Współcz Onkol (2000) vol. 4, 6 (279-284)
WSTĘP
W wyniku olbrzymiego postępu biologii molekularnej i komórkowej, jaki dokonał się w 2. połowie mijającego stulecia, w zakresie nauk medycznych pojawiły się nowe, do niedawna niewyobrażalne możliwości diagnostyczne i terapeutyczne. Odnoszą się one w szczególności do badań w zakresie patogenezy chorób o podłożu genetycznym. Wiadomo, że patogeneza schorzeń nowotworowych i wielu chorób nabytych tkwi w zmutowanych genach. Techniki sekwencjonowania genomów oraz skomputeryzowana analiza porównawcza otwierają drogę do usuwania zmutowanych pod względem genetycznym komórek (przeciwciała monoklonalne), zwiększania puli zdrowych komórek o właściwym garniturze genetycznym (terapia genowa) bądź blokowania ekspresji zmutowanego genu (strategia antygenowa i antysensowa). Szczególnie zaawansowane są prace badawcze dotyczące blokowania ekspresji wybranego genu za pomocą antysensowych oligonukleotydów.
Wprawdzie z zakresu tej ostatniej strategii terapeutycznej w piśmiennictwie polskojęzycznym ukazało się w połowie lat 90. kilka prac o charakterze monograficznym, prezentujących podstawy teoretyczne oraz metodologiczne [1, 2], jednak ostatnie 5 lat zaowocowało szeregiem doniesień w literaturze światowej, weryfikujących słuszność poczynionych założeń [3, 4]. Liczne są także opracowania monograficzne, w głównej mierze sumujące wyniki metodologii i skuteczności strategii antysensowej modulacji ekspresji genów [5]. Oczywiście, tematyka badań w tej dziedzinie jest bardzo szeroka, niemożliwe jest dokonanie przeglądu tak szerokiej dziedziny badawczej w jednej pracy.
W niniejszym artykule podjęto próbę zaprezentowania najbardziej zaawansowanych badań klinicznych z zastosowaniem antysensowych oligonukleotydów.
PODSTAWY TEORETYCZNE
I METODOLOGICZNE
Powszechnie wiadomo, że informacja genetyczna zakodowana jest w genach ulokowanych w chromosomalnym DNA. W momencie, gdy gen ulega ekspresji, informacja zawarta w sekwencji nukleotydów chromosomalnego DNA zostaje przepisana na komplementarną pod względem sekwencji nukleotydów nić pre-mRNA. Po procesie zwanym składaniem (zostają wówczas usunięte niekodowane odcinki nukleotydów, zwane eksonami i ligowane są odcinki kodujące, tzw. introny) dojrzałe czynnościowo mRNA opuszcza jądro komórkowe i w cytoplazmie sekwencja cząsteczki mRNA zostaje tłumaczona z udziałem rybosomów i szeregu innych biomolekuł, jak tRNA, ATP i czynniki elongacyjne (translacja) na odpowiednią sekwencję aminokwasów łączonych w łańcuch polipeptydowy białka.
Strategia antysensowych oligonukleotydów zakłada wybiórcze hamowanie biosyntezy niechcianych białek (np. białek kodowanych w materiale genetycznym wirusa w komórkach organizmu ludzkiego) na drodze asocjacji antysensowego konstruktu do wybranych i ściśle określonych sekwencji pre-RNA, zaburzając jego składanie. Następuje również hybrydyzacja z wyselekcjonowanym fragmentem cytoplazmatycznego dojrzałego mRNA (blokując fizyczny dostęp do rybosomu bądź tworząc heterodupleks rozpoznawany i degradowany przez RNA-zę H – enzym degradujący mRNA skompleksowany z DNA). Antysensowe konstrukty oligonukleotydowe stanowią 12–30-merowe fragmenty DNA bądź ich analogi. Z obliczeń statystycznych wynika, że wybrana kombinacja 12 nukleotydów może wystąpić tylko raz w mRNA. Komplementarna (antyrównoległa, oddziaływania poprzez wiązania wodorowe typu Watsona i Cricka) sonda oligonukleotydowa zawierająca minimum 12 nukleozasad powinna, na podstawie obliczeń teoretycznych, rozpoznawać wybrany segment RNA ze 100-procentowym prawdopodobieństwem.
Idealny antysensowy oligonukleotyd powinien:
∙ przenikać przez błonę komórkową tak, aby dotrzeć do wyselekcjonowanej sekwencji,
∙ selektywnie hybrydyzować do sekwencji RNA, by zminimalizować ewentualne niespecyficzne działanie toksyczne,
∙ być opornym na działanie zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych enzymów nukleolitycznych,
∙ nie oddziaływać z białkami komórkowymi.
Istotne jest także, aby potencjalne produkty degradacji antysensowych oligonukleotydów nie mogły być wykorzystywane do de novo syntezy DNA, co mogłoby powodować niepożądane mutacje.
