Serological, biochemical and virological profile of chronic hepatitis B virus infection in children

Wprowadzenie

Historia naturalna zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B (hepatitis B virus – HBV) zależy od wieku, w którym doszło do zakażenia. U osób immunokompetentnych po 28–180-dniowym okresie wylęgania dochodzi do ostrego, objawowego lub bezobjawowego zapalenia wątroby, które po 6–7 mies. zwykle kończy się pełnym wyzdrowieniem. Jeśli do zakażenia dochodzi drogą wertykalną lub inną (parenteralną, horyzontalną) w pierwszych latach życia, z uwagi na niedobory odporności, a zwłaszcza niesprawne mechanizmy odporności nieswoistej – wrodzonej, rozwija się przewlekłe zakażenie, które w zależności od immunokompetencji zakażonego organizmu i właściwości wirusa (genotyp, obecność mutacji) może przebiegać od utajonego zakażenia (serokonwersja w układzie HBs, ale obecny HBV-DNA w hepatocytach), po cztery opisane poniżej fazy zakażenia, które w przypadkach stale wysokiej replikacji wirusa mogą prowadzić do pozapalnej marskości wątroby i raka wątrobowokomórkowego.

Szacuje się, że przewlekłe zakażenie HBV rozwija się u 90% zakażonych w okresie noworodkowym, u ok. 30% zakażonych w 1.–5. roku życia i u 10% zakażonych w wieku powyżej 6 lat [1].

Według wirusologicznej klasyfikacji przewlekłego zakażenia HBV wyróżnia się następujące fazy [2, 3]:

• fazę tolerancji immunologicznej charakteryzującą się obecnością HBsAg i HBeAg, wysokimi wartościami wiremii HBV-DNA (106–109 kopii/ml), niskimi wartościami ALT i niewielkimi zmianami zapalnymi w badaniu histopatologicznym wątroby. Nie zaleca się leczenia pacjentów w tej fazie zakażenia;

• fazę klirensu immunologicznego z zawsze obecnym antygenem HBs, dodatnim lub ujemnym antygenem HBe, mogą być obecne przeciwciała anty-HBe. Wartości HBV-DNA średnio wysokie (105–107 kopii/ml), podwyższone wartości ALT, w badaniu histopatologicznym wątroby nasilone zmiany martwiczo-zapalne. Pacjenci w tej fazie zakażenia często wymagają leczenia przeciwwirusowego;

• fazę kontroli immunologicznej (faza niskiej replikacji), która charakteryzuje się obecnością przeciwciał anty-HBe, replikacją HBV-DNA poniżej 105 kopii/ml, prawidłowymi lub nieznacznie podwyższonymi wartościami ALT, brakiem lub minimalnymi zmianami w badaniach histopatologicznych wątroby. Faza ta nie wymaga leczenia;

• fazę reaktywacji zakażenia, gdzie antygen HBe jest ujemny, wiremia HBV-DNA podwyższona, poziom ALT podwyższony, obecne są zmiany martwiczo-zapalne w bioptatach. W tej fazie rekomendowane jest leczenie interferonem, a w przypadku niepowodzeń analogami nukleozydów.

Wobec obecnie przyjętych strategii terapeutycznych, opracowanych przez grupy eksperckie [4], określenie stanu zaawansowania przewlekłego zakażenia i ocena skuteczności prowadzonych w przeszłości terapii stanowią podstawę do wdrożenia dalszego racjonalnego postępowania, które może zapobiec poważnym następstwom choroby, jakimi są zagrożenie rozwojem marskości i raka wątrobowokomórkowego (HCC). Z tych względów celowe wydało się dokonanie aktualnej analizy młodocianych pacjentów przewlekle zakażonych HBV.

Cel pracy

Badanie obserwacyjne. Rertospektywna ocena skuteczności leczenia dzieci z przewlekłym zakażeniem HBV z uwzględnieniem wywiadu dotyczącego wieku i drogi zakażenia. Analiza aktualnych parametrów monitorujących przebieg przewlekłego zakażenia HBV, ze szczególnym uwzględnieniem fazy zakażenia.

