Techniki edycji genomu jako narzędzie modyfikacji komórek układu odpornościowego

Techniki edycji genomu i zakres ich zastosowania

Edycja genomu polega na wprowadzeniu zmian w DNA komórek poprzez zmiany sekwencji w obrębie istniejących genów. Zmiany wprowadzane w celach terapeutycznych mają doprowadzić do usunięcia genetycznej przyczyny choroby. Możliwa jest również edycja genomu w celu zastosowania w terapii udoskonalonych dzięki niej komórek, takich jak CAR-T. Techniki edycji genomu pozwalają edytować fragmenty DNA, dzięki specjalnym białkom, molekułom sgRNA (single guide RNA), a niekiedy również donorowym DNA [1]. Technologie edycji genomu rozwijają się bardzo szybko. Zanim skończyły się badania kliniczne z zastosowaniem metody TALEN (transcription activator-like effector nucleases) i ZFN (Zinc-finger nucleases), pojawiła się metoda CRISPR-CAS9 (Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats, CAS9 CRISPR associated protein) [2]. W ostatnich latach zaprezentowano również prime editing „edycja prime” (PE) i kilka innych metod edycji genomu [3]. Wspólnym mianownikiem tych technik jest wykorzystanie molekuł umożliwiających rozpoznanie konkretnego fragmentu genomu oraz wykorzystanie systemu naprawy uszkodzeń DNA po to, by wprowadzić zamierzoną zmianę w sekwencji DNA określonych komórek. W przypadku metod TALEN i ZFN za rozpoznanie odpowiedniego fragmentu DNA odpowiadają białka, przy czym w metodzie TALEN rozpoznanie jest wrażliwe na wyspy CpG [4]. W przypadku CRISPR-CAS9 za rozpoznanie konkretnego fragmentu DNA odpowiada RNA, a dokładnie molekuła określona jako sgRNA (single guide RNA). W uproszczeniu rola sgRNA jest podobna do tej, jaką odgrywa starter w trakcie reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Oczywiście starter PCR to DNA, które nie ma takiego wspomagania w trakcie PCR, jakie zapewnia molekule sgRNA białko CAS9 w komórce. Również w przypadku techniki PE (prime editing) to RNA odpowiada za rozpoznanie miejsca, które ma ulec edycji. To właśnie zamiana białek na RNA jako molekuł umożliwiających rozpoznanie fragmentu DNA o odpowiedniej sekwencji zwiększyła skuteczność systemu edycji. Nie chodzi jednak tylko o specyficzność, czyli zmniejszenie liczby tzw. miejsc off target (miejsc w genomie innych niż zaplanowane do edycji). Metoda TALEN wykazuje specyficzność zbliżoną do CRISPR-CAS9, ale to CRISPR-CAS9 ma np. większą wydajność, umożliwia skrócenie czasu wymaganego na edycję lub też możliwość działania jednocześnie w kilku pozycjach w genomie. Mimo to technika TALEN pozostanie zapewne w użyciu. Nie ma tu jednak miejsca na omawianie wszystkich technik edycji genomu, nawet na tak podstawowym poziomie, jak omówiono w tym opracowaniu CRISPR-CAS9 czy PE. Wydaje się, że technika TALEN pozostanie w użyciu w konkretnych sytuacjach. Jest ona niezależna od obecności tzw. sekwencji PAM, a jej wrażliwość na tzw. wyspy CpG w DNA może być w niektórych sytuacjach traktowana jako zaleta. Więcej informacji o korzyściach ze stosowania techniki edycji TALEN można znaleźć w publikacji Bhardwaja i Naina [5].
