Significance of expression of estrogenic receptors alpha and beta during the course of various types of skin ageing

Wstęp

Proces starzenia się skóry jest złożony i zależny od różnych mechanizmów biologicznych, biochemicznych i molekularnych. Wyróżnia się kilka typów starzenia skóry:

• starzenie wewnątrzpochodne – związane z wiekiem (chronologiczne) i hormonalne (menopauzalne);

• starzenie zewnątrzpochodne – powstające pod wpływem czynników zewnętrznych, związane z nadmierną ekspozycją na promieniowanie UV (fotostarzenie) oraz związane z dymem papierosowym (skóra palacza);

• starzenie mimiczne (miostarzenie) [1–3].

Estrogeny produkowane w komórkach ziarnistych pęcherzyków jajnikowych wywierają silny wpływ zarówno na procesy biologiczne przebiegające w skórze, jak i na jej skład. Istnieją dwie drogi działania estrogenów – pierwsza i główna przez receptory dla steroidów płciowych oraz druga poprzez błonową drogę wiązania z komórką docelową [4, 5]. Receptory steroidowe zidentyfikowane w 1976 r. na fibroblastach przez Strumpfa należą do wspólnej grupy receptorów jądrowych dla hormonów tarczycy, witaminy D3 oraz witaminy A. Ich rozmieszczenie oraz liczba uzależnione są od obszaru skóry, przy czym największe nagromadzenie stwierdzono w skórze twarzy, okolicy narządów płciowych i kończyn dolnych. Receptory estrogenowe występują w tkance mózgowej, gruczołach piersiowych, kościach, układzie sercowo-naczyniowym oraz w narządach moczowo-płciowych [6].

Wyróżnia się dwa typy ER, które są odrębnymi białkami – receptor estrogenowy alfa (ER) i receptor estrogenowy beta (ER). Receptor estrogenowy alfa został zidentyfikowany w 1986 r., kodowany jest na chromosomie 6. i zlokalizowany na fibroblastach oraz makrofagach. Receptor estrogenowy beta został zidentyfikowany w 1996 r., a kodowany jest na chromosomie 14., występuje na keratynocytach warstwy podstawnej naskórka, melanocytach, komórkach dendrytycznych oraz śródbłonku naczyń [4, 7, 8]. W syntezie estrogenów znaczną rolę odgrywa również aromataza występująca na fibroblastach, adypocytach, mieszkach włosowych i gruczołach łojowych. Przekształca ona androstendion do estronu, który z kolei pod wpływem dehydrogenazy 17-hydroksysteroidowej przekształcany jest w estradiol (E2) [9].

Cel pracy

Celem pracy była ocena różnicy stopnia ekspresji ER i ER w naskórku i w skórze właściwej w przebiegu różnego rodzaju starzenia się skóry.

Materiał i metody

Badaniem objęto grupę 60 zdrowych kobiet z różnymi objawami starzenia skóry w wieku 26–62 lat, a następnie wyodrębniono trzy niezależne grupy – każda licząca po 20 osób.

Do grupy I zaliczono kobiety z objawami starzenia menopauzalnego skóry w wieku 45–62 lat, średnia wieku 52,70 ±4,73 roku, niepalące, niemiesiączkujące, niestosujące hormonalnej terapii zastępczej (HTZ), niekorzystające z solarium i kąpieli słonecznych oraz stosujące fotoprotekcję.

Grupę II (fotostarzenie) stanowiło 20 kobiet w wieku 26–49 lat, średnia wieku wynosiła 38,3 ±7,46 roku. W grupie tej 11 (55%) badanych paliło papierosy – od kilkunastu do kilkudziesięciu dziennie. Do grupy tej zaliczono kobiety miesiączkujące, niestosujące HTZ oraz antykoncepcji hormonalnej. Badane często korzystały z kąpieli słonecznych, korzystały z solarium 2–12 razy w miesiącu oraz nie stosowały fotoprotekcji.

