Single nucleotide polymorphisms of the EVER2 gene in squamous cell carcinomas in patients with actinic keratosis

Introduction

Actinic keratosis (AK) is the most common premalignant condition of the skin. It is thought to be a result of both environmental and genetic factors. Actinic keratosis was first described as a separate medical condition over 100 years ago, and its former name keratosis senilis draws attention to old age which is a factor predisposing to the development of the disease. The risk of AK definitely increases with age, which is mainly related to the accumulation of sun damage occurring in keratinocytes over the years. This is when irreversible mutations occur in the DNA, while the decline in immunity, which is typical for the elderly, accelerates the onset of the disease [1]. The current name of the condition – keratosis actinica – brings into focus sun exposure as the most important etiopathogenetic factor [2]. Some authors also claim that the name should reflect the potentially malignant nature of the disease or state plainly that it represents an early form of squamous cell carcinoma, i.e. carcinoma in situ [3, 4]. Actinic keratosis is known to be a potential starting point for squamous cell carcinoma (SCC), the second most common cancer of the skin after basal-cell carcinoma, belonging to the so-called non-melanoma skin cancers (NMSC) [5]. Squamous cell carcinoma arises from actinic keratosis in nearly 60% of cases, whereas 97% of all squamous cell carcinomas have histopathological features of AK [6]. The majority of authors agree that squamous cell carcinomas derived from actinic keratosis are less malignant and associated with a lower metastatic risk [7]. There are, however, reports which contradict this theory claiming that up to 40% of cases carry the risk of metastasis [8]. Consequently, the question whether AK should be considered an early stage of squamous cell carcinoma remains open. Fu and Cockerell suggested that the process of development of actinic keratosis and its subsequent malignant transformation into squamous cell carcinoma should be considered by analogy to cervical intraepithetial neoplasia (CIN) and described with a similar term, i.e. keratotic intraepidermal neoplasia (KIN) [9]. The term appropriately describes the process of gradual progression of sparse atypical cells into invasive cancer. The grading system proposed by this authors combines clinical and histopathological features of skin lesions. KIN1 denotes flat skin lesions with focal atypia of keratinocytes confined to the lower one-third of the epidermis, KIN2 has clinically papular features with focal atypia in the lower two thirds of the epidermis, while KIN3 creates larger foci with diffuse atypia involving the full thickness of the epidermis [9]. In 2002, Berhane et al. developed a different classification dividing AK into three categories: asymptomatic AK, inflammatory AK and SCC [10]. The inflammatory form of the disease has a erythematous halo and may be painful. Inflammatory infiltrate accompanying actinic keratosis is thought to be a defence mechanism which, if effective, leads to the regression of lesions. Its ineffectiveness, however, results in progression to squamous cell carcinoma [10].

It is difficult to determine unambiguously which lesions of actinic keratosis has a potential to transform into squamous cell carcinoma. In addition to clinical features including greater palpability, skin hardening and bleeding or inflammation, some authors suggest that malignant transformation may have underlying genetic factors [10]. Genetic predisposition related to functional disorders of recently identified EVER genes may play a role here.

Objective

The aim of the study was to identify relationships between selected polymorphisms of the EVER2 gene, including rs7208422, rs35748721, rs62079073, rs112802399, rs12452890, and the development of squamous cell carcinomas in patients suffering from actinic keratosis.

Material and methods

The analysis involved a total of 100 patients with actinic keratosis, aged between 48 and 91 years, including 50 women and 50 men. The diagnosis of actinic keratosis was based on the patients’ medical history, clinical manifestations and histopathological findings. The mean age of the patients was 75.27 ±7.07, with the median age being 75 years (range: 48.0–91.0). The mean duration of actinic keratosis for the whole group was 7.38 ±5.88 years, while the median duration was 5 years (range: from 3 months to 30 years). The first lesions on the patients’ skin appeared at the mean age of 67.93 ±8.51; the median age was 69 years (range: 43.0–89.0).

The control group (CG) consisted of 380 subjects including 190 women and 190 men. The control group comprised individuals who had undergone paternity tests in the Mazowieckie Province (courtesy of Prof. Rafał Płoski, PhD, MD, from the Department of Medical Genetics, Medical University of Warsaw). Blood samples of control group individuals were derived from the DNA bank and selected at random. All the subjects from the control group provided their written consent to the anonymous use of their DNA for research purposes.

DNA was isolated from full blood transferred into test tubes containing EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid). DNA isolation was performed with a Macherey-Nagel kit using MB1, MB2, MB3, MB4, MB5 and MB6 buffers, magnetic beads and a magnetic separator. After isolation, samples were subjected to a spectrophotometric measurement of absorbance of the DNA solution at the wavelength of 260 nm and the optical path length of 1 mm. Measurements were carried out with a NanoDrop® ND-100 Spectrophotometer. After determining concentrations the samples were diluted (or thickened) to obtain the final concentration of 600 ng/l. The genotyping of polymorphisms was based on RT-PCR (real-time polymerase chain reaction) using Taqman probes, i.e. oligonucleotides with a length of 20–30 bp. The probes are labelled with fluorescent dyes: a reporter dye at the 5’ end and a quencher at the 3’ end. The reaction was performed with two types of reporter dyes including 6-carboxyfluorescein (FAM) and VIC. The quencher was 6-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA). To avoid errors resulting from inaccurate pipetting or variable sample concentrations, the method additionally involves a passive dye – 6-carboxy-X-tetra­methylrhodamine (ROX).



