Telomerase – molecular marker in blood of ovarian cancer patients

Wstęp
Telomeraza, wyspecjalizowana RNA-polimeraza odpowiedzialna za odbudowywanie telomerów chromosomowych, występuje w nielicznych typach aktywnie dzielących się komórek, u których utrzymanie stałej długości chromosomu, a przez to stabilności całego genomu, jest niezbędne [1–3]. Specyficzne zdolności telomerazy powodują, że komórka, podlegając nieograniczonym podziałom, może nabierać cech komórki nowotworowej. Telomerazę można zatem nazwać markerem molekularnym oraz potencjalnym czynnikiem predykcyjnym i rokowniczym dla wielu różnych nowotworów [4–6]. Badania prowadzone w ostatnich 10 latach wykazały aktywność tego enzymu w prawie 80–95% komórek nowotworowych, wyjaśniając w ten sposób jeden z mechanizmów decydujących o ich nieśmiertelności [7–10]. Do nowotworów, w których wykryto obecność telomerazy, należy m.in. rak jajnika [5, 7].
Rak jajnika zajmuje czwarte miejsce wśród przyczyn zgonów spowodowanych nowotworami złośliwymi u kobiet. Stanowiąc mniej niż 1/3 nowotworów złośliwych narządów płciowych kobiet w Polsce, charakteryzuje się jednocześnie najmniejszą przeżywalnością wśród przypadków guzów złośliwych układu rozrodczego. Odsetek pięcioletnich przeżyć dla wszystkich stopni zaawansowania klinicznego tego nowotworu wynosi 30–40% i w ciągu ostatnich 30 lat nie poprawił się znacząco [11]. Przyczyną tej niekorzystnej struktury statystycznej raka jajnika jest brak dostatecznie czułych i swoistych metod diagnostycznych i przesiewowych [12, 13]. Niezwykle istotna wydaje się zatem konieczność kontynuacji badań nad biologią raków jajnika w celu opracowania optymalnych schematów diagnostycznych, a co za tym idzie – również terapeutycznych – dla tego nowotworu.
Dotychczas na podstawie badań tkanek nowotworowych i popłuczyn z jamy otrzewnej wykazano, że ponad 80% nowotworów złośliwych jajnika wykazuje aktywność telomerazy [5, 14, 15]. W piśmiennictwie niewiele jest jednak badań wykrywających obecność komórek raka jajnika we krwi, a ich wyniki są rozbieżne [16]. Detekcja krążących we krwi komórek nowotworowych na podstawie obecności telomerazy mogłaby być jedną z najbardziej obiecujących, nieinwazyjnych metod wykorzystania tego enzymu w diagnostyce raka jajnika. Opracowanie odpowiedniej techniki wykrywania komórek nowotworowych we krwi, świadczących o zagrożeniu przerzutami lub istnieniu ognisk przerzutowych, umożliwiłoby wprowadzenie efektywniejszej diagnostyki nowotworów jajnika. Mogłoby to zwiększyć wczesną wykrywalność i ułatwić klasyfikację kliniczną tego nowotworu, a tym samym umożliwiłoby podejmowanie odpowiednich decyzji terapeutycznych oraz bardziej precyzyjne monitorowanie wyników leczenia chorych.

>b>Cel pracy
1. Ocena ekspresji genu dla katalitycznej podjednostki telomerazy (TERT) w komórkach nowotworowych krążących we krwi (circulating tumour cells – CTC) u chorych na raka jajnika z wykorzystaniem reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (Real-Time PCR – RT-PCR).
2. Określenie znaczenia obecności TERT we krwi pacjentek z rakiem jajnika dla celów diagnostyczno-prognostycznych.