Trzecia grupa to kobiety z objawami starzenia chronologicznego skóry w wieku 49–62 lat – średnia

55 ±3,78 roku. Wszystkie kobiety zaliczone do tej grupy nie paliły, stosowały HTZ w trakcie badania, nie korzystały z solarium, nie opalały się na słońcu oraz stosowały na co dzień fotoprotekcję.

Badanie immunohistochemiczne

Wycinki do badań immunohistochemicznych po­bie­rano w znieczuleniu miejscowym 2-procentowym roz-tworem lignokainy (bez adrenaliny) z okolicy przedusz­nej, za pomocą Biopsy punch i utrwalano w 10-procen­towej buforowanej formalinie. Następnie rutynowo przeprowadzano wycinki tkankowe i zatapiano w kostki parafinowe, z których skrawano skrawki tkankowe grubości 5 µm.

Oznaczenia ekspresji ER i ER1 dokonano przy użyciu monoklonalnych przeciwciał mysich przeciw ludzkiemu receptorowi (monoclonal mouse anti-human estrogen receptor), odpowiednio  – klon 1D5 o izotypie IgG1 kappa – i 1 – klon PPG5/10.

Determinanty antygenowe, po odparafinowaniu i uwodnieniu skrawków tkankowych, przez 20 min poddawano działaniu mikrofali (kuchenka mikrofalowa 650 Watt) w środowisku buforu TRIS/EDTA o pH 9,0. Endogenną peroksydazę blokowano 3-procentowym nadtlenkiem wodoru. Reakcję z właściwym pierwotnym przeciwciałem przeprowadzano w komorze wilgotnej przez okres 30 min, w rozcieńczeniu 1 : 100 dla ER

i 1 : 10 dla ER1. Wizualizację wykonywano metodą en vision (DAKO system).

Oceny badań dokonywano z użyciem mikroskopu świetlnego OLYMPUS BX50, przy powiększeniu 200 ×. Oceniano intensywność i rozległość reakcji w naskórku oraz w skórze właściwej. Intensywność reakcji barwnej w naskórku i skórze właściwej oceniano w 4-stopniowej, subiektywnej skali, gdzie: 0 – całkowity brak reakcji,

1 – słaba reakcja, 2 – średnia reakcja i 3 – silna reakcja. Rozległość reakcji w naskórku mierzono odsetkiem wybarwionych komórek warstwy podstawnej: 0 – brak komórek, 1 – do 25% komórek, 2 – 26–50% komórek,

3 – 51–75% komórek i 4 – 76–100% komórek. Rozległość reakcji w skórze właściwej mierzono bezwzględną liczbą wybarwionych fibroblastów: 0 – brak komórek,

1 – kilka fibroblastów, 2 – kilkanaście fibroblastów, 3 – kilkadziesiąt fibroblastów i 4 – kilkaset fibroblastów.

Analiza statystyczna

Interpretację otrzymanych wyników oparto na standardowych metodach statystycznych. Wybór testu statystycznego w przypadku rozkładu normalnego uzależniono od wyniku porównania wariancji. W przypadku braku podstaw do odrzucenia hipotezy o równości wariancji stosowano klasyczny test t-Studenta, natomiast w wypadkach uzasadniających odrzucenie tej hipotezy wykorzystano uogólniony test t-Studenta (test Corchana-Coxa).

Wyniki badań

W grupie I u większości kobiet nie stwierdzano ekspresji ER zarówno w obrębie naskórka u 13 (65%), jak i w skórze właściwej u 14 (70%) badanych. Ekspresję ER o słabej intensywności w naskórku obserwowano u 7 (35%) badanych kobiet, a w skórze właściwej u 6 (30%; ryc. 1.). Notowano rozległość ekspresji w naskórku i w skórze właściwej 1. i 2. stopnia. W grupie II w naskórku ER stwierdzono tylko u 6 (30%) badanych, a w skórze właściwej u 2 (10%) kobiet. Stopień ekspresji i rozległości zarówno w naskórku, jak i w skórze właściwej był 1. lub 2. stopnia (ryc. 2.). W grupie III tylko

u 5 (25%) badanych kobiet obserwowano obecność

ekspresji ER w naskórku i u 3 w skórze właściwej o intensywności 1. lub 2. stopnia. Podobnie rozległość ekspresji stwierdzana w naskórku i w skórze właściwej była 1. lub 2. stopnia (ryc. 3.). Wyniki badań przedstawiono w tabeli I.