Trwałość antysensowego oligonukleotydu determinowana jest głównie odpornością na działanie endo- i egzonukleaz, które powodują szybką degradację obcego DNA poprzez rozszczepianie wiązań fosfodiestrowych. Cel ten jest realizowany poprzez modyfikacje chemiczne tego wiązania, polegające np. na zastąpieniu atomu tlenu w internukleotydowym wiązaniu fosforanowym atomem siarki (oligonukleotydotiofosforany, dla uproszczenia – PS-oligonukleotydy) lub grupą metylową (oligonukleozydometanofosfoniany). PS-oligonukleotydy stanowią I generację antysensowych struktur będących izosterycznymi i izoelektronowymi analogami naturalnych oligonukleotydów.
PS-oligonukleotydy wykazują zadowalającą trwałość w roztworach fizjologicznych, hybrydyzują do specyficznie wybranego fragmentu mRNA, są transportowane do komórki i uaktywniają RNA-zę H. Spełniają zatem wszystkie założone funkcje konstruktów antysensowych. Dzięki wczesnemu opracowaniu metody syntezy na fazie stałej, ich dostępność umożliwiła podjęcie prób zastosowania ich początkowo in vitro, a następnie in vivo na modelach zwierzęcych [6, 7, 8], a w ciągu ostatnich lat, także na etapie prób klinicznych.
Jakkolwiek pierwsze wyniki badań były bardzo zachęcające, opublikowane w ostatnich 5 latach prace doświadczalne dotyczące zastosowań PS-oligonukleotydów w warunkach in vivo pokazały, że efekt ich działania nie jest w pełni zgodny z idealistycznymi założeniami [9, 10]. Obok problemów często sygnalizowanej niepowtarzalności wyników wykazano efekty ich niespecyficznego działania, które mogą zależeć od różnej sekwencji antysensowego oligonukleotydu bądź jego 2-rzędowej struktury, oddziaływania z białkami (efekt aptameryczny), jak i ich polianionowej natury.
Przykładowo oligonukleotydy bogate w sekwencje.. CpG.. lub zawierające motyw.. GGGG... wywołują odpowiedź immunologiczną bądź proliferację komórek. Oligonukleotydy bogate w reszty G charakteryzują się odmiennym przenikaniem do komórki, tkankową dystrybucją i farmakokinetyką, natomiast zawierające powtarzający się motyw CpG wywołują efekt immunostymulujący poprzez indukcję cytokin Il-12, Il-6, IFNγ, TNFα [11]. Jakkolwiek ten, z założenia niepożądany efekt działania, może być wykorzystany w niektórych przypadkach jako immunomodulator przeciwwirusowy bądź antybakteryjny, np. w terapii przeciwzapalnej [9], jest on niekorzystny w odniesieniu do zaplanowanego działania jako konstruktu antysensowego. Ugrupowanie tiofosforanowe w wiązaniach internukleotydowych, odpowiedzialne za polianionową naturę PS-oligonukleotydu, jak i odporność na działanie nukleaz, wywołuje niekorzystne objawy uboczne w warunkach in vivo, np. wydłużenie czasu APTT. Dowiedziono, że występuje on zależnie od długości i dawki podanego antysensu, a nie od jego sekwencji [10]. PS-oligonukleotydy wiążą się także z wieloma białkami surowicy krwi. Powinowactwo to jest najsilniejsze w szeregu: fibrynogen > γ-globuliny > albuminy [9]. W znacznie wyższych dawkach aniżeli wymagane dla aktywności antysensowych oligonukleotydów w warunkach in vivo, PS-oligonukleotydy mogą hamować wiele enzymów [12, 13]:
∙ γ-polimerazę,
∙ czynnik wzrostu,
∙ białko kinazy C,
∙ odwrotną transkryptazę,
∙ RNA-zę H,
∙ RNA-zę L,
∙ receptor CD4.
Przyczyny interakcji PS-oligonukleotydów z białkami nie zostały dostatecznie wyjaśnione. Jeśli oligonukleotydy antysensowe posiadają wewnętrzną komplementarność albo sekwencje palindromowe, mogą formować 2-rzędowe stabilne struktury, takie jak krótka podwójna nić, szpilka czy decoy, co może z jednej strony wpływać na dostępność konstruktu antysensowego do nici mRNA, z drugiej strony może wykazywać działanie niespecyficzne, objawiające się w postaci niepożądanych efektów ubocznych [14]. Dostęp antysensowych oligonukleotydów do docelowego mRNA zależy w dużej mierze od 2-rzędowej struktury RNA. Ostatnio wykazano np., że miejsca na mRNA o motywie sekwencji... GGGA... są łatwiej blokowane przez antysensowy oligonukleotyd [15].
Terapeutyczna przydatność I generacji antysensowych oligonukleotydów, tj. PS-oligonukleotydów, została udowodniona w leczeniu CMV (cytomegalovirus), indukującego zapalenie siatkówki [16]. Mimo szeregu niepowodzeń innych terapeutycznych zastosowań PS-oligonukleotydów, sukces ten nadal stwarza nadzieję na możliwości szerszego zastosowania tej nowej metody leczenia. Ze względu na powszechność i ciągle niezadowalający sposób hamowania skutków chorób nowotworowych, najwyższą intensywność badań nad skutecznością strategii antysensowej obserwuje się zwłaszcza w tej dziedzinie badań promedycznych.