Materiał i metody

Badanie prowadzono w III Klinice Pediatrii i poradni przyklinicznej Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki wśród dzieci w wieku do 18 lat. Oceną objęto 114 pacjentów z antygenem HBs, pozostających pod opieką poradni. Analizowano wywiad dotyczący okresu noworodkowego i dotychczasowych hospitalizacji, wieku rozpoznania zakażenia HBV oraz domniemanej drogi zakażenia. Na podstawie dokumentacji oceniono wiek w chwili rozpoznania zakażenia HBV, metody i skuteczność dotychczas stosowanego leczenia. Oznaczano aktualną aktywność ALT, poziom wiremii HBV-DNA oraz serologiczne markery zakażenia (HBsAg, HBeAg, antyHBe).

Oddzielnie analizowano pacjentów HBeAg(+) i HBeAg(–). Oceniono aktywność ALT i wiremię u pacjentów HBeAg(–) z samoistną serokonwersją vs serokonwersją po terapii interferonem alfa (IFN-) i/lub lekami przeciwwirusowymi.

Ilościowe badanie HBV-DNA przeprowadzono metodą PCR przy użyciu VERSANT HBV-DNA 3.0 Bayer Diagnostics z zakresem liniowości 2 × 103–108 kopii/ml w Pracowni Biologii Molekularnej Wojewódzkiego Specjalistycznego Szpitala im. Wł. Biegańskiego w Łodzi. Badanie poziomu ALT przeprowadzono w miejscowym laboratorium przy użyciu wystandaryzowanych procedur. Markery serologiczne HBsAg, HBeAg, anty-HBe badano testami EIA (AXSYN, Abbot). W analizie statystycznej do porównania średnich stężeń zastosowano test t-Studenta, a do oceny współzależności współczynnik korelacji liniowej Pearsona. Różnice i korelacje uznano za znamienne przy wartości p < 0,05.

Wyniki

Analizowani pacjenci urodzili się w latach 1989–1998, mediana – rocznik 1992 (SD 1,4 roku). U wszystkich do zakażenia doszło w pierwszych miesiącach życia. Najwcześniej zakażenie HBV rozpoznane zostało w 1. roku życia, najpóźniej w 14. roku życia, średnio w 4. roku życia (mediana 3. rok życia, SD – 3,5 roku). W wywiadzie u 85% badanych odnotowano hospitalizacje w 1. roku życia, w jednym przypadku potwierdzono zakażenie wertykalne, w jednym zakażenie horyzontalne od matki.

Trzech pacjentów urodziło się już w okresie obowiązkowych szczepień przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B (WZW B) – w 1996 r., 1997 r. i w 1998 r. Wszyscy otrzymali szczepienie, ale w okresie noworodkowym przebyli zabiegi operacyjne z powodu różnych wad wrodzonych.

Obecność HBeAg stwierdzono u 20/114 (17,5%) badanych, brak antygenu u 94/114 (82,5%).

W grupie HBeAg(–) serokonwersja w układzie HBe/anty-HBe nastąpiła samoistnie u 57 badanych i u 37 spośród 53 leczonych IFN- i/lub LAM (tab. I). Czworo pacjentów HBeAg(+) nie było poddanych żadnej terapii. Spośród 40 pacjentów leczonych IFN- serokonwersję po pierwszorazowej kuracji uzyskano u 20 (50%) pacjentów, po reterapii u 4/9 (44%). Serokonwersję uzyskano także u 7/13 (53%) osób, u których LAM stosowano jako lek pierwszego rzutu, oraz u 6 z 15 (40%), u których LAM podano po nieskutecznej terapii i/lub reterapii inter­feronem. Łącznie LAM stosowano u 28 badanych, natomiast serokonwersję w układzie HBe-anty-HBe uzyskano u 13 (46%) leczonych.