Porównując stopień intensywności ekspresji (ryc. 4.) i rozległości (ryc. 5.) ER w naskórku pomiędzy wszystkimi badanymi grupami, stwierdzono, że nie różniły się one znamiennie statystycznie (p > 0,05).

Podczas analizy poziomu intensywności i rozległości ekspresji ER w skórze właściwej pomiędzy wszystkimi grupami zaznaczały się pewne różnice, ale nie były one istotne statystycznie (ryc. 6. i 7.).

Oceniając stopień ekspresji ER1 w badanych gru­pach, stwierdzono w grupie I u wszystkich badanych ekspresję ER1 w naskórku i w skórze właściwej (ryc. 8.).

Najczęściej, bo aż u 15 (75%) badanych stwierdzono

w naskórku ekspresję o średniej intensywności (2. stopnia), a u 1 osoby – 3. stopnia. W skórze właściwej również najczęściej występowała ekspresja o intensywności

2. stopnia. Rozległość ekspresji była zróżnicowana od

1. do 4. stopnia w naskórku i od 1. do 3. stopnia w skórze właściwej. W grupie II u 14 (70%) badanych kobiet

ekspresję ER1 w naskórku oceniano jako 1. stopnia,

a u 6 (30%) badanych 2. stopnia. W skórze właściwej

również u wszystkich kobiet obserwowano ekspresję ER1 o różnej intensywności, zarówno 1. stopnia u 12 (60%) badanych, jak i 2. stopnia u 8 (40%) badanych. Rozległość w naskórku i w skórze właściwej u 11 (55%) badanych osób była 3. lub 4. stopnia (ryc. 9.). W grupie III w naskórku ekspresja ER1 1. stopnia występowała u 11 (55%) badanych, natomiast w skórze właściwej

u 14 (70%) kobiet. Ekspresję tego receptora o 2. stopniu intensywności stwierdzono u 9 (45%) badanych w naskórku i u 6 (30%) w skórze właściwej (ryc. 10.). Rozległość ekspresji w naskórku i w skórze właściwej była

zróżnicowana. W naskórku rozległość 1. stopnia stwierdzono u 6 (30%), 2. u 7 (35%), a 3. u 3 (15%) oraz

4. stopnia u 4 (20%) badanych. W skórze właściwej rozległość ER1 była najczęściej 1. stopnia (12 badanych, tj. 60%) oraz 2. stopnia. Dokładne dane przedstawiono w tabeli I.

Porównując nasilenie ekspresji ER1 w naskórku pomiędzy grupami I i III oraz II i III stwierdzono, że nie różniły się znamiennie statystycznie, ale różniły się istotnie pomiędzy grupą I i II przy p = 0,0015 (ryc. 11.). Rozległość ekspresji ER1 w naskórku pomiędzy grupami I i II oraz II i III nie różniła się znamiennie statystycznie, natomiast istotna statystycznie różnica występowała przy porównaniu grupy I z III (p = 0,01; ryc. 12.).

Analizując stopień intensywności i rozległości ekspresji ER1 w skórze właściwej pomiędzy grupami I i II oraz II i III, stwierdzono pewne różnice, ale nie były one znamiennie statystycznie (p > 0,05). Istotnie statystyczna różnica w stopniu ekspresji ER1 w skórze właściwej występowała pomiędzy grupami I i III, przy p = 0,027 oraz bliska istotności statystycznej (p = 0,056) była różnica rozległości pomiędzy grupami I i III (ryc. 13. i 14.).

