Ser326Cys polymorphism of hOGG1 gene in postmenopausal breast cancer women from the Lodz region of Poland

Wstęp
Rak piersi jest nowotworem złośliwym najczęściej występującym u kobiet. Zagrożenie zachorowania rośnie wraz z wiekiem, szczególnie po menopauzie. Bardziej narażone są kobiety, u których występował rak piersi u krewnych pierwszego stopnia (matka, siostra), szczególnie gdy zachorowanie wystąpiło w okresie przed przekwitaniem.
Wiadomo, że wady w mechanizmie naprawy DNA mogą być przyczyną procesu transformacji nowotworowej także w piersi. Powodzenie naprawy DNA zależy od wielu czynników, w tym typu i wieku komórki oraz środowiska pozakomórkowego. W komórce, w której duża ilość DNA uległa uszkodzeniu albo której mechanizmy naprawy DNA nie są wystarczająco efektywne, mogą zajść:
• nieodwracalny stan wygaśnięcia aktywności komórki – starzenie się komórki,
• samobójcza śmierć komórki, czyli apoptoza,
• niekontrolowane podziały prowadzące do powstania nowotworu.
Zdolność komórki do naprawy własnego DNA jest istotna dla integralności fizycznej całego genomu oraz integralności informacji genetycznej, którą niesie, a więc i do prawidłowego funkcjonowania całego organizmu [1–3].
Znanych jest pięć głównych mechanizmów naprawy DNA – naprawa bezpośrednia, naprawa przez wycinanie zasady (base excision repair – BER), naprawa przez wycinanie nukleotydu (nucleotide excision repair – NER), naprawa niesparowanych zasad (mismatch repair – MMR) i naprawa rekombinacyjna.
Naprawa bezpośrednia koryguje wady pojedynczych zasad uszkodzonych przez oksydację, alkilację, hydrolizę czy deaminację. Oksydacyjne uszkodzenia DNA, które zwiększają ryzyko raka piersi, mogą być generowane przez reaktywne formy tlenu powstające w wyniku metabolizmu estrogenów [4, 5]. Sugeruje się, że 8-hydroksyguanina, główny produkt oksydacyjnych uszkodzeń DNA, odgrywa ważną rolę w kancerogenezie i procesach mutagenezy [6]. 8-Hydroksyguanina jest usuwana w wyniku mechanizmu BER przez enzym glikozylazę DNA 8-oksoguaniny (hOGG1), katalizując uwalnianie 8-hydroksy-2’-deoksyguanozyny i przecięcie DNA w miejscu AP [6, 7]. W eksonie 7 genu hOGG1 zidentyfikowano polimorfizm Ser326Cys [8, 9]. Wiadomo, że allel Cys redukuje aktywność naprawczą DNA [8] i może być związany z ryzykiem raka płuc, prostaty, przełyku i żołądka [9]. Badania epidemiologiczne polimorfizmu genu hOGG1 odnośnie do raka piersi są nieliczne i dotyczą niewielkich populacji [10, 11].
W prezentowanej pracy badano polimorfizm Ser326Cys genu hOGG1 u chorych na raka piersi w wieku pomenopauzalnym.