Na podstawie poziomu wiremii i aktywności ALT ustalono fazę zakażenia HBV, w jakiej znajdują się aktualnie badani pacjenci HBeAg(–) i HBeAg(+) (tab. II–IV).

Wiremię > 105 kopii/ml odnotowano u 90% HBeAg(+) i u 6,4% HBeAg(–) pacjentów. Obserwowano dodatni współczynnik korelacji pomiędzy aktywnością ALT i poziomem wiremii, który w grupie HBsAg(+) wyniósł 0,51 (p < 001), a w grupie HBeAg(–) 0,76 (p < 0,01). Stwierdzono statystycznie niższą aktywność ALT u pacjentów HBeAg(–) w porównaniu z HBeAg(+) (tab. V).

W grupie HBeAg(–) odrębnie oceniono aktywność ALT w podgrupach z samoistną serokonwersją i serokonwersją po leczeniu. Wśród dzieci, u których dokonała się samoistna serokonwersja, jeden pacjent miał poziom ALT > 3 × GGN, czemu towarzyszyła wiremia > 108 kopii/ml. Podobne wyniki uzyskano u jednego pacjenta w podgrupie 37 badanych HBeAg(–), z serokonwersją po leczeniu. Powyżsi pacjenci spełniali kryteria fazy reaktywacji zakażenia. Analiza wartości wiremii i ALT u pacjentów HBeAg(–), z pominięciem chorych w fazie reaktywacji, wykazała brak statystycznie istotnych różnic w poziomie ALT w podgrupach z samoistną serokonwersją i serokonwersją po leczeniu, natomiast stwierdzono znamienną różnicę w wartościach wiremii w omawianych podgrupach: średnio 7326 vs 30 463 kopie/ml (p < 0,05) (tab. VI).

Dyskusja

Wprowadzenie obowiązkowych szczepień przeciwko WZW B dla wszystkich noworodków w Polsce w 1994 r., a w 2000 r. dla młodzieży w 14. roku życia, jak również poprawa sterylizacji sprzętu medycznego i warunków sanitarno-epidemiologicznych spowodowały spadek liczby zakażeń HBV w latach 1993–2004 o 88% [5]. Według danych Państwowego Zakładu Higieny w Polsce, w 2007 r. zarejestrowano tylko 364 zachorowania na ostre WZW B, w tym 15 przypadków u osób do 19. roku życia, z czego jeden w 1. roku życia (zapadalność w grupie wiekowej 0–4 lat wyniosła 0,006/100 000), 5 przypadków w grupie wiekowej 10–14 lat i 9 przypadków w grupie 15–19 lat [6]. Powyższe dane wskazują, że problem nowych zakażeń wirusem HBV w Polsce u dzieci został niemalże zlikwidowany. Ten fakt potwierdza analiza wieku pacjentów będących pod opieką poradni autorów. Pojedyncze przypadki przewlekłego zakażenia dotyczą osób urodzonych w latach 1996, 1997 i 1998, nie ma młodszych pacjentów. W grupie badanych, podobnie jak w obserwacjach innych autorów, przeważali chłopcy (67,5%).

Ustalenie źródła zakażenia jest zawsze trudne i obciążone dużym błędem. W doniesieniach polskich badaczy ok. 60–80% dzieci zakaziło się w zakładach służby zdrowia, szczególnie na oddziałach zabiegowych [7]. Własna analiza domniemanego miejsca zakażenia wykazała, że 85% badanych miało w wywiadzie co najmniej jedną hospitalizację w pierwszych 6 mies. życia. Jedynie w dwóch przypadkach ustalono zakażenie od matki, jedno drogą wertykalną, drugie prawdopodobnie horyzontalną. Na uwagę zasługuje fakt, że w części przypadków zakażenie u dziecka było rozpoznawane w wyniku badania przesiewowego wykonanego u osób z kontaktu po zachorowaniu na ostre, pełnoobjawowe WZW dorosłego członka rodziny. Wydaje się zatem, że często rodzice zakażali się drogą horyzontalną od przewlekle, ale bezobjawowo zakażonego dziecka. Brak nowych zakażeń w grupie najmłodszych dzieci wskazuje, że stosowana w Polsce czynno-bierna profilaktyka u noworodków matek z antygenemią HBs w pełni zabezpiecza dziecko przed zakażeniem.

