krtani na podstawie analizy genotypów enzymów detoksykacyjnych. Wsp Onkol 1998; 7, 159-161.

42. Jaskuła-Sztul R, Husgafvel-Pursiainen K, Reinikainen M, Hirvonen A, Szmeja Z, Szyfter W, Szyfter K. Glutathione S-transferase M1 and T1 genotypes and susceptibility to smoking related larynx cancer. Biomarkers 1998; 3: 149-155.

43. Johns LE, Houlston RS. GSTM1 status and bladder cancer risk: a meta analysis. Mutagenesis 2000; 15: 399-404.

44. Jourenkova-Mironova N, Voho A, Bouchardy Ch, Wikman H, Dayer P, Benhamou S, Hirvonen A. Glutathione S-transferase GSTM3 and GSTP1 genotypes and larynx cancer risk. Cancer Epidemiol Biomark Prevent 1999; 8: 185-188.

45. Shen H, Sturgis M, Khan SG, Qiao Y, Eicher SA, Xu Y, Wang X, Stom SS, Spitz MR, Kraemer KH, Weo Q. An intronic poly (AT) polymorhism of the DNA repair gene XPC and risk of scc of the head & neck: A case-control study. Cancer Res 2001; 61: 3321-3225.

46. Matullo G, Palli D, Peluso M, Guarrera S, Carturan S, Celentano E, Krogh V, Munnia A, Tumino R, Polidoro S, Piazza A, Vineis P. XRCC1, XRCC3, XPD gene polymorphisms, smoking and 32P-DNA adducts in a healthy subjects. Carcinogenesis 2001; 22: 1437-1445.

47. Butkiewicz D, Rusin M, Enewold L, Shields PG, Chorąży M, Harris CC. Genetic polymorphisms in DNA repair genes and risk of lung cancer. Carcinogenesis 2001; 22: 593-597.

48. Cascorbi I, Henning S, Brockmőller J, Gephart J, Meisel Ch, Műller JM, Loddenkemper R, Roots I. Substantialy reduced risk of caner of the aerodigestive tract in subjects with variant of the myeloperoxidase gene. Cancer Res 2000; 60: 644-649.

49. Wojtukiewicz M, Sierko E. Alkohol a nowotwory. Nowotwory 2000; 50: 39-47.

50. Bouchardy C, Hirvonen A, Coutelle Ch, Ward PJ, Dayer P, Benhamou S. Role of dehydrogenase 3 and cytochrome P-4502E1 genotypes in susceptibility to cancers of the upper aerodigestive tract. Int J Cancer 2000; 87: 734-740.

51. Olshan AF, Weissler MC, Watson MA, Bell DA. Risk of head and neck cancer and the alcohol dehydrogenase 3 genotype. Carcinogenesis 2001; 22: 57-61.

52. Knudson AG. Overview: Genes that predispose to cancer. Mutat Res 1991; 247: 185-190.

53. Bos JJ, van Kreiji CF. Genes and gene products that regulate proliferation and differentiation: critical targets in carcinogenesis. In: Mechanisms of Carcinogenesis in Risk Identification, H. Vainio, P. N. Magee, D. B. McGregor, A. J. McMichael (red.), Lyon, International Agency for Research on Cancer 1992.

54. A. Jones AS. Tumour suppressor genes and head and neck cancer. W: Genetics in Otorhinolaryngology, K. Kitamura & K.P. Steel (red.), Adv Otorhinolaryngol, Karger, Basel 2000; 249-260.

55. Davenport MP, Ward RL, Hawkins NJ. The null oncogene hypothesis and protection from cancer. J Med Genet 2001; 39: 12-15.

56. Tomlinson IPM, Roylance R, Houlston RS. Two hits revisited again. J Med Genet 2001; 38: 81-85.

57. Boland CR, Ricciardello L. How many mutations does it take to make a tumor? Proc Nat Acad Sci US 1999; 96: 14675-14677.

58. Loeb KR, Loeb LA. Significance of multiple mutations in cancer. Carcinogenesis 2000; 21: 379-385.

59. Loeb LA. A mutator phenotype in cancer. Cancer Res 2001; 61: 3230-3239.

60. Nathan ChA, Sanders K, Abreo FW, Nassar R, Glass J. Correlation of p53 and the proto-oncogene eIF4E in larynx cancer: prognostic implications. Cancer Res 2000; 60: 3599-3604.

61. Gasparotto D, Maestro R, Piccinin S, Vukosavljevic T, Barzan L, Doglioni C, Sulfaro S, Boiocchi M. Overexpression of CDC25A and CDC25D in head and neck cancers. Cancer Res 1997; 57: 2366-2368.