Metody edycji genomu są ważną częścią biologii syntetycznej – dziedziny, w której rozważa się tworzenie komórek nawet bardziej zmodyfikowanych niż CAR-T. Mogą to być komórki o zupełnie nowych funkcjach, a komórki układu odpornościowego wydają się pierwszorzędnym podmiotem w przypadku takich działań. Syntetyczna biologia jest niekiedy trudna do odróżnienia od biotechnologii. Dziedzina ta traktuje komórkę oraz jej elementy, np. białka, w sposób podobny do tego, którego używa się przy opracowywaniu układów scalonych w elektronice. PE polega na działaniu dwóch chimer, każdej złożonej z trzech podjednostek. Trzy elementy białkowe tworzą jedną chimerę (nikaza, odwrotna transkryptaza, CAS9), a kolejne trzy elementy RNA tworzą drugą chimerę (crRNA, tracerRNA i RNA odgrywającego rolę DNA donorowego). W niektórych sytuacjach, takich jak tworzenie uniwersalnych CAR-T, potrzebne jest połączenie technologii indukowanych komórek pluripotencjalnych (iPSc) z edycją genomu. To pokazuje, jak bardzo rozbudowane stają się systemy do zastosowania w terapii, co wymusza pewną standaryzację i unifikację, która będzie bardzo trudna bez dziedziny, która to uporządkuje. Rolę takiej dziedziny może odegrać właśnie biologia syntetyczna [6]. Niestety metody edycji genomu prowadzą do powstania nie tylko komórek ze zmianami planowanymi, lecz także komórek z nieplanowanymi zmianami genomu (off target). Pojawianie się takich błędów w trakcie stosowania metod edycji genomu powoduje, że konieczne jest selekcjonowanie otrzymanych komórek – oddzielenie tych o cechach pożądanych od tych z błędami. Jest to możliwe w przypadku komórek, takich jak hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) czy iPSc. Konieczność przeprowadzenia takiej selekcji jest jedną z przyczyn zakazu edycji genomu ludzkich komórek totipotentncjalnych w celach terapeutycznych i dla badań stosowanych (nie w badaniach podstawowych) [7]. Nawet jeśli powyższy zakaz zostałby zniesiony, to nadal konieczne będzie stosowanie pochodnych iPSc lub limfocytów z edytowanym genomem w terapii osób urodzonych z dziedzicznymi chorobami genetycznymi lub osób z chorobami nowotworowymi. Idealnym przykładem są tu hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC), których zastosowanie, w przeciwieństwie do iPSc, nie niesie ryzyka powstania potworniaków. Jednak HSC trudniej hodować w warunkach in vitro. Metody ich hodowli są wciąż udoskonalane. Dodatkowo jeśli nawet dojdzie do selekcji komórek z niektórymi błędami powstałymi w trakcie edycji genomów komórek multipotencjalnych czy komórek dojrzałych, to wprowadzenie do organizmu subpopulacji takich komórek nie spowoduje tak negatywnych konsekwencji jak rozwój całego organizmu i być może jego potomstwa, których większość lub wszystkie komórki będzie miała błędy genetyczne. Wychwycenie wszystkich błędów jest w zasadzie niemożliwe. Wymaga zastosowania sekwencjonowania nowej generacji (NGS) całego genomu kolonii komórkowych po klonowaniu, aby wykryć komórki ze zmianami typu off target (miejsc nieplanowanych). Naturalnie zawsze trzeba brać pod uwagę ryzyko pojawiania się niezamierzonej edycji supresorów nowotworowych i onkogenów w przypadku edycji komórek pluri- czy multipotencjalnych [8]. Metody edycji genomu są ciągle poprawiane i pojawiają się ich kolejne odmiany, ale selekcja w inżynierii komórkowej jest zawsze obecna, chociażby po to, by oddzielić komórki, które przyjęły transgen(y), od tych, które tego nie zrobiły.