W celu zachowania integralności konstruktów antysensowych wprowadzono ich dalsze modyfikacje, np. za pomocą 2’-O-alkilorybonukleozydów wprowadzonych na 3’- i 5’-końcach oligonukleotydów, uzyskując zwiększoną ich lipofilowość oraz odporność na działanie egzonukleaz. Podobnie poprzez inkorporacje internukleotydowych wiązań metanofosfonianowych uzyskano:
∙ efekt zmniejszenia ładunku ujemnego (obniżenie polianionowości),
∙ zwiększoną lipofilowość (lepszy transport dokomórkowy),
∙ pełną odporność na działanie fosfodiesteraz [17].
Efekt immunostymulujący oligonukleotydów antysensowych zmniejszono poprzez unikanie motywów... CpG... zastępując je odpowiednio C2’-OMe i 7-deazaguanozyną. Oligonukleotydy zsyntetyzowane z więcej niż 1 z ww. modyfikacją wiązań chemicznych, zwane MBOs (ang. mixed-backbone oligonucleotides) stanowią II generację oligonukleotydów antysensowych [18]. Ponadto, MBOs zawierające w środkowej sekwencji PS-oligonukleotydy (minimum 5 nukleozasad) wykazują większe powinowactwo do docelowego RNA, zwiększając przy tym aktywność RNA-zy H.
Sugeruje się, że końcowo zmodyfikowane MBOs osiągną taki poziom stabilności, że będzie można stosować je w formie doustnej lub dojelitowo.
Podsumowując, MBOs wykazują poprawę specyficzności, biologicznej aktywności, stabilności in vivo, farmakokinetyki i profilu bezpieczeństwa [19].
Jak wspomniano powyżej, ważne jest wnikanie antysensowych oligonukleotydów do komórki. In vivo transport oligonukleotydów zależy od czynników, takich jak:
∙ typ komórki,
∙ kinetyka transportu,
∙ warunki hodowli kultury tkankowej,
∙ natura chemiczna antysensowego oligonukleotydu
i odbywa się najczęściej na zasadzie endocytozy, zależnej od jego długości i sekwencji. Każdy z tych czynników może wpłynąć na biologiczną aktywność antysensowego oligonukleotydu. Jedną z metod ułatwiających ich transport dokomórkowy jest zamknięcie oligonukleotydu w liposomach, uzyskując tym samym większe ich stężenie wewnątrzkomórkowe i ochronne działanie przed nukleazami [20]. Jakkolwiek ten sposób ułatwiania transportu dokomórkowego jest z powodzeniem stosowany w doświadczeniach na liniach komórkowych, jak i w ludzkiej terapii genowej, to w realizacji strategii antysensowej musi być przyjmowany z wielką ostrożnością, gdyż częste podawanie antysensowych oligonukleotydów łącznie z liposomami może prowadzić do akumulacji liposomów w wątrobie.
PRZYKŁADY PRÓB ZASTOSOWAŃ
KLINICZNYCH ANTYSENSOWYCH
OLIGONUKLEOTYDÓW
Obecnie sprawdzane możliwości zastosowania terapii antysensowej dotyczą głównie:
∙ onkologii klinicznej,
∙ angioplastyki naczyń wieńcowych,
∙ chorób neurologicznych,
∙ leczenia niektórych chorób wirusowych i pasożytniczych.
Wybrane przykłady klinicznych prób wprowadzenia terapii antysensowej, które uzyskały akceptację FDA, przedstawiono w tab. 1.
Ze względu na restrykcje objętościowe, w tej prezentacji prób klinicznych terapii z użyciem antysensowych oligonukleotydów ograniczono się do zaprezentowania 1 przykładu, budzącego wiele nadziei w leczeniu chorób nowotworowych. Wg szeregu doniesień literaturowych, prezentacji konferencyjnych i internetowych wydaje się, że wkrótce należy oczekiwać rejestracji kolejnego antysensowego leku przeciwnowotworowego [21]. Jako cel ataku grupa specjalistów z firmy biotechnologicznej Genta Incorporation, New Jersey, wybrała oncogen bcl-2.
Dlaczego oncogen bcl-2?
Warunkiem zdrowia każdego organizmu jest zachowanie równowagi pomiędzy replikacją komórek a ich apoptozą. Zaburzenie tej równowagi ma różne następstwa. Upośledzona zdolność organizmu do apoptozy może powodować rozwój raka, chorób autoimunnologicznych, zaś jej nadmiar występuje w udarze mózgu, zawale mięśnia sercowego, chorobie Alzheimera, chorobie Parkinsona.
Najwcześniej opisanym białkiem apoptycznym był produkt genu bcl-2 [22, 23]. Rolę tego genu najwcześniej opisano w patofizjologii limfocytów B, a jego nazwa pochodzi od B-cell leukemia/lymphoma – Bcl-2 [24].
Obecnie uważa się, że białkami regulującymi przepuszczalność błon mitochondrialnych są białka z rodziny Bcl-2 oraz ich homologi. Wiele kluczowych elementów w trakcie apoptozy ma miejsce w mitochondriach:
∙ zaburzenia transportu elektronów,
∙ produkcja ATP i fosforylacji oksydatywnej,
∙ uwalnianie protein aktywujących kaspazy,
∙ zmiany potencjału oksydacyjno-redukującego.