Zakażenie HBV nabyte w okresie niemowlęcym, z uwagi na dysfunkcję układu immunologicznego w tym okresie życia, najczęściej prowadzi do rozwoju przewlekłego zapalenia wątroby typu B (PZW B). Upośledzona funkcja komórek dendrytycznych powoduje słabą prezentację antygenów wirusowych limfocytom T. Zaburzona funkcja limfocytów T regulatorowych skutkuje opóźnioną i niepełną aktywacją limfocytów CD4, czego skutkiem jest upośledzenie produkcji IFN-g, TNF i innych cytokin pozapalnych oraz upośledzenie efektu cytotoksycznego limfocytów CD8. Upośledzony jest również efekt cytotoksyczny komórek NK i K oraz monocytów i makrofagów, które produkują mniej IFN- [8, 9]. U przewlekle zakażonych uczynniają się mechanizmy immunosupresji. Indukcja negatywnych regulatorów immunologicznych stale upośledza funkcję limfocytów T, szczególnie CD8. Duże znaczenie ma m.in. zmniejszenie ekspresji receptorów Toll (TRL) na monocytach krwi obwodowej, czego efektem jest zmniejszenie wytwarzania cytokin prozapalnych [10]. Zwraca także uwagę rola śródbłonowego białka PD-1 (programmed death 1), którego ekspresja silnie indukowana na limfocytach T, B i monocytach powoduje hamowanie proliferacji limfocytów T i wytwarzania IFN-g, IL-2 i IL-10. Stwierdzono ścisłą ujemną korelację między poziomem wiremii a stopniem ekspresji receptora PD-1 na limfocytach CD4 i CD8 u pacjentów z przewlekłym zakażeniem HBV [11].

W prezentowanej pracy nie oceniano statusu immunologicznego badanych pacjentów, stąd trudno wytłumaczyć, czym jest spowodowana różnica poziomów wiremii (przy braku różnicy w aktywności ALT) pomiędzy pacjentami HBeAg(–) z samoistną serokonwersją w porównaniu z pacjentami, u których uzyskano serokonwersję po leczeniu.

Leczenie interferonem powoduje hamowanie replikacji wirusa i zwiększenie efektu cytotoksycznego poprzez aktywację komórek NK i makrofagów, ekspresję antygenów HLA oraz zwiększenie gęstości antygenów HBV na powierzchni zakażonych hepatocytów [12]. Skuteczność leczenia IFN- mierzoną odsetkiem serokonwersji w układzie HBe-anty-HBe wg różnych autorów szacuje się na poziomie 30–55% [13–15]. Badania własne wskazują, że po pierwszej kuracji IFN- serokonwersję uzyskano u 50% pacjentów po pierwszej terapii i u 44% po reterapii. Nie oceniano odsetka serokonwersji na rok. Spośród 20 pacjentów HBeAg(+) jedynie u 4 nie podejmowano dotąd leczenia, u pozostałych 16 stosowano różne kombinacje: interferon jednorazowo, reterapię interferonem, LAM jako lek pierwszego rzutu bądź LAM po nieskutecznym leczeniu IFN- bez odpowiedzi serologicznej.

Na uwagę zasługuje wysoki odsetek (57/114 – 50%) samoistnej serokonwersji odnotowany w badanej grupie dzieci. W badaniach Zacharakisa i wsp. samoistna serokonwersja występowała u 11–19% badanych [16], w badaniach Hsu i wsp. u 66% [17]. Kao i wsp. obserwowali większy odsetek samoistnej serokonwersji w zakażeniach genotypem C w porównaniu z genotypem B [18]. LAM stosowana w leczeniu PZW B jest analogiem nukleozydowym. Skuteczność LAM w uzyskaniu serokonwersji HBe/anty-HBe szacuje się na 25–60% [19–21]. W materiale własnym skuteczność wyniosła 46%.