Metoda CRISPR-CAS9

Metoda CRISPR-CAS9 wywodzi się z bakteryjnego systemu służącemu eliminacji bakteriofagów [9]. Nadal najpopularniejszym enzymem jest CAS9, ale coraz częściej stosuje się inne enzymy z rodziny CAS [10]. Mimo to w artykule przyjęto dość tradycyjną konwencję nazywania tej techniki CRISPR-CAS9. Za odkrycie CRISPR-CAS9 i pokazanie, jak wykorzystać w edycji genomu eukariotycznego, przyznano w 2020 roku Nagrodę Nobla. Bakterie mogą integrować do swojego genomu fragmenty DNA bakteriofagów i wykorzystywać je, po przepisaniu na RNA, do rozpoznawania i degradacji DNA bakteriofaga, który zainfekował bakterię ponownie. W trawieniu DNA faga, poza crRNA i tracer RNA, uczestniczą enzymy CAS, najczęściej CAS9, kiedy jest to ponowna infekcja, a CAS1 i CAS2 w trakcie pierwszej infekcji. Odróżnienie własnego DNA bakteryjnego zawierającego fragmenty tożsame sekwencyjnie z genomem fagów, które zainfekowały komórkę bakteryjną ponownie, odbywa się dzięki sekwencji PAM (protospacer adjacent motif) – krótkiej 2–6-nukleotydowej sekwencji DNA [11]. PAM występuje w DNA faga, ale nie w DNA bakteryjnym. Sekwencja PAM przyspiesza proces poszukiwania DNA faga. Dopiero gdy CAS9 rozpozna PAM, sprawdza, czy crRNA pasuje do DNA faga. Nie tylko sekwencji PAM nie ma w obrębie sekwencji CRISPR w genomie bakteryjnym, ale za każdym fragmentem DNA z innego faga w obrębie genomu bakterii występuje sekwencja odmienna od PAM (najczęściej GTT; można ją określić jako anty-PAM). Zabezpieczenie to (wykorzystanie PAM i anty-PAM) jest konieczne z punktu widzenia skuteczności i specyficzności działania układu odpornościowego bakterii. Można to nazwać ochroną przed autoagresją systemu CRISPR. W przypadku stosowania niektórych typów edycji taki mechanizm może być kłopotliwy (opisano szczegółowo w ostatnim rozdziale artykułu).
W przypadku edycji genomów komórek eukariotycznych zastosowane wzmiankowane powyżej sgRNA jest połączeniem mechanicznym (chimera molekuł) i funkcjonalnym crRNA i tracer RNA, wykorzystywanych do trawienia DNA faga. Dodatkowo w komórkach bakteryjnych systemy naprawy uszkodzeń DNA nie są tak rozwinięte jak w przypadku komórek eukariotycznych. Wprowadzenie do komórek eukariotycznych za pomocą np. wektora lentiwirusowego transgenu kodującego CAS9 razem z sgRNA prowadzi do przecięcia obu nici DNA w miejscu rozpoznanym przez sgRNA, a także jednocześnie – do uruchomienia systemu naprawy DNA z wykorzystaniem białek komórki gospodarza (host cell). Po dokonaniu dwuniciowego przecięcia DNA pojawiają się dwie możliwości naprawy: NHEJ (non-homologous end joining) i HDR (homologous directed repair) [12, 13]. W pierwszym przypadku dochodzi do dodania lub usunięcia kilku nukleotydów w miejscu przecięcia i