Dyskusja

Na podstawie badań wielu autorów stwierdzono, że zmiany w obrębie ER i ERodgrywają znaczącą rolę we wszystkich rodzajach starzenia się skóry. Rozmieszczenie ER i ER w skórze jest nieco odmienne, ale zarówno ER, jak i ER wykazują wysokie powinowactwo i swoistość do swoich ligandów oraz wysoki stopień podobieństwa w zakresie wiązań DNA. Mogą tworzyć formy homodimeryczne i heterodimeryczne. Każdy z badanych receptorów (ER i ER) sygnalizuje to w całkiem odmienny sposób. Receptor estrogenowy alfa wzmacnia czynnik transkrypcji jądrowej AP-1 podczas tworzenia kompleksu z E2, czego nie zaobserwowano w przypadku ER. Prawdopodobnie ER i ER odgrywają różną rolę w regulacji genów, a wartość ich stężenia w tkankach może mieć wpływ na estrogenową reaktywność komórek. Największe nagromadzenie ER występuje w obrębie skóry twarzy, dlatego też proces starzenia skóry najbardziej nasilony jest w tej okolicy [6, 8, 10–12].

Autorzy zajmujący się problemem starzenia skóry, zwłaszcza znaczeniem zaburzeń hormonalnych w okresie menopauzalnym, zwracają uwagę na wpływ zmniejszenie stężenia estrogenów na kliniczny i histopatologiczny obraz skóry twarzy. Z danych piśmiennictwa wiadomo, że zmniejszenie stężenia estrogenów w okresie menopauzy nasila procesy starzenia się skóry u kobiet [13, 14].

Terapia hormonalna stosowana w tym okresie (HTZ) polegająca na ciągłym lub cyklicznym przyjmowaniu preparatów złożonych znacznie poprawia wygląd skóry, wywołując efekt jej nawilżenia, zwiększenia jej elastyczności i zmniejszenia skali atrofii naskórka [15–17]. Według innych autorów, stosowanie HTZ ma niewielki wpływ na poprawę kondycji skóry [18]. Ostatnio duże nadzieje wiązane są z zastosowaniem nowych preparatów, pobudzających w sposób selektywny ER (selective estrogen receptor modulators – SERM). Leki te działają wybiórczo na ER nie tylko w skórze, ale także w innych tkankach, takich jak kości czy mózg. W skórze pobudzają produkcję kolagenu poprzez pobudzanie fibroblastów i działają silniej niż E2 [19].

W opisywanym badaniu nie zaobserwowano statystycznie znamiennego wpływu stosowania HTZ na intensywność i rozległość ekspresji ER i ER. Być może sugerowane przez innych autorów odpowiednio duże dawki estrogenów spowodowałyby stosowną poprawę stanu skóry [8, 12].

W dostępnym piśmiennictwie brak jest danych dotyczących oceny ekspresji ER i ER w skórze w zależności od okresu życia, typu i zaawansowania procesu starzenia skóry. Spadek aktywności estrogenów powoduje brak stymulacji ER i ER, co prowadzi do zaburzenia wytwarzania kolagenu, kwasu hialuronowego, glikozaminoglikanów (GAG) i proteoglikanów (PG) [8, 12].

W badanych grupach tylko w pojedynczych przypadkach stwierdzono ekspresję ER o słabej lub średniej ekspresji. W grupie I, w naskórku, obserwowano ekspresję receptora u 35%, a w skórze właściwej u 30% kobiet. Rozległość ER w naskórku i w skórze właściwej była niewielka. W grupie II tylko u niektórych badanych obecna była słaba ekspresja ER o niewielkiej rozległości, zarówno w naskórku, jak i w skórze właściwej, podczas gdy u większości nie było jej wcale. W grupie III tylko u 25% badanych kobiet obserwowano obecność ekspresji w naskórku i tylko u 15% w skórze właściwej. Nie stwierdzono statystycznie znamiennych różnic w intensywności oraz rozległości ekspresji ER w naskórku i w skórze właściwej pomiędzy grupami. W zdrowych tkankach na ogół nie obserwuje się ekspresji tego receptora. Receptor estrogenowy alfa w warunkach fizjologicznych jest obecny w tkankach macicy, zarówno w tkance mięśniowej ściany, jak i w błonie śluzowej, a także w komórkach ziarnistych jajnika i komórkach prostaty. Wysoką ekspresję ER stwierdza się przeważnie w tkankach patologicznych, np. w raku sutka [20].