Serokonwersja HBe/anty-HBe nie oznacza całkowitej eliminacji wirusa. W procesie replikacji wirusa w zakażonym hepatocycie całość genomu zostaje przekształcona w formę kolistej nici, podwójnie domkniętej wiązaniami kowalentnymi, tworzącej cccDNA (covalently closed circular DNA), który nie ma wpływu na metabolizm hepatocyta, ale może przetrwać w jądrze hapatocyta tak długo, jak żyje komórka, a także może uruchamiać cykl replikacji HBV [22]. Aktualnie dostępne leki przeciwwirusowe nie eliminują cccDNA, dlatego celem leczenia przewlekłego zakażenia HBV jest długotrwała supresja replikacji wirusa, co skutkuje redukcją zmian martwiczo-zapalnych i włóknienia w wątrobie, zmniejszeniem ryzyka rozwoju HCC i związanej z tym śmiertelności. Serokonwersja w układzie HBe/anty-HBe wiąże się ze znacznym ograniczeniem replikacji wirusa, co skutkuje poprawą biochemicznych wykładników czynności wątroby [23, 24]. U analizowanych pacjentów nie oceniano poziomów HBV-DNA przed leczeniem IFN i/lub LAM i po jego zastosowaniu. Analiza wartości wiremii wykonana w czasie trwania badania wykazała, że HBV-DNA w ilości powyżej 105 kopii/ml stwierdzono u 90% pacjentów HBeAg(+) i jedynie u 6,4% pacjentów HBeAg(–). W badaniu własnym wykazano znamiennie wyższe średnie wartości wiremii w grupie pacjentów z serokonwersją uzyskaną po stosowanym w przeszłości leczeniu IFN i/lub LAM w porównaniu ze średnią wiremią w grupie pacjentów, u których serokonwersja w układzie HBe/anty-HBe nastąpiła samoistnie. Nie obserwowano różnic w aktywności ALT w omawianych grupach. Powyższa obserwacja nie znajduje potwierdzenia w doniesieniach innych autorów i wymaga dalszych badań.

Wnioski

Pomimo iż pacjenci HBeAg(–) wykazują niższą wiremię i niższą aktywność ALT w porównaniu z chorymi HBeAg(+), to jednak 23% tej grupy spełnia kryteria fazy klirensu immunologicznego i reaktywacji i wymaga dalszego leczenia przeciwwirusowego.

Wyjaśnienie przyczyn wyższej wiremii przy porównywalnej aktywności ALT występującej u pacjentów HBeAg(–) z serokonwersją w układzie HBe/anty-HBe uzyskaną po leczeniu w porównaniu z grupą z samoistną serokonwersją wymaga dalszych badań.

Piśmiennictwo

 1. McMahon BJ, Alward WL, Hall DB, et al. Acute hepatitis B virus infection: relation of age to the clinical expression of disease and subsequent development of the carrier state. J Infect Diseases 1985; 151: 599-603.  

2. Morgan M, Keeffe EB. Diagnosis and treatment of chronic hepatitis B: 2009 update. Minerva Gastroenterol Dietol 2009; 55: 5-22.  

3. Pungpapong S, Kim WR, Poterucha JJ. Natural history of hepatitis B virus infection: an update for clinicians. Mayo Clin Proc 2007; 82: 967-75.  

4. Lok AS, Zoulim F, Locarnini S, et al. Antiviral drug-resistant HBV: standardization of nomenclature and assays and recommendations for management. Hepatology 2007; 46: 254-65.  

5. Magdzik W, Czarkowski MP. Sytuacja epidemiologiczna wirusowego zapalenia wątroby typu B w Polsce w latach 1979–2004. Przegl Epidemiol 2006; 60: 471-80.  