następnie do zespolenia dwuniciowego DNA. W drugim przypadku system naprawy próbuje przywrócić dokładnie sekwencję sprzed uszkodzenia, jeśli nie ma ingerencji biotechnologicznej lub na drugim allelu nie występuje różnica w stosunku do sekwencji przeciętego fragmentu. Zdarza się również, że system HDR wprowadza przesunięcie ramki odczytu. Jest to uznawane za błąd w działaniu tego systemu, a wynika z bardzo skomplikowanej operacji, którą musi on przeprowadzić. System naprawy HDR wykorzystuje w tym celu DNA homologiczne (np. z drugiego chromosomu/allela/kopii genu) lub DNA donorowe [14]. Jeśli razem z transgenem dla CAS9 i sgRNA nie zostanie wprowadzony żaden DNA donorowy, to najczęściej zadziała system NHEJ, rzadziej HDR, wykorzystując DNA homologiczne z drugiego allela. Kiedy sgRNA rozpozna część genu, która ma być edytowana, i w trakcie naprawy NHEJ dojdzie do dodania lub usunięcia kilku nukleotydów, to zazwyczaj prowadzi to do przesunięcia ramki odczytu, a mRNA powstający z tak edytowanego genu nie będzie ulegał translacji dzięki włączeniu się systemu nonsense mRNA decay. Na marginesie warto uściślić, że w przypadku edycji genomu unika się określeń typu „edycja lub metoda CRISPR prowadzi do mutacji”, ponieważ mutacje ze swej natury są przypadkowe, a edycja indukowana celowo i precyzyjnie w zamyśle. Historycznie próbowano używać w stosunku do edycji genomu oksymoronu ukierunkowana mutageneza. Niemniej system NHEJ wprowadza w sekwencji zmiany, które nie mogą być przewidziane w każdym szczególe (insercje lub delecje, tzw. INDELs). Jeśli jednak rozważa się zmiany w miejscach, które nie miały zostać zmieniane, czyli tzw. off target, wtedy używa się częściej terminu mutacja. W omawianym scenariuszu (po uruchomieniu NHEJ) można mówić o tzw. knock out genu – wyłączeniu go z działania. Jeśli wprowadza się razem z transgenem CAS9 zarówno sgRNA, jak i tzw. DNA donorowe, to może się zdarzyć, że system HDR rozpozna DNA donorowe jako homologiczne (zamiast homologicznego z drugiego allela) i wykorzysta je do naprawy uszkodzonego DNA. W tym przypadku pojawia się możliwość zamiany w pewnym zakresie sekwencji, która występowała w komórce eukariotycznej przed użyciem CRISPR-CAS9 na nową sekwencję, ale umożliwiającą powstanie prawidłowego białka. Określa się to niekiedy mianem knock in, nawet jeśli nie polega na insercji, ale substytucji nukleotydu. Może to być zamiana fragmentu DNA z mutacją odpowiedzialną za chorobę na fragment prawidłowy. Od razu trzeba zaznaczyć, że ta zamiana nie zawsze dojdzie do skutku, pomimo wprowadzenia DNA donorowego. Czasem DNA donorowe jest „ignorowane” i nie włącza się system HDR, ale ciągle NHEJ i to ten system wprowadza kolejną zmianę genu, który pierwotnie