Study of the OPCML inactivation in epithelial ovarian cancer

Wstęp
Jednym z najczęściej występujących nowotworów u kobiet jest rak jajnika. Współczynnik umieralności z powodu tego nowotworu wykazuje stałą tendencję wzrostową. W pierwszych 44 latach życia ryzyko zachorowania na raka jajnika jest niskie i kształtuje się na poziomie 0,1–2 na 100 tys. kobiet w ciągu roku, zaś umieralność z jego powodu jest niska. W grupie kobiet w wieku 45–64 lat częstość występowania nowotworu jest wyższa, wzrasta także umieralność i wynosi 20,6 na 100 tys. kobiet na rok. Najwyższy współczynnik umieralności obserwuje się u kobiet w wieku powyżej 65 lat i wynosi 29,7 na 100 tys. kobiet [1, 2]. Uważa się, że część przypadków raka jajnika, zwłaszcza występujących rodzinnie w połączeniu z rakiem piersi, jest uwarunkowana genetycznie [3, 4].
Ostatnio wiele uwagi poświęca się czynnikom epigenetycznym mogącym wpływać na ekspresję genów, lecz niezwiązanych ze zmianami w sekwencji nukleotydów. Jednym z czynników epigenetycznych jest metylacja DNA, polegająca na enzymatycznym przyłączaniu reszt metylowych (-CH3) do wielokrotnych powtórzeń sekwencji CG w DNA, tzw. wysp CpG [5–7].
Procesy metylacji DNA są zjawiskiem fizjologicznym i rozpoczynają się, po zapłodnieniu komórki jajowej, od całkowitego zniesienia metylacji we wczesnych podziałach komórkowych [8]. Tkankowo specyficzne wzory metylacji stanowią element kontroli ekspresji genów w czasie rozwoju i życia organizmu. Silnie metylowane – nieaktywne obszary DNA ulegają późniejszej replikacji niż regiony aktywnej rozluźnionej chromatyny [8, 9].
Badania utraty heterozygotyczności przeprowadzone u chorych na raka jajnika wykazały, że w locus 11q25 może znajdować się gen supresora nowotworowego [10, 11]. W tym rejonie zidentyfikowano gen OPCML (opioid binding protein/cell adhesion molecule-like). Sugeruje się, że utrata heterozygotyczności w locus 11q25 może powodować obniżenie ekspresji OPCML i w konsekwencji prowadzić do rozwoju choroby nowotworowej [11]. Inną przyczyną zahamowania ekspresji OPCML może być metylacja wysp CpG znajdujących się w obszarze promotorowym tego genu. Utrata funkcji białka OPCML może być również spowodowana mutacją w pozycji 334 w 2 egzonie, w wyniku której następuje zamiana aminokwasów w sekwencji białka (P95R) [11].
Gen OPCML składa się z 7 egzonów, a jego całkowita długość wynosi 600 tys. par zasad. Gen ten koduje receptor dla alkaloidów i jest selektywny dla µ ligandów. Białko jest zakotwiczone w zewnętrznej błonie lipidowej komórek nabłonka. W jego budowie można wyróżnić charakterystyczną domenę glikozylofosfatydyloinozytolową wiążącą ligand [12, 13]. Białko OPCML posiada strukturalną homologię z immunoglobulinami z grupy IgLON związanymi z adhezją międzykomórkową [11–13].
Bioinformatyczna analiza sekwencji aminokwasowej wskazuje, że w białku OPCML brak jest transmembranowej domeny niezbędnej do transdukcji sygnału. Zatem prawdopodobne jest, że OPCML nie jest niezależnym receptorem opioidowym, lecz jest ważną częścią kompleksu białkowego. Zarówno budowa kompleksu receptorowego, jak i funkcja białka OPCML nie są jeszcze dokładnie poznane [11, 14].
Wysoka ekspresja OPCML jest charakterystyczna dla jajnika i mózgu. Dużo niższy poziom transkryptu tego genu wykazano także w innych narządach miękkich, m.in. w jądrach, wątrobie, nerkach czy sercu [11].