Statistical analysis



The distribution of genotypes in the groups under comparison was determined using 2 test. The analyses were performed assuming different inheritance models: recessive, codominant or dominant. Computations were conducted with the Web-Assotest programme (http://www.ekstroem.com/assotest/assotest.html) [11]. The frequency of alleles in the study groups was compared with the aid of an application available online (http://ihg.gsf.de/cgi-bin/hw/hwal.pl). Multiple factor analyses were based on multifactorial logistic regression using the SPSS package. The threshold of statistical significance was set at p = 0.05.

Results

Table I presents the characteristics of all the polymorphisms under study.

In the group of patients with actinic keratosis and coexisting squamous cell carcinomas, genotypes TT and TG of polymorphism rs62079073 of the EVER2 gene, and allele T, were absent. The only genotype represented in this group was GG. In the group of AK patients without coexisting SCCs, on the other hand, the distribution of polymorphism rs62079073 was the following: genotype GG was found in 63 patients (82.9%), TG – in 10 pa­tients (13.2%) and TT – in 3 patients (3.9%). Analyses showed the frequency of genotype GG in the group of patients with SCCs to be higher – in a statistically significant manner – than among patients without coexisting SCC (in 20 out of 20 patients, 100%; vs. 63 out of 76 pa­tients, 82.9%, p = 0.01) (table II). Allele T was also found to occur more frequently, in a statistically significant way, in the group of SCC-free patients than in the group of subjects with diagnosed squamous cell carcinomas (0% vs. 10.5%; p = 0.026). A comparative analysis was performed for patients with AK and SCC, and the control group in which the frequencies of genotypes and allele T of polymorphism rs62079073 exhibited no statistical variation (p = 0.18 for genotype GG; p = 0.126 for allele T) (table II). Due to the lack of confirmation of the result in relation to the control group, a multifactorial logistic regression analysis was performed for the following clinical parameters: sex of the patients, number of skin lesions, age at onset of actinic keratosis, duration of the disease, extent of AK lesions, coexistence of basal-cell carcinomas, skin phototype, history of childhood sunburns and prolonged sun exposure. The analysis demonstrated genotype GG to be an independent factor implicated in the development of SCCs in AK patients (p = 0.034) (table III).

The analysis of occurrence of another polymorphism of the EVER2 gene – rs7208422 – in patients with actinic keratosis depending on the coexistence of squamous cell carcinomas revealed no differences in the frequency of both genotypes and individual alleles in both patient groups. The distribution of genotypes and alleles was similar (p = 0.811 for genotype TT, p = 0.459 for genotype AA, p = 0.76 for allele T) (table IV). Similarly, no differences were shown for the frequency of occurrence of both genotypes and individual alleles in groups of patients with or without SCCs for the third polymorphism under study – rs12452890 – of the EVER2 gene (p = 0.96 for genotype GG; p = 0.83 for genotype AA, p = 0.86 for allele G) (table V). In view of the very rare occurrence of two remaining polymorphisms (rs35748721 and rs112802399) in the study groups, no statistical analyses were performed.

Discussion

Data on correlations between the EVER genes and precancerous skin conditions/skin cancers are derived from the rare genetically conditioned skin disorder epidermodysplasia verruciformis (EV). So far, studies have successfully identified two genes, EVER1 and EVER2, whose mutations are responsible for the development of symptoms of the disease [12, 13]. Epidermodysplasia verruciformis is characterized by verrucous cutaneous lesions and spots resembling pityriasis versicolor which, after a period of varying duration, may progress to squamous cell carcinomas [14]. The basic factor underlying carcinogenesis in EV are oncogenic EV-type HPVs whose DNA is also identified in a considerable proportion of actinic keratosis and squamous cell carcinoma cases in the general population [15].

Actinic keratosis is known to be the most common premalignant condition which may be a starting point for squamous cell carcinoma. The process of transformation of actinic keratosis into SCC is prolonged, usually encompassing 10–20 years [16]. There are various estimates of the frequency of transformation, ranging from 0.025% to 16% of all AK cases [17, 18]. It must also be noted that over 25% of AK cases may resolve spontaneously if patients avoid sun exposure throughout the year [19]. In addition to excessive sun exposure, age, sex and immunosuppression, progression of actinic keratosis to squamous cell carcinoma seems likely to be influenced by genetic factors as well [20].

Assumptions underlying the present study were based on the hypothesis that EVER genes in actinic keratosis patients may be disturbed and contribute to the development of SCC in the general population. It is interesting to note that previous studies reported a higher incidence of actinic keratosis and squamous cell carcinomas in patients with chromosomal disorders of the LOH (loss of heterozygosity) type on chromosome 17 qter, where both EVER genes are located [21, 22]. The genes have been identified on the EV1 locus on chromosome 17q25 in a 1 cM region between the D17S939 and D17S802 markers. It needs to be stressed that there are, as yet, no literature reports on the detection of mutations in the EVER genes in any disorders other than epidermodysplasia verruciformis. Available publications assess polymorphisms of the EVER genes in cervical cancer based on experimental, clinical and epidemiological studies encompassing many years, which have demonstrated the role of oncogenic HPVs in its development [23, 24].