Ważnym ogniwem łączącym apoptozę i mitochondria jest obecność protein z rodziny Bcl-2 w błonie komórkowej mitochondriów. Należą do nich zarówno białka stymulujące proces apoptozy (Bax, Bad, Bcl-Xs, Bak, Bid, Bik, Hrk), jak i ten proces hamujące (Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Brag-1, Mcl-1, BHRF1, E1B 9 kDa) [25]. Białka te występują jako integralne składniki błon, także w siateczce śródplazmatycznej i okołojądrowej. Tworzą homo- i heterodimery, np. Bcl-2/Bcl-2, Bax/Bcl-2, Bax/Bax [26]. Stwierdzono, że przewaga homodimerów Bcl-2 decyduje o przeżyciu, podczas gdy przewaga Bax – o śmierci komórki. Ich wzajemne oddziaływania nie wynikają z bezwzględnej ich zawartości w komórce, lecz z wzajemnych relacji. Strukturalne podobieństwo białek rodziny Bcl-2 z tworzącą pory domeną błonową toksyny błoniczej sugeruje, że białka te tworzą kanały błonowe regulowane przez sygnały zależne od napięcia i pH [27]. Badania Grossa i wsp. [28] wykazały, że zarówno Bcl-2, jak i Bax tworzy kanały jonowe w błonach komórkowych o odmiennej przepuszczalności dla poszczególnych jonów; Bcl-2 jest specyficzny dla K+, natomiast Bax dla Cl–;.
Nie wiadomo jednak, w jaki sposób zmiany przewodzenia dla tych jonów mogą zmieniać Δφ (mitochondrialny potencjał błonowy) oraz uwalnianie AIF (apoptosis inducing factor), Apaf-2 (cytochrom c). Prawdopodobnie antyapoptyczny mechanizm działania Bcl-2 wynika z hamowania uwalniania AIF i cytochromu c (Apaf-2) z mitochondriów oraz z bezpośredniej integracji z Apaf-1 (apoptosis protease activating factor) blokując aktywację kaspazy 9 [29, 30].
Kaspazy (caspases: cysteine-dependent--aspartate-directed protease) są rodziną proteolitycznych enzymów cysteinowych, uczestniczących w kaskadzie wzbudzania śmierci komórki [31]. Znanych jest ponad 10 białek rodziny kaspaz. Kaspazy występują w komórce w stanie latentnym, gdyż w niskich stężeniach występują jako monomery, a do ich aktywacji wymagana jest polimeryzacja. Kofaktory służą do przybliżenia do siebie 2 lub więcej prekursorów, pozwalając na autoproteolityczną aktywację. Wykazano, że kluczowa prokaspaza 9, BCL-xL i Apaf-1 tworzy 3-składnikowy kompleks z możliwością inaktywacji tej kaspazy [32]. Kaspaza 9 uważana jest za proteazę o roli inicjującej w rodzinie kaspaz, spełniających funkcję nadrzędną w stosunku do tzw. kaspaz wykonawczych. Ponadto sądzi się, że Bcl-2 należy również do silnych przeciwutleniaczy, funkcjonujących jako zmiatacze wolnych rodników, zabezpieczając błony lipidowe przed utlenianiem, a także pełni rolę białka regulującego aktywność enzymów zapobiegających procesom utleniania. Wykazano, że spośród wszystkich znanych dotychczas białek komórkowych, Bcl-2 jest najsilniejszym inhibitorem apoptozy wywołanej przez różne czynniki stresogenne, np. promieniowanie jonizujące, hipertermię, chemioterapeutyki, defekt czynników wzrostowych, glikoproteidy. Potwierdza to fakt, że nadekspresja bcl-2 chroni komórkę przed apoptozą wywołaną przez ROS (reactive oxygen species) [33, 34]. Białko Bcl-2 blokuje jeden z krytycznych stopni w przekaźnictwie sygnału apoptozy (wypływ Ca2+ z mobilnej puli zlokalizowanej w świetle siateczki śródplazmatycznej [35]. Współzależność między stężeniem ROS a uwalnianiem Ca2+ z siateczki śródplazmatycznej i mitochondriów mogłaby tłumaczyć ten mechanizm.
Warto podkreślić, iż interakcje pomiędzy Bcl-2 i białkami prionowymi (PrP) mogą mieć znaczenie w patogenezie neurozwyrodnieniowych chorób prionowych, takich jak syndrom Gerstmanna-Stausslera czy choroba Creutzfeldta-Jacoba. Białko Bcl-2 jest rozpatrywane m.in. jako bliżej nieznane białko X, które uczestniczy w przekształceniu PrP w jego patogenną izoformę PrPsc [36].