Materiał i metody
Pacjenci
Krew do badań uzyskano od 100 kobiet chorych na raka piersi w wieku pomenopauzalnym z przerzutami (n = 58) i bez przerzutów (n = 42) do okolicznych węzłów chłonnych. Pacjentki były w wieku 54–82 lat (średnia wieku 58 lat). Średni rozmiar guza wynosił 20 mm (17–32 mm). Wszystkie nowotwory sklasyfikowano wg skali Scarffa-Blooma-Richardsona (14 nowotworów I stopnia, 64 – II stopnia i 22 – III stopnia). Jako kontrolę zastosowano krew uzyskaną od kobiet (n = 106), u których nie stwierdzono choroby nowotworowej.
Izolacja DNA
Genomowy DNA był izolowany z 200 µl pełnej krwi z zastosowaniem zestawu QIAamp DNA Blood Mini Kits (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) zgodnie z zaleceniami producenta.
PCR-RFLP
Polimorfizm Ser326Cys genu hOGG1 został określony z zastosowaniem reakcji PCR-RFLP, przy użyciu odpowiednio dobranych starterów (5’-GGAAGGTGCTTGGGGAAT-3’ i 5’-ACTGTCACTAGTCTCACCAG-3’). Mieszanina reakcyjna (25 µl) obejmowała 100 ng DNA, 12,5 pmol każdego startera, 0,2 mmol/l dNTP, 2 mmol/l MgCl2 i 1 U polimerazy Taq DNA. Produkt PCR poddawano elektroforezie w 7-procentowym żelu poliakrylamidowym (PAGE) i barwiono bromkiem etydyny. Fragment długości 100 pz odpowiadał genotypowi Cys/Cys. W przypadku genotypu Ser/Cys obserwowano dwa pasma długości 100 i 200 pz, a Ser/Ser jedno pasmo długości 200 pz. Reakcja PCR została przeprowadzona w termocyklerze Thermal Cycler, GeneAmp PCR System 2400 (Perkin-Elmer, Norwalk, CT, U.S.A). Wstępna denaturacja w 95°C trwała 5 min, właściwe 35 cykli obejmowało denaturację w 95°C przez 30 s, hybrydyzację ze starterami 56°C przez 30 s, wydłużanie w 72°C przez 30 s. Produkt PCR trawiono 1 U enzymu SatI w 37°C.

Analiza statystyczna
Rejestrowana liczba każdego z genotypów była porównywana z liczbą oczekiwaną na podstawie prawa Hardy’ego-Weinberga z użyciem testu c2. Istotność różnic pomiędzy częstościami alleli i genotypów dla poszczególnych grup oceniana była testem c2; p < 0,05 było określane jako wynik statystycznie znaczący.

Wyniki
W tabeli I przedstawiono rozkład genotypów Ser i Cys w grupie badanej i kontrolnej. Oba rozkłady nie różniły się znacząco od przewidywanego przez prawo (p > 0,05) Hardy’ego-Weinberga. Poza tym nie było różnic w rozkładzie częstości alleli pomiędzy pacjentami (Ser – 0,49 i Cys – 0,51) i kontrolą (Ser – 0,43 i Cys – 0,57).
Rozkład genotypów Ser/Ser, Ser/Cys i Cys/Cys oraz częstości alleli Ser i Cys dla chorych z przerzutami i bez przerzutów do okolicznych węzłów chłonnych przedstawiono w tabeli II. Nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic w rozkładzie genotypów pomiędzy badanymi grupami (p > 0,05).
Badano także zależność rozkładu genotypów polimorfizmu Ser326Cys genu hOGG1 od stopnia zaawansowania nowotworu (tab. III). Nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic w badanych grupach (p > 0,05).

Dyskusja
System naprawy przez wycinanie zasad (BER) jest bardzo ważnym mechanizmem dla naprawy oksydacyjnych uszkodzeń DNA. Istnieje wiele genów należących do BER. Jednym z nich jest gen hOGG1 (8-oxoguanine glycosylase), który koduje glikozylazę 8-oksoguaniny, białko uczestniczące w szlaku naprawy DNA BER. Znajduje się w chromosomie 3 (3p26.2), zajmuje 16,68 kpz. Gen OGG1 ma kilka miejsc polimorficznych.
Polimorfizm C/G w pozycji 1245 w eksonie 7 genu hOGG1 jest związany z podstawieniem cysteiny do seryny w kodonie 326 [8]. Polimorfizm ten jest powszechny w populacji ludzkiej, stwierdzono jego występowanie u osób o różnej przynależności etnicznej. Częstość allela 1245 G jest wyższa w populacji chińskiej (64,1%) niż w japońskiej (40,5–43,3%), europejskiej (40%) czy kaukaskiej (24–26,5%), co wskazuje na różnice etniczne [8, 12, 13].
Powyższy polimorfizm genetyczny, zwany także Ser326Cys, jest często obserwowany w populacji japońskiej zarówno u osób zdrowych, jak i chorych na raka płuc [8]. Ten sam polimorfizm jest obserwowany z podobną częstością u pacjentów kontynentu europejskiego chorych na nowotwory głowy i szyi lub nerki [12].
W prezentowanej pracy przeprowadzonej na 100 chorych na raka piersi nie stwierdzono korelacji pomiędzy polimorfizmem Ser326Cys a występowaniem raka. Oprócz tego nie stwierdzono różnic w częstościach alleli pomiędzy grupą z przerzutami i bez przerzutów do okolicznych węzłów chłonnych, co sugeruje brak związku pomiędzy polimorfizmem a rozwojem raka piersi. Wyniki badań autorów niniejszej pracy potwierdzają analizy przeprowadzone na populacjach w Korei i Japonii [10] oraz wyniki uzyskane przez badaczy duńskich [11].
Mimo że niektóre badania nie wykazały różnic w aktywności obu wariantów, podstawienie Ser326Cys może wpływać na fosforylację białka i w konsekwencji, na jego działanie in vivo [14]. Ponieważ oba allele są obecne w populacji ze znaczną częstością, 326Cys prawdopodobnie cechuje się słabą penetracją, jego aktywność w warunkach braku stresu oksydacyjnego zdaje się wystarczać dla usuwania specyficznych uszkodzeń DNA i wobec tego nie jest eliminowany przez dobór naturalny.
Podsumowując, badany polimorfizm Ser326Cys genu hOGG1 może nie odgrywać istotnej roli w rozwoju raka piersi u polskich kobiet z regionu łódzkiego. Szerzej zakrojone badania nad funkcjonowaniem genu oraz epidemiologiczne są konieczne do zrozumienia relacji pomiędzy enzymami naprawy DNA a czynnikami środowiskowymi, które przyczyniają się do procesu transformacji nowotworowej.