wykazywał mutację odpowiedzialną za występowanie choroby, np. była to zmiana sensu (missense), a po edycji pojawi się zmiana typu nonsens [15]. Jeśli mutacja leżąca u podstawy choroby jest heterozygotyczna (mutacja jednego allela) i polega na zamianie jednego nukleotydu w inny, to zdarza się, że sgRNA rozpoznające fragment DNA z sekwencją zmutowaną rozpoznaje niekiedy również DNA prawidłowe i prowadzi do rozpoczęcia jego edycji, która nie zawsze zakończy się przywróceniem pierwotnej prawidłowej sekwencji w tym allelu, ale dokonaniem zmiany na nieprawidłową albo nawet typu nonsens [16]. Warto w tym miejscu przypomnieć analogię między sgRNA a starterem (DNA) w PCR. Biotechnolodzy powoli eliminują te mankamenty techniki, ale daleko jeszcze do uniknięcia konieczności selekcji otrzymanych po edycji komórek. Można użyć przenośni, że komórka, w której zachodzi taka edycja, zamiast planowanej dzięki HDR i donorowemu DNA poprawy, wpada niejako z deszczu pod rynnę, po włączeniu się NHEJ. Tego typu wady metody CRISPR prowadzą do tego, że systemy edycji powodują dużo niezamierzonych zmian, pomimo wprowadzenia donorowego DNA [17–19]. Technika TALEN również korzysta z HDR oraz NHEJ i jest w związku z tym obciążona podobnymi mankamentami (ryc. 1).
Techniki edycji genomu, takie jak CRISPR-CAS9, mogą być też wykorzystywane do wycinania dużych fragmentów DNA, ale w tym przypadku konieczne jest zastosowanie dwóch sgRNA flankujących fragment, który ma zostać wycięty [20]. Możliwość edycji więcej niż jednego miejsca w genomie stanowi pewną przewagę w stosunku do metody TALEN, gdzie edycja jednocześnie kilku punktów jest trudniejsza. Może to być pomocne w trakcie usuwania większych fragmentów genów lub genów kodujących miRNA, ponieważ nie ma w tym przypadku możliwości przesunięcia ramki odczytu po włączeniu się NHEJ, jak ma to miejsce w genach kodujących białka. Również w tej sytuacji może dochodzić do wystąpienia zmian innych niż zaplanowane. Najprostszą przyczyną pojawienia się nieplanowanych zmian w tej sytuacji jest przyłączenie się tylko jednego z dwóch wprowadzonych sgRNA. Metoda edycji CRISPR-Cas9 stanowi w niektórych aspektach postęp w stosunku do metod TALEN. Jej odkrycie stanowiło bez wątpienia przełom. Wymaga ona jednak ciągłych udoskonaleń albo zastąpienia nowszą techniką. Może się nią okazać prime editing (PE) albo raczej jej odmiana. Porównanie metod edycji genomu przedstawiono w tabeli 1. W tabeli porównano trzy główne techniki edycji genomu, niemniej opracowano ich więcej i występują już odmiany głównych technik. Technika TALEN jest bez wątpienia doskonalsza niż ZFN. W przypadku PE istnieją już wersje PE2, PE3 i PE4. W metodzie CRISPR wykorzystuje się niekiedy inne enzymy niż CAS-9.