Duża liczba leków stosowanych obecnie w chemioterapii oraz kojarzonych z radioterapią ma na celu apoptozę komórek nowotworowych. Przez uszkodzenie DNA w tych komórkach dochodzi do aktywacji genu p53 nazywanego strażnikiem genomu, którego produkt blokuje komórki w fazie G1 cyklu komórkowego do czasu naprawy DNA. W przypadku, gdy komórka nie zdoła naprawić DNA, p53 włącza program śmierci za pośrednictwem białek z rodziny Bcl-2, z którymi pozostaje we wzajemnych zwrotnych zależnościach [37]. Brak białka p53 lub utrata jego apoptycznych właściwości, a także wysoki poziom Bcl-2 w komórkach nowotworowych, decydują często o jego niewrażliwości na stosowaną terapię.
Ostatnio zastosowano oligonukleotyd antysensowy do modyfikowania ekspresji genu bcl-x poprzez zahamowanie produkcji białka Bcl-xL, uzyskując tym samym wyższe poziomy białka Bcl-xS mającego przeciwstawne, proapoptyczne działanie [38].
Powyższe wyniki badań stały się podstawą włączenia do terapii antysensowych oligonukleotydów blokujących ekspresję onkogenów mających znaczenie w procesach niekontrolowanego rozrostu komórek nowotworowych. Na obecnym etapie prób klinicznych (I, II st.) oligonukleotydy antysensowe zastosowano do zablokowania ekspresji onkogenów: bcl-2, NF-KB (p65), c-myb, c-myc, erbB-2, jun, fos, Ha-ras, Ki-ras, DNA-metylotransferazy, PKA, c-raf kinazy, mdm 2, and PKC-α [39, 40, 41, 42, 43, 44]. Wykazano, że białko Bcl-2 występuje obficie w komórkach nowotworowych gruczolaków płuc, trzustki, jelita grubego, sutka, gruczołu krokowego i złośliwych chłoniaków, a nie zaobserwowano jego występowania w dojrzałych komórkach, z wyjątkiem grasicy i łożyska. Podwyższony poziom białka Bcl-2 blokującego zaprogramowaną śmierć komórki wiąże się ze złą prognozą procesu nowotworowego. Szczegółowa analiza dotychczasowych badań potwierdziła ważne znaczenie białka Bcl-2 jako niezależnego markera nowotworowego [45, 46].
Najwcześniejsze i obecnie najbardziej zaawansowane kliniczne badania zastosowania terapii oligonukleotydem antysensowym dotyczą nieziarniczego chłoniaka złośliwego, gdzie obserwuje się wysoką ekspresję genu bcl-2 we wszystkich komórkach nowotworu.
W początkowej fazie prób przedklinicznych zsyntetyzowano szereg oligonucleotydów komplementarnych do różnych regionów tego genu i drogą selekcji wytypowano 2 antysensowe PS-oligonukleotydy: G 3139 (18-nukleotydowy) i G 3854 (20-nukleotydowy). W kolejnej fazie badań wybrano oligonukleotyd G 3139 o sekwencji 5’-TCTCCCCAGCGTGCGCCAT-3’, gdzie wszystkie internukleotydowe wiązania są tiofosforanami. Stwierdzono, że po podaniu (dożylnym lub podskórnym) związek G 3139 kumuluje się głównie w szpiku kostnym, wątrobie, śledzionie, nerkach, układzie limfatycznym, w mniejszych ilościach w innych tkankach, śladowo w OUN [47], gdyż nie przenika przez barierę krew–mózg człowieka. Podskórne powolne podanie G 3139 wydłużało okres jego bioaktywności, stabilność wysycenia [47], ale wiązało się z występowaniem odczynu zapalnego w miejscu wkłucia. Terapia stosowana we wlewach dożylnych była najmniej toksyczna, z wyłączeniem bolusa, który powodował gwałtowne obkurczenie naczyń obwodowych i przyspieszał efekt antykoagulacyjny [47]. Pacjenci chorujący na nieziarniczy chłoniak złośliwy zakwalifikowani do terapii za pomocą G 3139 prezentowali różne etapy zaawansowania choroby, ale u wszystkich wykonano badanie immunohistochemiczne na obecność białka Bcl-2 w oparciu o biopsję z węzła chłonnego.
Obecny stan zaawansowania prac klinicznych z użyciem G 3139 przedstawiono w tab. 2. (w oparciu o udostępnione prywatne informacje dr. B. Klema, Genta Incorporation). Odnosząc się do wyników tych badań, należy podkreślić, iż u wszystkich pacjentów zakwalifikowanych do tych programów badań, niezależnie od stopnia zaawansowania zmian, kierując się względami etycznymi zastosowano początkowo powszechnie stosowaną chemioterapię, a następnie, przy braku poprawy klinicznej, podawano G 3139. Badania w serii GL 101 dotyczące pacjentów z nieziarniczym chłoniakiem złośliwym wykazały dobrą tolerancję tego PS-oligonukleotydu. Limitowane podawanie preparatu było częściowo związane z występowaniem takich objawów, jak:
∙ gorączka,
∙ osłabienie,
∙ spadek płytek krwi,
jakkolwiek towarzyszą one również chorobie podstawowej. Przemijająca hiperglikemia maks. do 12 mmol/l nie była zależna od stosowanej dawki, nie wymagała dodatkowego podawania leków i normalizowała się po zakończeniu podawania preparatu. Niektórzy pacjenci byli poddani dalszej obserwacji, trwającej ponad 3 lata po zakończeniu terapii i nie zaobserwowano u nich późniejszych objawów ubocznych ani innych procesów rozrostowych.