Our research into polymorphisms of the EVER2 gene in skin carcinogenesis have been inspired by studies by Patel et al. who showed a link between genetic variation in the EVER2 gene and elevated risk of squamous cell carcinoma [25]. The study, the only one on this topic published so far, showed that genotype TT of polymorphism rs7298422 is associated with a 70% increase in the risk of squamous cell carcinoma compared to the control group (OR = 1.7; 95% CI = 1.1–2.7; p = 0.01).

Genetic analyses performed for the present study also involved the EVER2 gene because mutations in this gene has been found in the Polish population of epidermodysplasia verruciformis patients (Majewski et al., unpublished data).

Results of the analyses suggest a correlation between polymorphism rs62079073 of the EVER2 gene and the coexistence of squamous cell carcinomas in the group of patients suffering from actinic keratosis. Polymorphism rs62079073 consists in the substitution of guanine with thymine in intron 8, in exon splice site, which may have pathogenetic relevance. There are no studies in literature assessing the nature of this particular polymorphism. It was selected for the present work because it is more common than other polymorphisms: the frequency of allele T among the European population is known to be 0.09. An analysis of AK patients showed a lack of genotypes TT and TG in the group of patients with coexisting SCCs compared to patients who only had AK-type skin lesions. Similarly, allele T was not identified in the group of patients with AK and SCC. The frequency of genotype GG among patients with AK and SCC was 100% compared to the AK-only group, where the frequency was 82.9%. The findings may point to the protective effect of genotype TT and allele T with regard to the development of SCCs in the group of actinic keratosis patients. Evidence for the hypothesis is the result of multiple regression analysis which was performed for all clinical parameters under study. Dominant genotype GG was demonstrated as an independent factor affecting the development of squamous cell carcinomas in the group of patients with AK.

No statistically significant evidence, however, was obtained for polymorphism rs7208422 of the EVER2 gene which was linked to the risk of squamous cell carcinoma in the cited study by Patel et al. [25]. No statistically significant differences were identified for the remaining three polymorphisms, either.

Statistically significant results obtained in the present study may indicate the role of genetic variation in the EVER2 gene for skin carcinogenesis. In order to elucidate in greater detail the role of polymorphisms of the EVER1 and EVER2 genes in cancers and precancerous conditions, further research is needed. Studies conducted to date to investigate the function of the EVER genes have shown that proteins coded by these genes have an ability to bind to the major zinc transporter ZnT1, forming ZnT-1/EVER complexes, and are implicated in maintaining cellular zinc balance. The mechanism is probably involved in the control of keratinocyte infection by HPV and/or affects immune response controlling the removal of keratinocytes infected by EV HPV [26]. The exact role of this process for skin carcinogenesis requires further clarification in the course of subsequent observations.

Conclusions

Varying expression of squamous cell carcinoma in patients with actinic keratosis may be a consequence not only of environmental factors but also genetic predisposition possibly related to abnormalities in the EVER genes. The studies reported above may indicate the implication of polymorphism of the EVER2 gene in the process of progression of cancerous skin lesions. The nature of polymorphisms is known to be not only a potentially promoting factor but also, as demonstrated by our study, a protective factor influencing skin carcinogenesis determined by the location of polymorphisms within the gene. Further research is required to fully elucidate the roles of polymorphisms of the EVER2 gene in skin carcinogenesis.

References

 1. Frost C.A., Green A.C.: Epidemiology of solar keratoses. Br J Dermatol 1994, 131, 455-464.

 2. Marks R.: Nonmelanotic skin cancer and solar keratoses. The quiet 20th century epidemic. Int J Dermatol 1987, 26, 201-205.

 3. Evans C., Cockerell C.J.: Actinic keratosis: time to call a spade a spade. South Med J 2000, 93, 734-736.

 4. Lober B.A., Lober C.W.: Actinic keratosis is squamous cell carcinoma. South Med J 2000, 93, 650-655.

 5. Madan V., Lear J.T., Szeimies R.M.: Non-melanoma skin cancer. Lancet 2010, 375, 673-685.

 6. Marks R., Rennie G., Selwood T.S.: Malignant transformation of solar keratoses to squamous cell carcinoma. Lancet 1988, 1, 795-797.

 7. Bendl B.J., Graham J.H.: New concepts on the origin of squamous cell carcinomas of the skin: solar (senile) keratosis with squamous cell carcinoma: a clinicopathologic and histochemical study. Proc Natl Cancer Conf 1970, 6, 471-488.

 8. Fukamizu H., Inoue K., Matsumoto K., Okayama H., Moriguchi T.: Metastatic squamous-cell carcinomas derived from solar keratosis. J Dermatol Surg Oncol 1985, 11, 518-522.

 9. Fu W., Cockerell C.J.: The actinic (solar) keratosis: a 21st-century perspective. Arch Dermatol 2003, 139, 66-70.

10. Berhane T., Halliday G.M., Cooke B., Barnetson R.S.: Inflammation is associated with progression of actinic keratoses to squamous cell carcinomas in humans. Br

J Dermatol 2002, 146, 810-815.

11. Hausen S.K., Gjesing A.P., Rasmussen S.K., Glumer C., Urhammer S.A., Andersen G. i inni: Large-scale studies of the insulin gene variable-number-of tandem-repeats polymorphism in relation to type 2 diabetes mellitus and insulin release. Diabetologia 2004, 47, 1079-1087.

12. Ramoz N., Rueda L.A., Bouadjar B., Favre M., Orth G.: A susceptibility locus for epidermodysplasia verruciformis, an abnormal predisposition to infection with the oncogenic human papillomavirus type 5, maps to chromosome 17qter in a region containing a psoriasis locus. J Invest Dermatol 1999, 112, 259-263.