Cel pracy
Celem pracy było poszukiwanie zależności pomiędzy metylacją wysp CpG genu OPCML i/lub obecnością mutacji w tym genie a występowaniem nowotworu jajnika.

Materiał i metody
Do badania włączono 114 kobiet – pacjentek Centrum Onkologii w latach 2002–2005. Wśród nich znajdowało się 75 kobiet chorych na raka jajnika (adenocarcinoma serosum ovarii). Materiał mrożony i archiwizowany w parafinie pochodził od 55 chorych, a płyn wysiękowy z jamy otrzewnej od 20. Grupę kontrolną stanowiło 39 kobiet, u których stwierdzono łagodne zmiany w jajniku (cystadenoma serosum ovarii). Kobiety te zostały wcześniej poddane mastektomii z powodu raka piersi, a ze względów profilaktycznych usunięto im przydatki.
W przypadku 94 pacjentek materiał do badania został pobrany śródoperacyjnie i zabezpieczony w Zakładzie Patologii COI (bloczki parafinowe lub mrożenie). Badany materiał został poddany analizie histopatologicznej w Zakładzie Patologii COI.
Od 20 chorych do badania molekularnego wykorzystano komórki jądrzaste pochodzące z płynu wysiękowego z jamy otrzewnowej. Zabieg odbarczający wykonano w Klinice Nowotworów Narządów Płciowych Kobiecych w Centrum Onkologii w Warszawie.

Izolacja DNA
Genomowe DNA izolowano z użyciem zestawu Genomic Mini lub Sherlock AX (A&A Biotechnology) zgodnie z zaleceniami producenta zestawów.

Analiza metylacji genu OPCML
Genomowe DNA (1mg) poddano przez noc trawieniu enzymem Hind III w temp. 37˚C, a następnie oczyszczono zestawem Wizard DNA Clean-Up System (Promega). Strawiony DNA (ok. 40 µl) denaturowano przy użyciu 1 M NaOH w temp. 75˚C przez 15 min. Modyfikację przeprowadzono, dodając do mieszaniny odpowiednią ilość 3,9 M kwaśnego siarczynu sodowego (Sigma) i 10 mM hydrochinonu (Sigma). Całość inkubowano przez 4 godz. w 55˚C. Próbkę oczyszczano zestawem Wizard DNA Clean-Up System (Promega). Depurynację przeprowadzono, dodając 1 M NaOH i inkubując próbkę przez 15 min w 37˚C. DNA wytrącano przez noc, dodając 96% EtOH, 7,5 M CH₃COONH₄ (Sigma) oraz glikogen (3 µg/µl) (Sigma). Następnie próbkę wirowano przez 15 min przy prędkości 13 000 rpm. Uzyskany osad płukano w 75% EtOH i suszono w temperaturze pokojowej. Modyfikowane chemicznie DNA zawieszono w wodzie destylowanej.
MS-PCR (Methylation Specific PCR) jest odmianą techniki PCR służącą do ustalania różnic w metylacji badanej sekwencji DNA. Do oceny metylacji genu OPCML zastosowano specyficzne startery dla sekwencji metylowanej i niemetylowanej obejmujace 35 wysp CpG genu OPCML o długości 135 p.z. Mieszanina reakcyjna zawierała: 3,75 pM dNTPs, 15 pM starterów, 1U polimerazy FastStart (Roche), odpowiedni bufor reakcyjny oraz modyfikowane DNA. Reakcję przeprowadzono wg schematu: denaturacja wstępna 95oC 5 min; 35 cykli amplifikacji: 95˚C 30 s, 59–62˚C 30 s, 72˚C 30 s; elongacja końcowa 72˚C 7 min. Produkt reakcji rozdzielano w 2,5% żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny (0,2 µl/ml) (ryc. 1.).
Z powodu małej ilości DNA uzyskanej z materiału ze skrawków parafinowych przeprowadzono dodatkowy etap amplifikacji z użyciem starterów obejmujących większy fragment genu OPCML. Otrzymany produkt o wielkości 243 p.z. rozcieńczano w stosunku 1:25 i użyto w reakcji PCR opisanej powyżej. Sekwencje starterów dostępne są u autora pracy.