Metoda prime editing

Prime editing (PE) wykorzystuje: mRNA (tutaj peg­RNA), CAS9, nikazę i odwrotną transkryptazę, a w zasadzie domeny tych trzech enzymów połączonych w jedno wielofunkcyjne białko chimerowe [21]. Wprowadza się więc transgen kodujący takie wielofunkcyjne białko oraz mRNA, najczęściej za pomocą lentiwirusów. Wykorzystywane tu mRNA składa się z dwóch części. Jedna z nich działa podobnie jak sgRNA w systemie CRISPR-CAS9 i rozpoznaje konkretne miejsce w genomie. Druga część RNA odgrywa rolę analogiczną do DNA donorowego w metodzie CRISPR-CAS9 (tu używa się skrótu pegRNA). CAS wraz z pegRNA naprowadza białko chimerowe na wybrane miejsce w genomie. Domena nikazy przecina jedną nić DNA. Odwrotna transkryptaza przepisuje dostarczone RNA na cDNA i w ścisłym sąsiedztwie działania nikazy powstaje odpowiednik DNA donorowego z metody CRISPR-CAS9. Po przecięciu DNA włącza się system jego naprawy (ryc. 2). Różnica między przecięciem jednoniciowym (single strand break – SSB) a dwuniciowym DNA (double strand break – DSB) jest bardzo istotna [22]. Po przecięciu jednej nici nie można dokonać kolejnej zmiany typu nonsens w związku z działaniem systemu NHEJ, jeśli taka zmiana nie jest oczekiwana. Obecnie trwają prace nad wyjaśnieniem, jakie dokładnie systemy naprawy DNA włączają się po zastosowaniu metody PE. Do niedawna wydawało się, że to naprawa błędnie sparowanych zasad (mismatch repair – MMR) w prosty sposób odgrywa kluczową rolę. Obecnie wydaje się jednak, że wymaga to bardziej pogłębionej analizy [23]. Aktualnie wprowadzane są kolejne metody, z różnymi – mniej lub bardziej subtelnymi – udoskonaleniami, opisywane jako PE3, PE4, itd. Warto także zauważyć, że opracowanie technik edycji genomu przyczyniło się do rozwoju badań nad systemami naprawy uszkodzeń DNA, a ośrodki zajmujące się tymi systemami opracowują składowe nowych metod edycji genomu.
W typowym działaniu PE istnieje 50% szans, że system naprawy DNA wykorzysta cDNA powstały dzięki działaniu odwrotnej transkryptazy, zawierający sekwencję prowadzącą do zaplanowanej przez badacza zmiany typu missense czy nonsens, a także 50% szans, że system naprawy wykorzysta DNA jednoniciowe komórki gospodarza, które nie zostało przecięte nikazą. W ten sposób można sprawniej niż za pomocą CRISPR edytować genom, dokonując zmiany typu missense. System ten jednak również zależy od sekwencji PAM [24]. Jak wynika z powyższych opisów, obecnie stosowane metody edycji genomu o wiele trudniej zastosować, jeśli mutacja odpowiedzialna za chorobę polega na rozległej delecji. Przyjmuje się, że maksymalna wielkość możliwej insercji, jaką można wykonać, stosując obecne metody edycji genomu, to około 100 pz [25]. Metod edycji genomu przybywa, ale jak do tej pory, kiedy opierają się one na RNA, w zasadzie niemożliwe jest uniknięcie obecności sekwencji PAM, co zawsze zwiększa prawdopodobieństwo błędów w czasie edycji typu zmiany sensu (missense). Zastosowanie technologii ZFN, pomimo niezależności od PAM, prowadziło do większej liczby błędów niż CRISPR-CAS9 czy PE. Jeśli połączyć PE z technologią reprogramowania (iPSc), to około 50-procentowa poprawność zmian będzie w zupełności wystarczająca [26]. Można bowiem wyselekcjonować odpowiednio edytowane komórki iPSc. Jeśli PE miałoby być wykorzystane w celach terapeutycznych na poziomie komórek totipotencjalnych człowieka ex vivo (prawo na to nie zezwala w celach terapeutycznych), to 50% zmian zaplanowanych byłoby nadal dużym problemem, bo wymuszałoby odrzucanie 50% zarodków. Niemniej jest to oczywiście progres w stosunku do CRISPR--CAS9 z donorowym DNA, gdzie nadal za część napraw DNA odpowiada NHEJ, pomimo wprowadzenia donorowego DNA. Nawet najdoskonalsze obecnie metody edycji genomu nie wykluczą najbardziej podstawowego typu selekcji, czyli selekcji antybiotykowej, prowadzonej po to, by oddzielić komórki, które uległy transdukcji lub infekcji, od tych, które jej nie uległy. We wszystkich tych systemach korzysta się z wektorów wirusowych. Edycja in vivo natrafia na podobne problemy, jakie napotykała terapia genowa in vivo. Obecnie metod edycji jest więcej. Istnieją nawet próby połączenia np. TALEN z technologią CRISPR-CAS9 czy PE. Podsumowując – techniki edycji genomu nie są doskonałe, a ich stosowanie prowadzi do otrzymania heterogennej populacji edytowanych komórek (mozaikowatość). Spośród tej populacji konieczne jest wyselekcjonowanie komórek o zaprojektowanym w badaniach genomie. Selekcja taka jest akceptowalna w przypadku komórek iPS i multipotencjalnych.