13. Ramoz N., Taieb A., Rueda L.A., Montoya L.S., Bouadjar B., Favre M., et al.: Evidence for a nonallelic heterogeneity of epidermodysplasia verruciformis with two susceptibility loci mapped to chromosome regions 2p21-p24 and 17q25. J Invest Dermatol 2000, 114, 1148-1153.

14. Orth G.: Genetics of epidermodysplasia verruciformis: insights into host defense against papillomaviruses. Semin Immunol 2006, 18, 362-374.

15. Pfister H., Fuchs P.G., Majewski S., Jablonska S., Pniewska I., Malejczyk M.: High prevalence of epidermodyspla­sia verruciformis-associated human papillomavirus DNA in actinic keratoses of the immunocompetent population. Arch Dermatol Res 2003, 295, 273-279.

16. zur Hausen H.: Papillomavirus infections: a major cause of human cancers. Biochim Biophys Acta 1996, 1288, F55-F78.

17. Glogau R.G.: The risk of progression to invasive disease.

J Am Acad Dermatol 2000, 42, 23-24.

18. Jeffes E.W., Tang E.H.: Actinic keratosis. Current treatment options. Am J Clin Dermatol 2000, 1, 167-179.

19. Marks R., Foley P., Goodman G., Hage B.H., Selwood T.S.: Spontaneous remission of solar keratoses: the case for conservative management. Br J Dermatol 1986, 115, 649-655.

20. Kalińska-Bienias A., Majewski S.: Rola czynników genetycznych w skórnej kancerogenezie. Przegl Dermatol 2013, 100, 118-124.

21. Quinn A.G., Sikkink S., Rees J.L.: Basal cell carcinomas and squamous cell carcinomas of human skin show distinct patterns of chromosome loss. Cancer Res 1994, 54, 4756-4759.

22. Rehman I., Takata M., Wu Y.Y., Rees J.L.: Genetic change in actinic keratoses. Oncogene 1996, 12, 2483-2490.

23. Castro F.A., Ivansson E.L., Schmitt M., Juko-Pecirep I., Kjellberg L., Hildesheim A., et al.: Contribution of TMC6 and TMC8 (EVER1 and EVER2) variants to cervical cancer susceptibility. Int J Cancer 2012, 130, 349-355.

24. Wang S.S., Gonzalez P., Yu K., Porras C., Li Q., Safaeian M., et al.: Common genetic variants and risk for HPV persistence and progression to cervical cancer. PLoS One 2010, 5, e8667.

25. Patel A.S., Karagas M.R., Pawlita M., Waterboer T., Nelson H.H.: Cutaneous human papillomavirus infection, the EVER2 gene and incidence of squamous cell carcinoma: a case-control study. Int J Cancer 2008, 122, 2377-2379.

26. Lazarczyk M., Pons C., Mendoza J.A., Cassonnet P., Jacob Y., Favre M.: Regulation of cellular zinc balance as a potential mechanism of EVER-mediated protection against pathogenesis by cutneous oncogenic human papillomaviruses. J Exp Med 2008, 205, 35-42.





Received: 9 IX 2013

Accepted: 23 IX 2013

Wprowadzenie

Rogowacenie słoneczne (ang. actinic keratosis – AK) jest najczęstszym stanem przedrakowym skóry, w którego powstawaniu znaczenie mają zarówno czynniki środowiskowe, jak i genetyczne. Jako odrębna jednostka chorobowa zostało opisane po raz pierwszy ponad 100 lat temu, a dawna nazwa – rogowacenie starcze – podkreśla starszy wiek, który predysponuje do tej choroby. Ryzyko powstania AK niewątpliwie wzrasta z wiekiem, co wiąże się głównie z sumowaniem się uszkodzeń słonecznych powstających w keratynocytach w ciągu wielu lat. Powstają wówczas nieodwracalne mutacje w obrębie DNA, a dodatkowy naturalny spadek odporności u ludzi starszych przyspiesza rozwój choroby [1]. Obecna nazwa – keratosis actinica – podkreśla działanie promieniowania słonecznego jako najistotniejszego czynnika etiopatogenetycznego [2]. Niektórzy autorzy sugerują również, że nazwa powinna uwzględniać potencjalnie złośliwy charakter tego schorzenia, a nawet podkreślać, że jest to już wczesna postać raka kolczystokomórkowego, tj. carcinoma in situ [3, 4]. Wiadomo, że AK może być punktem wyjścia raka kolczystokomórkowego skóry (ang. squamous cell carcinoma – SCC), drugiego co do częstości występowania po raku podstawnokomórkowym nowotworu należącego do tzw. nieczerniakowych nowotworów skóry (ang. non-melanoma skin cancer – NMSC) [5]. Rak kolczystokomórkowy w blisko 60% przypadków zaczyna się od AK, a 97% SCC ma cechy histopatologiczne AK [6]. Większość autorów jest zgodna, że SCC powstające na podłożu AK są mniej agresywne oraz wiążą się z mniejszym prawdopodobieństwem wystąpienia przerzutów [7]. Znane są jednak doniesienia zaprzeczające tej teorii, oceniające ryzyko przerzutów nawet na 40% przypadków [8]. W związku z tym pytanie, czy należy traktować AK jako wczesne stadium SCC, pozostaje otwarte. Fu i Co-ckerell zaproponowali, aby proces powstawania AK, a w dalszym etapie przekształcania do SCC porównać z genitalnymi neoplazjami śródnabłonkowymi, np. szyjki macicy (ang. cervical intraepithelial neoplasia – CIN), i użyć podobnego określenia, tj. neoplazja śródnaskórkowa keratynocytów (ang. keratotic intraepidermal neoplasia – KIN) [9]. Podkreśla to proces stopniowego przejścia od nielicznych atypowych komórek do inwazyjnego raka. Zaproponowana przez tych autorów skala łączy cechy kliniczne i histopatologiczne zmian. KIN1 to płaskie zmiany skórne z ogniskową atypią keratynocytów w dolnej 1/3 części naskórka, KIN2 klinicznie ma cechy grudki z ogniskową atypią w 2/3 dolnej części naskórka, a KIN3 tworzy większe ogniska z rozsianą atypią w obrębie całego naskórka [9]. W 2002 r. Berhane i wsp. zaproponowali inną klasyfikację, w której AK podzielili na trzy kategorie: asymptomatyczne, zapalne i SCC [10]. Postać zapalna ma rumieniowe halo, może być bolesna. Uważa się, że naciek zapalny w AK stanowi mechanizm obronny, który jeśli jest skuteczny, prowadzi do regresji, a jeśli nie jest, to dochodzi do progresji do SCC [10].