Poszukiwanie mutacji w genie OPCML
Do poszukiwania mutacji w egzonach genu OPCML zastosowano technikę SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism Electrophoresis). Dla każdego egzonu genu OPCML przeprowadzono osobną reakcję amplifikacji z zastosowaniem specyficznych starterów. Mieszanina reakcyjna zawierała: 3,75 pM dNTPs, 15 pM starterów, 1 U polimerazy FastStart (Roche), bufor 1 x stężony zawierający MgCl2 (Roche) oraz genomowe DNA. Reakcja była prowadzona wg następującego schematu: denaturacja wstępna 95˚C 5 min; 35 cykli amplifikacji: 95˚C 30 s, 56–64oC 30 s, 72˚C 30 s; elongacja końcowa 72˚C 7 min. Sekwencje starterów dostępne są u autora pracy.
Około 5 µl produktu PCR rozdzielano w 2,5% żelu agarozowym w celu stwierdzenia efektywności reakcji. Następnie do produktu PCR (4–7 ml) dodawano bufor denaturujący (99% formamid, 1 M NaOH), inkubowano 10 min w temp. 95˚C i przenoszono do lodu. Rozdział produktu prowadzono w 8% żelu akrylamidowym przy napięciu 70 V, przez 17 godz. w temp. 4˚C. Żel barwiono metodą srebrzenia i suszono. Na podstawie zmian w obrazie prążków na żelu wybrano próbki do sekwencjonowania.

Sekwencjonowanie
Próbki po reakcji PCR oczyszczano zestawem Clean-Up (A&A Biotechnology) zgodnie z protokołem załączonym przez producenta. Otrzymany produkt stanowił matrycę do reakcji sekwencjowania z użyciem zestawu BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) zgodnie z zaleceniem producenta. Produkt reakcji sekwencjonowano w Pracowni Sekwencjonowania COI.

Analiza statystyczna
Analizę statystyczną przeprowadzono z użyciem pakietu SISA z wykorzystaniem testu χ² (chi²).

Wyniki
Analiza metylacji genu OPCML w materiale pochodzącym od pacjentek chorych na raka jajnika oraz ze zmianami łagodnymi wykazała, że gen OPCML częściej ulega epigenetycznej inaktywacji u pacjentek chorych na raka (tab. I).
Metylację genu OPCML wykryto u 46 z 75 pacjentek (61%) chorych na raka jajnika oraz u 8 z 38 (12%) kobiet z grupy kontrolnej. Różnice w częstości występowania metylowanej kopii genu OPCML w obu grupach były statystycznie istotne (p=0,00001).
Dodatkowo przeprowadzono analizę metylacji genu OPCML w zależności od sposobu pozyskania materiału do badania. W grupie 20 kobiet, od których materiał uzyskano z płynu wysiękowego, metylację genu OPCML stwierdzono w 100% przypadków (w porównaniu z grupą kontrolną p<0,00001). W przypadku materiału pobranego śródoperacyjnie u 26 z 55 kobiet (48%) wykazano obecność metylowanej kopii genu OPCML (w odniesieniu do grupy kontrolnej p=0,0095).
Ze względu na sposób pobierania materiału możliwe jest, że materiał zawierał heterogenną populację komórek, na których wykonano badanie. W badanym materiale pochodzącym od pacjentek z grupy kontrolnej oraz z rakiem jajnika stwierdzono, że wyłącznie niemetylowana lub metylowana kopia genu występowała u odpowiednio 9 i 60 kobiet, co stanowi 8 i 53% badanych. W pozostałej grupie stwierdzono obecność zarówno metylowanej, jak i niemetylowanej kopii genu OPCML (tab. I.).
Poszukiwanie możliwych mutacji w genie OPCML przeprowadzono za pomocą metody przesiewowej SSCP. Na podstawie zmienionego obrazu migracji prążków w żelu poliakrylamidowym do sekwencjonowania wytypowano 4 próbki. Jednakże dla żadnej z nich nie potwierdzono obecności zmiany w sekwencji nukleotydowej.