Podobne obserwacje dotyczyły pacjentów objętych programem badań G 102, w których stosowano wyższe dawki G 3139. Rutynowe monitorowanie czynności serca nie wykazało objawów kardiotoksycznych, które wcześniej obserwowano u małp stosowanych w badaniach doświadczalnych (podawano wyższe dawki). Wydłużony okres obserwacji, do ponad 15 mies. od zakończonej terapii, nie ujawnił u tych pacjentów wystąpienia niekorzystnych objawów ubocznych. W obydwu programach badań G 101 i G 102 farmakokinetyka podanego preparatu była podobna i wykazała, że osiągnięty poziom terapeutyczny przy stężeniu G 3139 w surowicy w granicach 1–8 μmol/ml wykazywał dobrą korelację między podaną dawką a stężeniem w surowicy krwi. Różnorodność podawanych dawek preparatu była podyktowana różnym stopniem zaawansowania procesu chorobowego. Stałe wysycenie leku w surowicy krwi osiągnięto po 24-godzinnym podawaniu preparatu we wlewie dożylnym. Półokres eliminacji leku był krótki i wynosił 2 godz. po zakończeniu wlewu dożylnego, dlatego też efekty działań ubocznych preparatu były krótkotrwałe. Obydwa badania potwierdziły oczekiwaną aktywność G 3139 objawiającą się obniżeniem poziomu białka Bcl-2 w pobranych bioptatach z węzłów chłonnych, przy nikłych objawach ubocznych.
Dwie kolejne serie badań (GM 103, GM 105) potwierdziły, że podana dawka i osiągnięty poziom stężenia G 3139 w surowicy krwi zredukował poziom białka Bcl-2, co wiązało się z kliniczną poprawą stanu pacjentów z czerniakiem i rakiem piersi. Terapia G 3139 zastosowana u pacjentów z rozpoznanym czerniakiem wydłużyła ich życie poprzez stabilizację procesu chorobowego. Warto przy tym zaznaczyć, że ze względu na stopień zaawansowania zmian chorobowych, u pacjentów tych zastosowano nawet 10 cykli dożylnego wlewu preparatu w ciągu roku, bez nasilenia objawów toksycznych. Nie miało to wpływu na farmakokinetykę leku, a dawki te były nawet dobrze tolerowane przez pacjentów poniżej 90. roku życia.
W 1. fazie prób klinicznych zastosowano wydłużony dożylny wlew kroplowy przez pompę infuzyjną G 3139 w cyklu 14–21-dniowym, uzyskując, jak wcześniej wspominano, dobrą tolerancję i farmakokinetykę preparatu. W 2. i 3. fazie prób klinicznych planuje się zastosowanie krótkich wlewów dożylnych, które powinny wykazać lepszą tolerancję stosowanego preparatu i byłyby wygodniejsze dla pacjentów. Możliwe jest podawanie podskórne G 3139 w 2 dawkach podzielonych dziennie.
Obok rezultatów badań klinicznych zaprezentowanych w tab. 2., w innych badaniach próbuje się zastosować, np. u chorych z rakiem prostaty, terapię skojarzoną (G3139 + chemioterapia, choć są to jeszcze zbyt małe grupy pacjentów (poniżej 6 w każdej grupie), aby uzyskiwane wyniki mogłyby być uznane jako statystycznie znamienne. Rozpoczynające się 3 inne badania pod nadzorem Narodowego Instytutu Raka USA dotyczą 1. i 2. fazy klinicznej z zastosowaniem antysensu G 3139 w terapii skojarzonej z chemioterapeutykami w leczeniu raka jelita grubego, płuc, ostrych białaczek, czerniaka.
Doniesienia naukowe badaczy z USA, Kanady i Wielkiej Brytanii dotyczące wyników badań z zastosowaniem G 3139 zarówno w monoterapii, jak w terapii kombinowanej z chemioterapeutykami [48] sugerują, że preparat ten jest skuteczny i może być bezpiecznie stosowany. Na ostateczne wyniki badań, aby uznać G 3139 za lek mogący wejść do powszechnie stosowanej terapii, poza ośrodkami prowadzącymi badania doświadczalne, należy poczekać. Jakkolwiek prześledzenie historii rozwoju strategii antysensowej odnotowuje finalne niepowodzenie antysensowej terapii w przypadkach AIDS oraz choroby Crohna [49], próby terapeutyczne wyłączające ekspresję genów odpowiedzialnych za etiopatogenezę i przebieg różnych chorób za pomocą antysensowych oligonukleotydów nadal stwarzają nadzieje, iż wkrótce klinicyści będą dysponować nową generacją leków informatycznych, tj. konstruowanych na podstawie informacji o zmianach genetycznych.
PIŚMIENNICTWO
1. Ratajczak M, Skórski T. Perspektywy wykorzystania strategii antysensów w medycynie doświadczalnej i klinicznej. Postępy Biologii Komórki 1994; 21: 177-96.