62. Resto VA, Cabalerro Ol, Buta MR, Westra WH, Westendorf JM, Jen J, Hieter Ph, Sidransky D. A putative oncogenic role for MP11 in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Res 2000; 60: 529-5535.

63. Sommers KD, Merrick MA, Lopez ME, Incognito LS, Schechter GL, Casey G. Frequent p53 mutations in head and neck cancer. Cancer Res 1992; 52: 5997-6000.

64. Sauter ER, Ridge JA, Trock B, Cleveland D, Whitley KV, Mohr RM. Klein-Szanto A. Overexpression of the p53 gene in primary and metastatic head & neck carcinomas. Laryngoscope 1995; 105: 653-656.

65. Sherr ChJ. Cancer cell cycles. Science 1996; 274: 1672-1677.

66. Brennan JA, Boyle JO, Koch WM, Goodman SN, Hruban RH, Eby YJ, Couch MJ, Forastiere AA, Sidransky D. Association between cigarette smoking and mutation in the p53 gene in scc of the head and neck. N Engl J Med 1995; 332: 712-717.

67. Law JC, Whiteside T, Gollin SM, Weissfeld J, EL-Ashmawy L, Srivastava S, Landreneau RJ, Johnson JT, Ferrell RE. Variation of p53 mutational spectra between carcinoma of the upper and lower respiratory tract. Clin Cancer Res 1995; 1: 763-768.

68. Gasparotto D, Maestro R, Barzan L, Vukosavljevic T, Doglioni C, Sulfaro S, Piccinin S, Boiocchi M. Recurrences and second primary tumors in the head and neck region: Differentiation by p53 mutation analysis. Ann Oncol 1995; 6: 933-939.

69. Reed AL, Califano J, Cairns P, Westra WH, Jones RM, Koch W, Shrendt S, Eby Y, Sewell D, Nawroz H, Bartek J, Sidransky D. High frequency of p16 (CDKN2/MTS-1/INK4A) inactivation in head and neck squamous cell carcinoma, 1996.

70. Liggett WH, Sewell DA, Rocco J, Ahrendt SA, Koch W, Sidransky D. p16 and p16 bare potent growth suppressors of head and neck squamous cells in vitro. Cancer Res 1996; 56: 4119-4123.

71. Erber R, Klein W, Andl Th, Ender Ch, Born AL, Conradt Ch, Bartek J, Bosch FX. Aberrant p21 protein accumulation in head-and-neck cancer. Int J Cancer 1997; 74: 383-389.

92. Sanchez-Cespedes M, Okami K, Sidransky D. Molecular analysis of the candidate tumor supressor gene ING1 in human head and neck tumors with 13q deletions. Genes Chromosom Cancer 2000; 27: 319-322.

93. Gunduz M, Ouchida M, Fukushima K, Hanafusa H, Etani T, Nishioka S, Nishizaki K, Shimizu K. Genomic structure of human ING1 gene and tumor-specific mutations detected in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Res 2000; 60: 3143-3146.

94. Khaled HM, Aly MS, Magrath IT. Loss of Y chromosome in bilharzial bladder cancer. Cancer Genet Cytogenet 2000; 117: 32-36.

95. Jordan JJ, Hanlon AL, Al-Saleem TI, Greenberg RE, Tricoli JV. Loss of the short arm of the Y chromosome in human prostate carcinoma. Cancer Genet Cytogenet 2001; 124: 122-126.

96. Bukvic N, Gentile M, Susca F, Fanelli M, Serio G, Buonadonna L, Capursa A, Guanti G. Sex chromosome loss, micronuclei, SCE and aging: a study including 16 centenarians. Mutat Res 2001; 498: 159-167.

97. Califano J, van der Riet P, Westra W, Nawroz H, Clayman G, Piantadosi S, Corio R, Lee D, Greenberg B, Koch W, Sidransky D. Genetic progression model for head and neck cancer: implications for field cancerization. Cancer Res 1996; 56: 2488-2492.

98. Califano J, Westra W, Meininger G, Corio R, Koch W, Sidransky D. Genetic progression and clonal relationship of recurrent premalignant head and neck lesions. Clin Cancer Res 2000; 6: 347-352.


Adres do korespondencji

prof. dr hab. med. Krzysztof Szyfter

Zakład Genetyki Człowieka PAN

ul. Strzeszyńska 32

60-479 Poznań

tel. (061) 823 30 11, fax (061) 823 32 35

e-mail: szyfkris@rose.man.poznan.pl