Trudno jest jednak jednoznacznie ustalić, które AK ma szanse na przejście w SCC. Poza cechami klinicznymi, takimi jak większa wyczuwalność, stwardnienie, krwawienie i stan zapalny, niektórzy autorzy sugerują, że złośliwą transformację mogą warunkować czynniki genetyczne [10]. Być może odgrywa tu rolę predyspozycja genetyczna związana z zaburzeniami funkcji nowo wykrytych genów EVER.

Cel pracy

Celem pracy było określenie zależności pomiędzy wybranymi polimorfizmami genu EVER2: rs7208422, rs35748721, rs62079073, rs112802399, rs12452890, a występowaniem SCC u pacjentów z AK.

Materiał i metodyka

Badaniu poddano 100 pacjentów z AK w wieku 48–91 lat, w tym 50 kobiet i 50 mężczyzn. Rozpoznanie AK ustalono na podstawie wywiadu, obrazu klinicznego oraz badania histopatologicznego. Średni wiek pacjentów wynosił 75,27 ±7,07 roku, a mediana 75 lat (zakres: 48,0–91,0 lat). Średni czas trwania AK dla całej grupy wynosił 7,38 ±5,88 roku, a mediana 5 lat (zakres od 3 miesięcy do 30 lat). Pierwsze zmiany na skórze pacjentów pojawiły się w wieku średnio 67,93 ±8,51 roku, a mediana wynosiła 69 lat (zakres: 43,0–89,0 lat).

Do grupy kontrolnej (GK) zakwalifikowano 380 osób, w tym 190 kobiet i 190 mężczyzn. Grupę kontrolną stanowiły osoby poddane badaniu w kierunku ustalenia ojcostwa na terenie województwa mazowieckiego (dzięki uprzejmości prof. dr. hab. med. Rafała Płoskiego z Zakładu Genetyki Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego). Próbki krwi GK pochodziły z banku DNA i były wybierane losowo. Wszystkie osoby z GK wyraziły pisemną zgodę na anonimowe wykorzystanie ich DNA do badań naukowych.

DNA izolowano z pełnej krwi pobranej do probówek zawierających kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA). Do izolacji DNA użyto zestawu firmy Macherey-Nagel z użyciem buforów MB1, MB2, MB3, MB4, MB5 i MB6 oraz magnetic beats i rozdzielacza magnetycznego. Dla izolowanych próbek wykonano spektrofotometryczny pomiar absorpcji roztworu DNA przy długości fali 260 nm i drodze optycznej 1 mm. Do tego celu użyto aparatu NanoDrop® ND-100 Spectrophotometer. Po oznaczeniu stężenia próbki zostały rozcieńczone (lub zagęszczone) do stężenia 600 ng/l. Do genotypowania polimorfizmów wykorzystano reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (ang. real time-polymerase chain reaction – RT-PCR) przy użyciu sond typu Taqman, które są oligonukleo-tydami o długości 20–30 pz. Sondy te wyznakowane są barwnikami fluorescencyjnymi – na końcu 5’ barwnikiem reporterowym, natomiast na końcu 3’ wygaszaczem (ang. quencher). Do przeprowadzenia reakcji wykorzystano dwa rodzaje barwników reporterowych: 6-karboksyfluoresceinę (FAM) oraz VIC. Jako wygaszacza użyto 6-karboksytetrametylorodaminy (TAMRA). W celu uniknięcia błędów wynikających z niedokładności pipetowania lub zmiennych stężeń próbek w metodzie tej stosuje się dodatkowo barwnik pasywny 6-karboksy-X-tetrametylorodaminę (ROX).



Analiza statystyczna



Rozkład genotypów w porównywanych grupach analizowano za pomocą testu 2. Analizy prowadzono przy założeniu różnych modeli dziedziczenia, tj. recesywnego, kodominującego albo dominującego. Obliczenia realizowano z użyciem programu Web-Assotest (http://www.ekstroem.com/assotest/assotest.html) [11]. Porównywano częstości występowania alleli w badanych grupach z użyciem programu dostępnego w internecie (http://ihg.gsf.de/cgi-bin/hw/hwal.pl). Analizy wieloczynnikowe prowadzono z użyciem wieloczynnikowej regresji logistycznej, wykorzystując pakiet SPSS. Jako próg znamienności statystycznej przyjmowano p = 0,05.