Piśmiennictwo
1. Allan JM, Smith AG, Wheatley K, et al. Genetic variation in XPD predicts treatment outcome and risk of acute myeloid leukemia following chemotherapy. Blood 2004; 104: 3872-7.
2. Impact of genetic polymorphisms in DNA repair enzymes on drug resistance in lung cancer. Clin Lung Cancer 2004; 6: 79-82.
3. Chang-Claude J, Popanda O, Tan XL. Association between polymorphisms in the DNA repair genes XRCC1, APE1 and XPD and acute side effects of radiotherapy in breast cancer patients. Clin Cancer Res 2005; 11: 4802-9.
4. Roy D, Liehr JG. Estrogen, DNA damage and mutation. Mutat Res 1999; 424: 107-15.
5. Yoshie Y, Ohshima H. Synergistic induction of DNA strand breakage by catechol-estrogen and nitric oxide: implications for hormonal carcinogenesis. Free Radic Biol Med 1998; 24: 341-8.
6. Floyd RA. The role of 8-hydroxyguanine in carcinogenesis. Carcinogenesis 1990; 11: 1447-50.
7. Boiteux S, Radicella JP. The human OGG1 gene: structure, functions, and its implication in the process of carcinogenesis. Arch Biochem Biophys 2000; 377: 1-8.
8. Kohno T, Shinmura K, Tosaka M, et al. Genetic polymorphisms and alternative splicing of the hOGG1 gene, that is involved in the repair of 8-hydroxyguanine in damaged DNA. Oncogene 1998; 16: 3219-25.
9. Weiss JM, Goode EL, Ladiges WC, Ulrich CM. Polymorphic variation in hOGG1 and risk of cancer: a review of the functional and epidemiologic literature. Mol Carcinog 2005; 42: 127-41.
10. Choi JY, Hamajima N, Tajima K, et al. hOGG1 Ser326Cys polymorphism and breast cancer risk among Asian women. Breast Cancer Res Treat 2003; 79: 59-62.
11. Vogel U, Nex/o BA, Olsen A, et al. No association between OGG1 Ser326Cys polymorphism and breast cancer risk. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2003; 12: 170-1.
12. Blons H, Radicella JP, Laccourreye O, et al. Frequent allelic loss at chromosome 3p distinct from genetic alternations of the 8-oxoguanine DNA glycosylase 1 gene in head and neck cancer. Mol Carcinog 1999; 26: 254-60.
13. Hardie LJ, Briggs JA, Davidson LA, et al. The effect of hOGG1 and glutathione peroxidase I genotypes and 3p chromosomal loss on 8-hydroxydeoxyguanosine levels in lung cancer. Carcinogenesis 2000; 21: 167-72.
14. Gros L, Saparbaev MK, Laval J. Enzymology of the repair of free radicals-induced DNA damage. Oncogene 2002; 21: 8905-25.