6. Czarkowski MP, Cielebak E, Dacka P, et al. Choroby zakaźne i zatrucia w Polsce w 2007 roku. Warszawa. PZH. Główny Inspektorat Sanitarny 2007. www.pzh.gov.pl/oldpage/epimeld/2007/Ch_2007.pdf  

7. Mozer-Lisewska I, Kowala-Piaskowska A, Figlerowicz M, et al. Epidemiologia i aspekty kliniczne zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B u dzieci. Pediat Prakt 2001; 9: 7-11.  

8. Visvanathan K, Lewin SR. Immunopathogenesis: role of innate and adaptive immune responses. Semin Liver Dis 2006; 26: 104-15.  

9. Mulrooney-Cousins P, Michalak T. Persistent occult hepatitis B virus infection: Experimental findings and clinical implications. World J Gastroenterol 2007; 13: 5682-6.

10. Creagh EM, O'Neill LAJ. TLRs, NLRs and RLRs: a trinity of pathogen sensors that co-operate in innate immunity. Trends Immunol 2006; 27: 352-7.

11. Evans A, Riva A, Cooksley H, et al. Programmed death 1 expression during antiviral treatment of chronic hepatitis B: Impact of hepatitis B e-antigen seroconversion. Hepatology 2008; 48: 759-69.

12. Zein NN. Interferons in the management of viral hepatitis. Cytokines Cell Mol Ther 1998; 4: 229-41.

13. Di Bisceglie AM. Long-term outcome of interferon-alpha therapy for chronic hepatitis B. J Hepatol 1995; 22 (1 Suppl.): 65-7.

14. Korenman J, Baker B, Waggoner J, et al. Long-term remission of chronic hepatitis B after alpha-interferon therapy. Ann Intern Med 1991; 114: 629-34.

15. Feinman SV, Berris B, Sooknanan R, et al. Effects of interferon-alpha therapy on serum and liver HBV DNA in patients with chronic hepatitis B. Dig Dis Sci 1992; 37: 1477-82.

16. Zacharakis G, Koslcinas J, Kotsiou S, et al. Natural history of chronic hepatitis B virus infection in children of different ethnic origins: a cohort study with up to 12 years’ follow-up in northern Greece. J Pediatr Gastroenterol Nut 2007; 44: 14-7.

17. Hsu YS, Chien RN, Yeh CT, et al. Long-term outcome after spontaneous HBeAg seroconversion in patients with chronic hepatitis B. Hepatology 2002; 35: 1522-7.

18. Kao JH, Chen PJ, Lai MY, et al. Hepatitis B virus genotypes and spontaneous hepatitis B e antigen seroconversion in Taiwanese hepatitis B carriers. J Med Virol 2004; 72: 363-9.

19. Kamar N, Sandres-Saune K, Ribes D, et al. Effects of long-term lamivudine therapy in renal-transplant patients. J Clin Virol 2004; 31: 298-303.

20. Liberek A, Szaflarska-Popławska A, Korzon M, et al. Lamivudine therapy for children with chronic hepatitis B. World J Gastroenterol 2006; 12: 2412-6.

21. Koh H, Baek SY, Chung KS. Lamivudine therapy for korean children with chronic hepatitis B. Yonsei Med J 2007; 48: 927-33.

22. Caruntu FA, Molagic V. CccDNA persistence during natural evolution of chronic VHB infection. Rom J Gastroenterol 2005; 14: 373-7.

23. Ni YH, Chang MH, Chen PJ, et al. Viremia profiles in children with chronic hepatitis B virus infection and spontaneous e antigen seroconversion. Gastroenterology 2007; 132: 2340-5.

24. Yuen MF, Yuan HJ, Hui CK, et al. A large population study of spontaneous HBeAg seroconversion and acute exacerbation of chronic hepatitis B infection: implications for antiviral therapy. Gut 2003; 52: 416-9.