Wyniki

W tabeli I przedstawiono charakterystykę badanych polimorfizmów.

U pacjentów z AK i współistniejącymi SCC genotypy TT i TG polimorfizmu rs62079073 genu EVER2 oraz allel T były nieobecne, a cała grupa zawierała tylko genotyp GG, natomiast u chorych na AK bez obecności SCC rozkład dla polimorfizmu rs62079073 był następujący: genotyp GG występował u 63 pacjentów (82,9%), TG był obecny u 10 pacjentów (13,2%), a genotyp TT u 3 pacjentów (3,9%). W analizach stwierdzono istotnie statystycznie wyższą częstość występowania genotypu GG u pacjentów z obecnością SCC w porównaniu z pacjentami bez współistnienia SCC (20 z 20 pacjentów, 100% vs 63 z 76 pacjentów, 82,9%, p = 0,01) (tab. II). Wykazano również istotnie statystycznie wyższą częstość występowania allela T u pacjentów bez obecności SCC w porównaniu z chorymi, u których stwierdzono SCC (0% vs 10,5%; p = 0,026). Następnie przeprowadzono analizę porównawczą pacjentów z AK z obecnością SCC i GK, w której częstości występowania zarówno genotypów, jak i allela T polimorfizmu rs62079073 nie wykazywały znamienności statystycznej (p = 0,18 dla genotypu GG; p = 0,126 dla allela T) (tab. II). Z uwagi na brak potwierdzenia uzyskanego wyniku w porównaniu z GK przeprowadzono analizę wieloczynnikową regresji logistycznej z uwzględnieniem następujących parametrów klinicznych: płeć pacjentów, liczba zmian skórnych, wiek wystąpienia AK, czas trwania choroby, rozległość zmian skórnych o charakterze AK, współistnienie raków podstawnokomórkowych, fototyp skóry, obecność oparzeń słonecznych w dzieciństwie i przewlekła ekspozycja na promieniowanie słoneczne w wywiadzie. W analizie wykazano, że niezależnym czynnikiem wpływającym na wystąpienie SCC u pacjentów z AK jest genotyp GG (p = 0,034) (tab. III).

Analiza występowania kolejnego polimorfizmu genu EVER2 rs7208422 u pacjentów z AK w zależności od współistnienia SCC nie wykazała różnic w częstościach występowania zarówno genotypów, jak i poszczególnych alleli w obu grupach pacjentów. Rozkład genotypów i alleli był podobny (p = 0,811 dla ge-notypu TT, p = 0,459 dla genotypu AA, p = 0,76 dla

allela T) (tab. IV). Podobnie nie wykazano różnic w częstościach występowania zarówno genotypów, jak i poszczególnych alleli u pacjentów, u których stwierdzono lub nie stwierdzono obecności skórnych SCC dla trzeciego polimorfizmu rs12452890 genu EVER2

(p = 0,96 dla genotypu GG; p = 0,83 dla genotypu AA, p = 0,86 dla allela G) (tab. V). Ze względu na bardzo rzadkie występowanie dwóch pozostałych polimorfizmów rs35748721 i rs112802399 w badanych grupach pacjentów analizy statystyczne nie zostały wykonane.

Omówienie

Dane dotyczące związku genów EVER ze stanami przednowotworowymi i rakami skóry pochodzą z badań dotyczących rzadkiej, genetycznie uwarunkowanej choroby epidermodysplasia verruciformis (EV). Dotychczas udało się zidentyfikować dwa geny, tj. EVER1 i EVER2, których mutacje są odpowiedzialne za pojawienie się objawów tego schorzenia [12, 13]. epidermodysplasia verruciformis charakteryzuje się występowaniem na skórze zmian typu brodawek oraz zmian przypominających łupież pstry, które po różnie długim czasie mogą przekształcić się w SCC [14]. Czynnikiem warunkującym kancerogenezę w EV są onkogenne wirusy EV HPV, których DNA również stwierdza się w znacznym odsetku w AK i w SCC w populacji ogólnej [15].

Wiadomo, że AK jest najczęstszym stanem przedrakowym, który może stanowić punkt wyjścia SCC. Proces rozwoju SCC na podłożu AK jest powolny i zwykle trwa 10–20 lat [16]. Dane dotyczące częstości tego przejścia są rozbieżne, oceniano ją na 0,025–16% wszystkich przypadków AK [17, 18]. Należy również pamiętać, że AK może w ponad 25% przypadków

ustąpić samoistnie, jeśli pacjent unika ekspozycji na promieniowanie słoneczne [19]. Wydaje się, że w procesie przekształcania AK do SCC poza takimi czynnikami, jak nadmierne narażenie na działanie promieniowania słonecznego, wiek, płeć, immunosupresja, rolę mogą odgrywać również czynniki genetyczne [20].