Sekwencja PAM i jej znaczenie

Wymienione powyżej zostały najważniejsze przyczyny błędów w trakcie stosowania technik edycji genomu. Warto ponadto zwrócić uwagę, że obok sekwencji specyficznej dla sgRNA czy pegRNA we fragmencie bliskim edytowanego odcinka DNA musi występować sekwencja PAM, aby CAS9 mógł zadziałać [11]. Utrudnia to dodatkowo edycje polegające na zmianie dowolnej sekwencji zmutowanej na prawidłową, ponieważ nie zawsze sekwencja PAM występuje w sąsiedztwie miejsca, które ma ulec edycji typu zmiany sensu (missense). Jak wskazano powyżej, obecność sekwencji PAM ma fundamentalne znaczenie dla uniknięcia autotrawienia DNA bakteryjnego zamiast DNA faga, co powoduje, że pozbycie się jej jest bardzo trudne w systemach edycji opartych na CAS [27]. Na szczęście jest wiele sekwencji PAM i podejmuje się również działania zmierzające do stosowania rekombinowanych enzymów CAS, odpowiednio modyfikowanych konformacyjnie tak, aby odpowiednia dla nich sekwencja PAM występowała w sąsiedztwie miejsca edytowanego. W tym przypadku to biotechnolodzy decydują o tym, co jest sekwencją PAM, ale nie potrafią jej wyeliminować, nie pozbawiając jednocześnie CAS9 możliwości efektywnego działania. Wysiłki w tym kierunku jednak nie ustają [28, 29]. Jak wskazano wcześniej, fragment z sekwencją PAM rozpoznawany jest przez CAS9, zanim zacznie on dopasowywanie crRNA i tracerRNA przed trawieniem DNA faga, a sgRNA przed edycją genomu [30]. Generalnie wprowadzenie zmian typu knock out jest łatwiejsze niż knock in. W pierwszym przypadku wystarczy znaleźć sekwencję PAM w dowolnym fragmencie genu bliskim kodonu START edytowanego genu. Im bliżej kodonu START zostanie wprowadzona zmiana, tym łatwiej uruchomić rozkład nonsensownego mRNA (nonsense mRNA decay), ponieważ system ten opiera się na rozpoznawaniu tego, że kodon STOP jest zbyt odległy od ogona poliA mRNA [31]. PAM rzutuje bardziej na specyficzność w przypadku prób dokonania zmian sensu (missense). Obojętnie jednak, czy zmiana ma być missense czy nonsens, to może jej ulegać kilka genów, a nie tylko gen wybrany w celu terapii [8]. Prowadzi to, poza heterozygotycznym knock out niezamierzonych genów, do pojawienia się złożonych zaburzeń translacji białek [32]. Zamierzone stosowanie systemu NHEJ (brak DNA donorowego w wektorze) ma po pierwsze znaczenie naukowe do badania konsekwencji knock out różnych genów. Jest również istotne podczas modyfikacji komórek CAR-T. Ponadto proponuje się niekiedy wykorzystanie metod edycji genomu w chorobach genetycznych warunkowanych mutacjami dominującymi, kiedy heterozygotyczna mutacja powoduje nabycie nowej funkcji (gain of function – GOF). Propozycja sprowadza się w tym przypadku do usunięcia funkcjonalnego allela, ale tego z mutacją typu GOF. Trzeba jednak mieć na uwadze, że w takich przypadkach może dojść do knock out nie tylko allela zmutowanego, lecz także prawidłowego, a niekiedy w części komórek tylko prawidłowego, co znowu wymusza trudną selekcję odpowiedniej subpopulacji. Widać więc, że PE chociaż jest techniką bardzo zaawansowaną, to może być stosowana tylko pod odpowiednią kontrolą i nadal wymusza selekcję komórek po edycji.

Podsumowanie

Metody edycji genomu są szczególnie ważne w przypadku komórek układu odpornościowego i hematopoetycznych komórek macierzystych. Pomimo starań biotechnologów metody te są nadal niedoskonałe. Największe znaczenie dla terapii ma edycja służąca nie tyle eliminacji funkcjonalnej genów, co prowadząca do zmiany fragmentu DNA z sekwencją zmutowaną na fragment z sekwencją prawidłową. Skutkuje to niestety w przypadku CRISPR-CAS9 wprowadzeniem wielu zmian innych niż planowane, w tym nawet zmiany nonsensownej zamiast zmian terapeutycznych. Niemniej biotechnolodzy nie ustają w wysiłkach, aby poprawiać te metody. Już obecnie dzięki zastosowaniu edycji genomu i następczej selekcji edytowanych komórek (oddzieleniu tych z zamierzonymi zmianami DNA od tych z błędami) możliwe jest ich zastosowanie w terapii.

Podziękowania

Publikacja finansowana ze środków Agencji Badań Medycznych w ramach projektu Polish Chimeric Antigen Receptor T-cell Network, numer 2020/ABM/04/00002. Podziękowania dla byRieske za pomoc w przygotowaniu rycin.

Konflikt interesów

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Piśmiennictwo