2. Stec WJ. Strategia antysensowych oligonukleotydów. Biotechnologia 1994; 4: 5-15.
3. Barton CM, Lemoine NR. Antisense oligonucleotides directed against p53 have antiproliferative effects unrelated to effects on p53 expression. Brit J Cancer 1995; 71: 429-37.
4. Smetsers TFCM, Linders EHP, van de Locht TF, de Witte TM, Mensink EJBM. An antisense Bcr-Abl phosphodiester-tailed methylphosphonate oligonucleotide reduces the growth of chronic myeloid leukaemia patient cells by a non-antisense mechanism. Brit J Haematol 1997; 96: 377-81.
5. Antisense Technology. vol. 313 of Methods in Enzymology 1999; Ed MI Phillips Academic Press, Inc., NY.
6. Agrawal S, Kandimalla ER. Medicinal chemistry of antisense oligonucleotides. In: Antisense Technology in the Central Nervous System. Leslie R, et al. (eds). Oxford University Press 1999; 108-36.
7. Morishita R, Gibbson GH, Ellison KE, et al. Single intraluminal delivery of antisense cdc 2 kinase and proliferating-cell nuclear antigen oligonucleotides results in chronic inhibition of neointimal hyperplasia. Proc Natl Acad Sci 1993; 90: 8474-78.
8. Ratajczak MZ, Kant JA, Luger SM, Huiya N, Zhang J, Gewirtz AM. In vivo treatment of human leukemia in a scid mouse model with c-myb antisense oligodeoxynucleotides. Proc Natl Acad Sci 1992; 89: 11823-27.
9. Agrawal S, Kandimalla ER. Antisense Therapeutics: is it assimple as complementary base recognition? Current Trends in Molecular Medicine Today 2000; 6: 72-81.
10. Shaw DR. Effects of synthetic oligonucleotides on human complement and coagulation. Biochem Pharmacol 1997; 53: 1123-32.
11. Rando RF, Hogan ME. Biological activity of guanosine quartet-forming oligonucleotides. In: Applied Antisense Oligonucleotide Technology. Stein CA, Krieg AM (eds). Wiley-Liss, New York 1998; 335-52.
12. Benimetskaya L, Tonkinson JL, Koziołkiewicz M, Karwowski B, Guga P, Zelser R, Stec WJ, Stein CA. Binding of Phosphorothioate Oligonucleotides to Basic Fibroblast Growth Factor, Recombinant Soluble CD4, Laminin and Fibronectin is P-Chirality Independent. Nucleic Acids Res 1995; 23: 4239-45.
13. Gao WY, Han FS, Storm C, Egan W, Cheng YC. Phosphorothioate oligonucleotides are inhibitors of human DNA polymerases and RNase H: implications for antisense technology. Mol Pharmacol 1992; 41: 223-29.
14. Hartman G, Krug A, Waller-Fontaine K, Endres S. Oligodeoxynucleotides enhance lipopolysaccharide stimulated synthesis of tumor necrosis factor: dependence on phosphorothioate modification and reversal by heparin. Mol Med 1996; 2: 429-38.
15. Tu GC, Cao GN, Zhou F, Israel Y. Tetranucleotide GGGA motif in primary RNA transcripts. Novel target site for antisense design. J Biol Chem 1998; 273: 25125-131.
16. Crooke ST. Vitravene – another piece in the mosaic. Antisense Nucleic Acid Drug Dev 1998; 8: vii-viii.
17. Agrawal, S, Zhao Q. Mixed Backbone Oligonucleotides: Improvement in Oligonucleotide-Induced Toxicity in vivo. Antisense & Nucleic Acid Drug Dev 1998; 8: 135-39.
18. Dean NM, Griffey RH. Identification and characterization of second-generation antisense oligonucleotides. Antisense Nucleic Acid Drug Der 1997; 7: 229-33.
19. Kuss B, Cotter F. Antisense: Time to shoot the messenger. Ann Oncol 1999; 10: 495-503.
20. Lasic DD, Templeton NS. Liposome in gene therapy. Adv Drug Delivery Rev 1996; 20: 221-28.
21. Finbarr E, Cotter MD. Antisence therapy for maligancy. American Society of Clinical Oncology 2000; 338-348.
22. Yang E, Korsmeyer SJ. Molecular thanathopsis: a discourse on the Bcl-2 Family and cell death. Blood 1996; 88: 384-401.
23. Reed JC. Bcl-2 and the regulation of programmed cell death. J Cell Biol 1994; 124: 1-26.
24. Kocki J, Różynkowa D. Gen Bcl-2 w patofizjologii limfocytów B. Post Biol Kom 1991; 18: 169-82.
25. Adams JA, Cory S. The Bcl protein family: arbiters of cellsurvival. Science 1998; 281: 1322-26.
26. Conus S, Kaufmann T, Fellaly I, Otter I, Rosse T, Borne C. Bcl-2 is a monomeric protein: prevention of homodimerization by structural constraints. The EMBO Journal 2000; 19: 1534-44.
27. Schendler SL, Xie Z, Montal MO, Matsuyama S, Montal M, Reed JC. Channel formation by antiaptotic protein Bcl-2. Proc Natl Acad Sci 1997; 94: 5113-18.