Założenia niniejszej pracy oparto na hipotezie, że geny EVER mogą ulegać zaburzeniu u osób z AK i przyczyniać się do pojawiania się SCC skóry w populacji ogólnej. Interesujący jest fakt, że we wcześniej przeprowadzonych badaniach wykazano większą częstość występowania AK i SCC skóry u pacjentów z zaburzeniami chromosomalnymi o charakterze utraty heterozygotyczności (ang. loss of heterozygosity – LOH) na chromosomie 17 qter, gdzie zlokalizowane są oba geny EVER [21, 22]. Geny te są obecne w obrębie locus EV1, który znajduje się na chromosomie 17q25 w odległości 1-cM pomiędzy markerami D17S939 a D17S802. Należy podkreślić, że dotychczas nie ma doniesień w piśmiennictwie na temat wykrycia mutacji genów EVER w żadnym innym niż EV schorzeniu. Dostępne prace oceniają polimorfizmy genów EVER i dotyczą raka szyjki macicy, w którego powstaniu wieloletnie badania doświadczalne, kliniczne i epidemiologiczne potwierdziły rolę onkogennych HPV [23, 24].

Badania własne dotyczące polimorfizmów genu EVER2 w skórnej kancerogenezie zostały zainspirowane przez prace Patela i wsp., którzy wykazali związek pomiędzy występowaniem zmienności genetycznej w obrębie genu EVER2 a zwiększonym ryzykiem wystąpienia SCC [25]. W tej jedynej dotychczas opublikowanej pracy stwierdzono, że obecność genotypu TT polimorfizmu rs7298422 wiąże się z większym o 70% ryzykiem wystąpienia SCC w stosunku do GK (OR = 1,7; 95% CI = 1,1–2,7; p = 0,01).

W niniejszej pracy do analiz genetycznych wybrano również gen EVER2, ponieważ mutacje w jego obrębie zostały stwierdzone w polskiej populacji chorych z EV (Majewski i wsp., dane nieopublikowane).

Wyniki przeprowadzonych analiz wskazują na istnienie zależności pomiędzy polimorfizmem rs62079073 genu EVER2 a współistnieniem SCC u chorych z AK. Polimorfizm rs62079073 polega na zastąpieniu guaniny tyminą w intronie 8, w miejscu składania eksonów, przez co może mieć znaczenie patogenetyczne. W piśmiennictwie nie ma badań, w których poddano by ocenie ten polimorfizm. W niniejszej pracy polimorfizm ten został wybrany ze względu na jego częstsze występowanie w porównaniu z innymi polimorfizmami, ponieważ wiadomo, że częstość występowania allela T w populacji europejskiej wynosi 0,09. W analizie grupy pacjentów z AK stwierdzono brak genotypu TT oraz genotypu TG u pacjentów ze współistniejącymi SCC w porównaniu z pacjentami, u których występowały tylko zmiany typu AK. W związku z tym analogicznie allel T również nie występował u osób z AK i SCC. Częstość genotypu GG u pacjentów z AK i SCC wynosiła 100% w porównaniu z grupą tylko z AK, gdzie wynosiła ona 82,9%. Uzyskane wyniki mogą sugerować protekcyjne działanie genotypu TT oraz allela T w stosunku do rozwoju SCC u pacjentów z AK. Hipotezę tę popiera wynik analizy regresji wielowymiarowej, w której ocenie poddano wszystkie badane parametry kliniczne. Wykazano, że niezależnym czynnikiem wpływającym na wystąpienie SCC u pacjentów z AK jest dominujący genotyp GG.

Nie uzyskano natomiast wyników istotnych statystycznie w odniesieniu do polimorfizmu rs7208422 genu EVER2, którego związek z ryzykiem rozwoju SCC został wykazany w pracy Patela i wsp. [25]. Nie wy-kazano również różnic istotnych statystycznie w przypadku pozostałych trzech polimorfizmów.

Uzyskane istotne statystycznie wyniki mogą wskazywać na rolę genetycznej zmienności w genie EVER2 w skórnej kancerogenezie. Dokładne wyjaśnienie znaczenia polimorfizmów genów EVER1 i EVER2 w rakach i stanach przedrakowych wymaga dalszych badań. W dotychczas przeprowadzonych badaniach nad funkcją genów EVER stwierdzono, że białka kodowane przez te geny mają zdolność do wiązania się z głównym transporterem cynku ZnT1, formując kompleksy ZnT-1/EVER, i uczestniczą w utrzymywaniu równowagi cynkowej w komórce. Najprawdopodobniej odgrywa to rolę w kontroli zakażenia keratynocytów przez HPV i/lub wpływa na odpowiedź immunologiczną kontrolującą usuwanie zakażonych przez EV HPV keratynocytów [26]. Dokładna rola tego zjawiska w skórnej kancerogenezie wymaga jeszcze wyjaśnienia w toku dalszych obserwacji.

Podsumowanie

Różna ekspresja zmian skórnych o charakterze SCC u pacjentów z AK może zależeć nie tylko od wpływu czynników środowiskowych, lecz także od predyspozycji genetycznych, być może związanych m.in. z zaburzeniami w genach EVER. Przedstawione badania mogą wskazywać na rolę polimorfizmu genu EVER2 w procesie progresji zmian nowotworowych skóry. Wiadomo, że charakter polimorfizmów może mieć nie tylko wpływ promujący, lecz także, co wykazano w niniejszej pracy, wpływ protekcyjny na kancerogenezę skórną w zależności od ich lokalizacji w obrębie tego genu. Dokładne poznanie funkcji polimorfizmów genu EVER2 w skórnej kancerogenezie wymaga dalszych badań.