W skórze i jej strukturach obecne są głównie receptory ER. Występują we wszystkich warstwach naskórka oraz w warstwie brodawkowatej skóry właściwej, w mieszkach włosowych i w gruczołach łojowych. W analizowanym badaniu we wszystkich grupach u wszystkich badanych stwierdzono ekspresję ER1 o różnej intensywności i rozległości. W naskórku najsilniejsza ekspresja na poziomie stopnia 2. występowała u 75% badanych grupy I, a u 1 badanej tej grupy stwierdzono 3. stopień intensywności, podczas gdy w grupie II i III przeważał 1. stopień ekspresji, który był znamienny dla grupy II. Intensywność ekspresji różniła się istotnie pomiędzy grupą I i II przy p = 0,0015. Również w skórze właściwej ekspresja ER1 była największa w grupie I

i w odniesieniu do grupy III statystycznie znamienna. Chociaż nie obserwowano statystycznie znamiennej różnicy w intensywności ekspresji ER1 w skórze właściwej w grupach I i II oraz II i III, zauważono tendencję do występowania słabszej reakcji (1. stopień) w grupach II i III. W skórze właściwej I grupy intensywność i rozległość ekspresji ER1 była największa i w porównaniu z grupą III różniła się znamiennie zarówno w naskórku, jak i w skórze właściwej.

Receptor estrogenowy beta jeden występuje w prawidłowych tkankach gruczołów sutkowych, adypocytach, mięśniówce gładkiej naczyń, komórkach ziarnistych jajnika, a także w tkankach macicy [8, 9, 21]. W badaniach Jakimiuka i wsp. dotyczących ekspresji receptorów estrogenowych ER i ER w okresie menopauzalnym autorzy nie stwierdzili różnicy pomiędzy ekspresją w mięśniach gładkich ściany i w błonie śluzowej w macicy u zdrowych kobiet. Inni autorzy zwracają uwagę na utratę lub zmniejszenie ekspresji ER w raku sutka, jajników i okrężnicy, w porównaniu z ekspresją receptora w zdrowych tkankach [20, 22]. Bardzo interesujące badania przeprowadzili Brincat i wsp. u kobiet w okresie menopauzalnym z czerniakiem skóry. Autorzy stwierdzili wzmożoną ekspresję ER w obrębie zmian nowotworowych, sugerując wpływ zmian hormonalnych na rozwój tej choroby [8, 22].

W opisywanych badaniach obserwowano nieznacznie większą ekspresję ER i ER1 w grupie kobiet z objawami starzenia menopauzalnego. Większa ekspresja, zwłaszcza ER1 w tej grupie, może być wynikiem zwiększenia liczby receptorów spowodowanego biologicznym efektem wzrostu ekspresji receptora w obecności niedoboru stymulatora. Nie można wykluczyć, że oznaczanie poziomu ekspresji ER może być przydatne przy ocenie zmian w skórze właściwej w przebiegu starzenia.

Wnioski

1. Nie ma znamiennych różnic w intensywności i rozległości ekspresji ER w grupach starzenia chronologicznego, menopauzalnego i fotostarzenia.