Dyskusja
Gen OPCML jest opisywany jako potencjalny supresor nowotworowy odgrywający dużą rolę w rozwoju raka jajnika [11]. Przeprowadzona przez nas analiza metylacji OPCML wykazała, że w materiale pochodzącym od pacjentek z rakiem jajnika znacznie częściej obserwuje się ten sposób inaktywacji genu niż w materiale kontrolnym. Stwierdziliśmy, że metylacja OPCML występuje u 61% pacjentek chorych na raka jajnika, z czego u 48% kobiet, od których materiał do badania pobrano śródoperacyjnie. Wynik ten stanowi wartość pośrednią pomiędzy rezultatami otrzymanymi przez inne grupy badawcze. Wykazały one metylację genu OPCML u 87 i 33% pacjentek [11, 15].
Metylację genu OPCML stwierdziliśmy w 100% próbek z materiału pochodzącego z płynu wysiękowego. Obecność płynu wysiękowego w jamie otrzewnowej po operacji i kursach chemioterapii jest źle rokującym prognostykiem. U wszystkich chorych, od których pobrano płyn odbarczający, zaobserwowano progresję choroby. Odnalezienie komórek nowotworowych w wysięku może wskazywać na związek metylacji OPCML z osłabieniem właściwości adhezyjnych komórek nowotworowych.
W badanej populacji nie wykryto mutacji w genie OPCML. Znajduje to potwierdzenie w badaniach przeprowadzonych przez G. Sellara i wsp. [11], którzy badając materiał pochodzący z 212 pierwotnych raków jajnika, odnaleźli mutację zaledwie w jednej próbce. Konsekwencją tej mutacji była zmiana aminokwasowa P95R, która powoduje zaburzenia funkcji białka OPCML [11]. Sugeruje się, że inaktywacja w wyniku mutacji występuje znacznie rzadziej niż obniżenie ekspresji tego genu na skutek metylacji wysp CpG. Ponadto ostatnio publikowane badania dotyczące ekspresji OPCML potwierdzają, że epignetyczna inaktywacja jest głównym mechanizmem ograniczania ekspresji tego genu [16].
Zahamowanie ekspresji genów w trakcie rozwoju raka jajnika nie dotyczy wyłącznie OPCML. Zaobserwowano, że metylacji mogą ulegać także inne geny, m.in. PTEN, P16, CASP8, DCR1, RASSF1A, TMS1, BRCA1, MGMT, MLH1. Obniżenie ekspresji tych genów wskutek metylacji prowadzi do zaburzenia kluczowych funkcji komórkowych, np. proliferacji, cyklu komórkowego, procesów reperacji DNA i apoptozy [15].
Somatyczna metylacja wysp CpG jest dobrze poznaną przyczyną inaktywacji genów hamujących powstawanie nowotworu [5, 6]. Metylacja wysp CpG genu OPCML powoduje obniżenie ekspresji genu, co w konsekwencji prowadzi do zmniejszenia poziomu białka – receptora i jednocześnie jego aktywności jako czynnika supresorowego [7, 11]. Sugeruje się, że przyczyną metylacji w obrębie wysp CpG w obszarze promotorowym genu OPCML jest wzrost aktywności onkogenicznego genu RAS, który aktywuje metylotransferazy (w wyniku czego wzrasta metylacja genów, w tym również genów supresorowych) [17]. Mechanizmy kontrolujące metylację i demetylację DNA nie są jeszcze do końca poznane.
Obniżenie ekspresji związane z metylacją wykazano również dla innych przedstawicieli rodziny IgLON – NEGR1 i LSAMP – mogących również pełnić funkcję genów supresorowych w raku jajnika [16]. Dokładne poznanie mechanizmu regulującego ekspresję oraz działanie OPCML jest niezwykle ważnym celem, którego osiągnięcie przyczyni się do lepszego zrozumienia procesu nowotworzenia.