Piśmiennictwo

 1. Frost C.A., Green A.C.: Epidemiology of solar keratoses. Br J Dermatol 1994, 131, 455-464.

 2. Marks R.: Nonmelanotic skin cancer and solar keratoses. The quiet 20th century epidemic. Int J Dermatol 1987, 26, 201-205.

 3. Evans C., Cockerell C.J.: Actinic keratosis: time to call a spade a spade. South Med J 2000, 93, 734-736.

 4. Lober B.A., Lober C.W.: Actinic keratosis is squamous cell carcinoma. South Med J 2000, 93, 650-655.

 5. Madan V., Lear J.T., Szeimies R.M.: Non-melanoma skin cancer. Lancet 2010, 375, 673-685.

 6. Marks R., Rennie G., Selwood T.S.: Malignant transformation of solar keratoses to squamous cell carcinoma. Lancet 1988, 1, 795-797.

 7. Bendl B.J., Graham J.H.: New concepts on the origin of squamous cell carcinomas of the skin: solar (senile) keratosis with squamous cell carcinoma: a clinicopathologic and histochemical study. Proc Natl Cancer Conf 1970, 6, 471-488.

 8. Fukamizu H., Inoue K., Matsumoto K., Okayama H., Moriguchi T.: Metastatic squamous-cell carcinomas derived from solar keratosis. J Dermatol Surg Oncol 1985, 11, 518-522.

 9. Fu W., Cockerell C.J.: The actinic (solar) keratosis: a 21st-century perspective. Arch Dermatol 2003, 139, 66-70.

10. Berhane T., Halliday G.M., Cooke B., Barnetson R.S.: Inflammation is associated with progression of actinic keratoses to squamous cell carcinomas in humans. Br J Dermatol 2002, 146, 810-815.

11. Hausen S.K., Gjesing A.P., Rasmussen S.K., Glumer C., Urhammer S.A., Andersen G. i inni: Large-scale studies of the insulin gene variable-number-of tandem-repeats polymorphism in relation to type 2 diabetes mellitus and insulin release. Diabetologia 2004, 47, 1079-1087.

12. Ramoz N., Rueda L.A., Bouadjar B., Favre M., Orth G.: A susceptibility locus for epidermodysplasia verruciformis, an abnormal predisposition to infection with the oncogenic human papillomavirus type 5, maps to chromosome 17qter in a region containing a psoriasis locus.

J Invest Dermatol 1999, 112, 259-263.

13. Ramoz N., Taieb A., Rueda L.A., Montoya L.S., Bouadjar B., Favre M. i inni: Evidence for a nonallelic heterogeneity of epidermodysplasia verruciformis with two susceptibility loci mapped to chromosome regions 2p21-p24 and 17q25. J Invest Dermatol 2000, 114, 1148-1153.

14. Orth G.: Genetics of epidermodysplasia verruciformis: insights into host defense against papillomaviruses. Semin Immunol 2006, 18, 362-374.

15. Pfister H., Fuchs P.G., Majewski S., Jablonska S., Pniewska I., Malejczyk M.: High prevalence of epidermodysplasia verruciformis-associated human papillomavirus DNA in actinic keratoses of the immunocompetent population. Arch Dermatol Res 2003, 295, 273-279.

16. zur Hausen H.: Papillomavirus infections: a major cause of human cancers. Biochim Biophys Acta 1996, 1288, F55-F78.

17. Glogau R.G.: The risk of progression to invasive disease.

J Am Acad Dermatol 2000, 42, 23-24.

18. Jeffes E.W., Tang E.H.: Actinic keratosis. Current treatment options. Am J Clin Dermatol 2000, 1, 167-179.

19. Marks R., Foley P., Goodman G., Hage B.H., Selwood T.S.: Spontaneous remission of solar keratoses: the case for conservative management. Br J Dermatol 1986, 115, 649-655.

20. Kalińska-Bienias A., Majewski S.: Rola czynników genetycznych w skórnej kancerogenezie. Przegl Dermatol 2013, 100, 118-124.

21. Quinn A.G., Sikkink S., Rees J.L.: Basal cell carcinomas and squamous cell carcinomas of human skin show distinct patterns of chromosome loss. Cancer Res 1994, 54, 4756-4759.

22. Rehman I., Takata M., Wu Y.Y., Rees J.L.: Genetic change in actinic keratoses. Oncogene 1996, 12, 2483-2490.

23. Castro F.A., Ivansson E.L., Schmitt M., Juko-Pecirep I., Kjellberg L., Hildesheim A. i inni: Contribution of TMC6 and TMC8 (EVER1 and EVER2) variants to cervical cancer susceptibility. Int J Cancer 2012, 130, 349-355.

24. Wang S.S., Gonzalez P., Yu K., Porras C., Li Q., Safaeian M. i inni: Common genetic variants and risk for HPV persistence and progression to cervical cancer. PLoS One 2010, 5, e8667.

25. Patel A.S., Karagas M.R., Pawlita M., Waterboer T., Nelson H.H.: Cutaneous human papillomavirus infection, the EVER2 gene and incidence of squamous cell carcinoma: a case-control study. Int J Cancer 2008, 122, 2377-2379.

26. Lazarczyk M., Pons C., Mendoza J.A., Cassonnet P., Jacob Y., Favre M.: Regulation of cellular zinc balance as a potential mechanism of EVER-mediated protection against pathogenesis by cutaneous oncogenic human papillomaviruses. J Exp Med 2008, 205, 35-42.



Otrzymano: 9 IX 2013 r.

Zaakceptowano: 23 IX 2013 r.