2. Istnieje znamiennie większa intensywność i rozległość ekspresji ER1 w przebiegu starzenia menopauzalnego.

Piśmiennictwo

1. Gilchrest BA. Skin aging 2003: recent advances and current concepts. Cutis 2003; 72 (Suppl): 5-10.

2. Yaar M. Skin aging. Molecular mechanisms, structural and functional decrements. Advances in healthy skin, 2001.

3. Yaar M, Gilchrest BA. Skin aging: postulated mechanisms and con­sequent changes in structure and function. Clin Geriatr Med 2001; 17: 617-30.

4. Trznadel-Budźko E, Rotsztejn H. Wpływ hormonów na hamowanie pro­cesu starzenia się skóry. Przegl Menopauz 2007; 6: 381-3.

5. Kanda N, Watanabe S. Regulatory roles of sex hormones in cutaneous biology and immunology. J Dermatol Sci 2005; 38: 1-7.

6. Strupmf WE, Sur M, Joshi S. Oestrogen target cells in the skin. Expe­ri­mentalia 1976; 30: 176-7.

7. Shah MG, Maibach HI. Estrogen and skin. An overview. Am J Clin Der­matol 2001; 2: 143-50.

8. Brincat MP, Baron YM, Galea R. Estrogens and the skin. Climacteric 2005; 8: 110-23.

9. Quatresooz P, Piérard-Franchimont C, Gaspard U, Piérard GE. Skin cli­macteric aging and hormone replacement therapy. J Cosmet Dermatol 2006; 5: 3-8.

10. Broniarczyk-Dyla G, Joss-Wichman E. Ageing of the skin during meno­pause. J Eur Acad Dermatol Venereol 2001; 15: 494-5.

11. Calleja-Agius J, Muscat-Baron Y, Brincat MP. Skin ageing. Menopause Int 2007; 13: 60-4.

12. Yaar M, Eller MS, Gilchrest BA. Fifty years of skin aging. J Investig Der­matol Symp Proc 2002; 7: 51-8.

13. Raine-Fenning NJ, Brincat MP, Muscat-Baron Y. Skin aging and meno­pause: implications for treatment. Am J Clin Dermatol 2003; 4: 371-8.

14. Thornton MJ. The biological actions of estrogens on skin. Exp Dermatol 2002; 11: 487-502.

15. Piérard-Franchimont C, Letawe C, Goffin V, Piérard GE. Skin water-hol­ding capacity and transdermal estrogen therapy for menopause: a pilot study. Maturitas 1995; 22: 151-4.

16. Verdier-Sévrain S, Bonté F, Gilchrest B. Biology of estrogens in skin: implications for skin aging. Exp Dermatol 2006; 15: 83-94.

17. Hall G, Phillips TJ. Estrogen and skin: the effects of estrogen, menopause, and hormone replacement therapy on the skin. J Am Acad Dermatol 2005; 53: 555-68.

18. Phillips TJ, Symons J, Menon S; HT Study Group. Does hormone the­rapy improve age-related skin changes in postmenopausal women?

A randomized, double-blind, double-dummy, placebo-controlled multi­center study assessing the effects of norethindrone acetate and ethinyl estradiol in the improvement of mild to moderate age-related skin changes in postmenopausal women. J Am Acad Dermatol 2008; 59: 397-404.

19. Verdier-Sévrain S. Effect of estrogens on skin aging and the potential role of selective estrogen receptor modulators. Climacteric 2007; 10: 289-97.

20. Dziduch P, Bogusiewicz M, Haczyński J i wsp. Ekspresja receptora estro­genowego alfa i beta w prawidłowych tkankach macicy u kobiet przed menopauzą. Przegl Menopauz 2003; 6: 12-17.

21. Zegarska B, Woźniak M. Wpływ estrogenu na zmiany zachodzące

w skórze. Przegl Menopauz 2007; 4: 233-8.

22. Brincat M, Moniz CF, Studd JW, et al. Sex hormones and skin collagen content in postmenopausal women. Br Med J (Clin Res Ed) 1983; 287: 1337-8.



Na przeprowadzenie badań uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej przy Collegium Medicum w dniu 09.10.2007 r.

KB/581/2007