28. Gross A, Xiang J, Zha J, Yin XM, Schlesinger PHh, Korsmeyer SJ. Regulation of apoptosis by the Bcl-2 family mamebers. In: Oxidate stress and apoptosis. 3rd Winter Resarcher Conference, Les Arcs, Francja 1997.
29. Hu Y, Benedict MA, Wu D, Inohara N, Nunez G. Bcl-2 interacts with Apaf-1 and inhibits Apaf-1- dependent caspase 9 activation. Proc Natl Acad Sci 1998; 95: 4386-91.
30. Rao L, White E. Bcl-2 and the ICE family of apoptotic regulators: making a connection. Current Opinion in Genetics & Development 1997; &:, 52-58.
31. Ernshaw WC, Martins LM, Kaufmann SH. Mammalian caspases: structure, Activation, substrates and functions during apoptosis. Annu Rev Biochem 1999; 68: 383-424.
32. Pan G, Orouke K, Dixit VM. Caspase-9 BCL-xL and Apaf-1 from a tertiary complex. J Biol Chem 1998; 273: 5841-45.
33. Hockenbery DM, Oltavai ZN, Yin XM, Milliman Cl, Korsmeyer SJ. Bcl-2 functions in an antioxidant pathway to prevent apoptosis. Cell 1993; 75: 241-51.
34. Baker AM, Briehl MM, Dorr R, Powis G.Decreased antioxidant defence and increased oxidant stress during dexamenthasone-induced apoptosis: bcl-2 prevents the loss of antioxidant enzyme activity. Cell Death & Differ 1996; 3: 207-13.
35. Lam M, Dubayk G, Chen L, Nunez G, Miesfeld RL, Distelhorst CW. Evidence that Bcl-2 represses apoptosis by regulating endoplasmic reticulum-associated Ca2+ fluxes. Med Sci 1994; 92: 6569-73.
36. Kurschner C, Morgan JI. Analysis of interaciton sites in homo- and heteromeric complexes containing Bcl-2 family members and the cellular prion protein. Molecular Brain Resarch 1996; 37: 249-58.
37. Chiou SK, Rao L, White E. Bcl- blocks p-53 dependent apoptosis. Mol Cell Biol 1994; 14: 2556-63.
38. Taylor JK, Zhang QQ, Wyatt JR, Dean NM. Induction of endogenous Bcl-xS trough the control of Bcl-x pre-mRNA splicing by antisense oligonukleotides. Nature Biotechnology 1999; 17: 1097-1100.
39. Cowsert LM. In vitro and in vivo activity of antisense inhibitors of ras: Potential for clinical development. Anticancer Drug Res 1997; 12: 359-71.
40. Vaughan JP, Iglehart JD, Demirdji S, et al. Antisense DNA down-regulation of the ERBB2 oncogene measured by a flow cytometric assay. Proc Natl Acad Sci 1995; 92: 8338-42.
41. Citro G, Caputo R, Damiano V, et al. Inhibition of leukemia cell poliferation by folic acid-polylysine-mediated introduction of c-myb antisense oligodeoxy ucleotides into HL-60 cells. Br J Cancer 1994; 69: 463-67.
42. Tortora G, Caputo R, Damiano V, et al. Cooperative antitumor effect of mixed backbone oligonucleotides targeting protein kinase A in combination with cytotoxic drugs or biologic agents. Antisense Nucleic Acid Drug Dev 1998; 2: 141-45.
43. Crooke ST, Bennet CF. Progress in antisense oligonucleotide therapeutics. Annu Rev Pharmacol Toxicol 1996; 36: 107-29.
44. Crooke ST. Progress in antisense therapeutics. Med Res Rev 1996: 16: 319-44.
45. Hermine O, Haioun C, Lepage E, et al. Prognostic significance of bcl-2 protein expression in agressive non-Hodgkin’s lymphoma: Groupe d (Etude des Lymphomes de I’Adulte (GELA). Blood 1996; 87: 265-72.
46. Hill ME, MacLennan KA, Cunningham DC, et al. Prognostic significance of Bcl-2 expression and Bcl-2 major breakpoint region rearrangement in diffuse large cell non-Hodgkin lymphoma. A British National Lymphoma Investigation study. Blood 1996; 88: 1046-51.
47. Cotter FE, Corbo M, Raynauld F, et al. Bcl-2 antisensetheraphy in lymphoma: In vitro and in vivo mechanisms, efficacy, pharmacokinetics and toxity studies. Ann Oncol 1996; 9: 7, 32-36.
48. Zamecnik P. Background of the antisense oligonucleotide approach to chemotherapy. Antisense Nucleic Acid Drug Dev 1997; 7: 199-202.
49. Stein CA. Keeping the biotechnology of antisense in context. Nature Biotechnology 1999; 17: 209.
ADRES DO KORESPONDENCJI
dr n. med. Krystyna Stec-Michalska
Klinika Chorób Infekcyjnych i Gastroenterologii
Instytutu Medycyny Wewnętrznej
i Fizjoterapii
Wojskowej Akademii Medycznej
ul. Kniaziewicza 1/5
91-347 Łódź