Wniosek
Z powyższych badań można wnioskować, że epigenetyczna inaktywacja genu OPCML poprzez metylację wysp CpG może pełnić istotną rolę w rozwoju raka jajnika.

Badania finansowane z grantu KBN nr 2 PO5E 032 28 (0708).


Piśmiennictwo
1. Zatoński WA, Tyczyński JE. Epidemiologia nowotworów złośliwych w Polsce w piętnastoleciu 1980–1994. Centrum Onkologii – Instytut im. Marii Skłodowskiej Curie, Warszawa 1997.
2. Tyczyński JE i wsp. Atlas umieralności na nowotwory złośliwe w Polsce w latach 1991–1995. Centrum Onkologii – Instytut im. Marii Skłodowskiej Curie, Warszawa 1998.
3. Basham VM, Lipscombe JM, Ward JM, at al. BRCA1 and BRCA2 mutations in a population-based study of male breast cancer. Breast Cancer Res. 2002; 4: R2.
4. Ottini L, D’Amico C, Noviello C, at al. BRCA1 and BRCA2 mutations in central and southern Italian patients. Breast Cancer Res 2000; 2: 307-10.
5. Esteller M, Corn PG, Baylin SB, at al. A gene hypermethylation profile of human cancer. Cancer Res 2001; 61: 3225-9.
6. Esteller M. CpG island hypermethylation and tumor suppressor genes: a booming present, a brighter future. Oncogene 2002; 21: 5427-40.
7. Rountree MR, Bachman KE, Herman JG, at al. DNA methylation, chromatin inheritance, and cancer. Oncogene 2001; 20: 3156-65.
8. Szpecht-Potocka A. Rodzicielskie piętno genomowe w zespole Pradera-Williego. Postępy Biochemii 2001; 1: 87-97.
9. Robertson KD. DNA methylation and chromatin. Oncogene 2002; 21: 5361-79.
10. Launonen V, Stenback F, Puistola U, et al. Chromosome 11q22.3-q25 LOH in ovarian cancer: association with a more aggressive disease course and involved subregions. Gynecol Oncol 1998; 71: 299-304.
11. Sellar GC, Watt KP, Rabiasz GJ, et al. OPCML at 11q25 is epigenetically inactivated and has tumor-suppressor function in epithelial ovarian cancer. Nat Genet 2003; 34: 337-43.
12. Funatsu N, Miyata S, Kumanogoh H, at al. Characterization of a novel rat brain glycosylphosphatidylinositol-anchored protein (Kilon), a member of the IgLON cell adhesion molecule family. J Biol Chem 1999; 274: 8224-30.
13. Harpaz Y, Chothia C. Many of the immunoglobulin superfamily domains in cell adhesion molecules and surface receptors belong to a new structural set which is close to that containing variable domains. J Mol Biol 1994; 238: 528-39.
14. Shark KB, Lee NM. Cloning, sequencing and localization to chromosome 11 of a cDNA encoding a human opioid-binding cell adhesion molecule (OBCAM). Gene 1995; 155: 213-7.
15. Teodoridis JM, Hall J, Marsh S, et al. CpG island methylation of DNA damage response genes in advanced ovarian. Cancer Res 2005; 65: 8961-7.
16. Mei FC, Young TW, Liu J, et al. RAS-mediated epigenetic inactivation of OPCML in oncogenic transformation of human ovarian surface epithelial cells. FASEB J 2006; 20: 497-9.
17. Ntougkos E, Rush R, Scott D, et al. The IgLON family in epithelial ovarian cancer: expression profiles and clinicopathologic correlates. Clin Cancer Res 2005; 11: 5764-8.