Materiał i metody
Badania prowadzono w Klinice Ginekologii Onkologicznej Katedry Onkologii oraz Zakładzie Kancerogenezy Molekularnej Katedry Medycyny Molekularnej i Biotechnologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi od 1.01.2005 r. do 31.03.2008 r., po uzyskaniu zgody Komisji Bioetycznej nr RNN/132/02/KE. Objęto nimi 57 kobiet w wieku 30–74 lat (średnia wieku 53,2 ±11,96 roku) operowanych z powodu rozpoznanych po raz pierwszy guzów jajnika. Badane podzielono na dwie grupy: grupę I stanowioną przez chore na raka jajnika (n = 33) i grupę II – pacjentki z guzami łagodnymi jajnika (n = 24). Do grupy kontrolnej zakwalifikowano 20 zdrowych kobiet
. Od każdej pacjentki pobrano 10 ml krwi do probówek koagulacyjnych z cytrynianem sodu i przechowywano w temp. 4°C maksymalnie do 72 godz. Następnie izolowano CTC z wykorzystaniem kulek immunomagnetycznych związanych z monoklonalnymi przeciwciałami Ber-EP4 (Dynabeads Epithelial Enrich, Dynal Biotech) oraz wirowania frakcjonującego z wykorzystaniem Histopaque®/Ficoll (Sigma). Po uzyskaniu mRNA z CTC badano ekspresję genu dla podjednostki katalitycznej telomerazy (TERT) z wykorzystaniem RT-PCR i potwierdzano ją za pomocą elektroforezy. Badano korelacje między ekspresją badanego genu a klasycznymi czynnikami prognostycznymi dla raka jajnika (wiek, zaawansowanie kliniczne, zaawansowanie histopatologiczne, obecność płynu w jamie otrzewnej, zakres operacji). Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej z zastosowaniem testu c2, a w przypadku niespełnienia założeń wykorzystano test dokładny Fishera
. Celem potwierdzenia swoistości badanego genu dla raka jajnika analizowano jego ekspresję w 8 próbkach z tkankami raka jajnika (5 próbek pochodziło od chorych z grupy I). W celu sprawdzenia czułości metody wykonano natomiast szereg rozcieńczeń mieszaniny tkankowej (5 ×, 10 ×, 50 ×, 100 ×, 200 ×), a następnie wykonano analizę ekspresji genu w uzyskanych mieszaninach.


Wyniki
W grupie I (rak jajnika) stwierdzono ekspresję genu w 22/33 przypadków (66%), analizując krzywe dysocjacji RT-PCR (ryc. 1.), w 17/33 (51%) odczytując wartości Ct RT-PCR oraz w 15/33 (45%) w rozdziale elektroforetycznym (ryc. 2.). W grupie II (łagodne guzy jajnika) ekspresja TERT wystąpiła w 7/24 przypadki (29%), w 1/24 (4%) w wyniku analizy Ct RT-PCR oraz w 5/24 (21%) w elektroforezie. W grupie kontrolnej po przeanalizowaniu RT-PCR, Ct RT-PCR oraz rozdziału elektroforetycznego ekspresja TERT wystąpiła odpowiednio: w 10/20 (50%), 1/20 (5%) oraz 11/20 (55%) przypadków.
Oceniono zależności pomiędzy trzema różnymi sposobami analizy ekspresji genu TERT, stwierdzając w grupie I (rak jajnika) istotne statystycznie różnice między analizą krzywych dysocjacji RT-PCR a rozdziałem elektroforetycznym oraz oceną Ct RT-PCR a rozdziałem elektroforetycznym (p < 0,05). W grupie II i w grupie kontrolnej różnice w sposobie określania ekspresji genu TERT nie były istotne statystycznie (p > 0,05).
Dodatnia ekspresja (równoczesne występowanie ekspresji genu w RT-PCR i w rozdziale elektroforetycznym) genu TERT wystąpiła u 14/33 pacjentki (42,4%) w grupie z guzami złośliwymi, natomiast u 5/24 (20,8%) kobiety z grupy II i u 7/20 (35%) z grupy kontrolnej. Stwierdzono istotne statystycznie różnice między ekspresją genu TERT w grupie pacjentek z rakami jajnika i w grupie kontrolnej, w obu przypadkach ocenianej na podstawie analizy rozdziału elektroforetycznego, zbyt słabe jednak, aby traktować je jako istotne z punktu widzenia klinicznego.
Poddano ocenie korelacje ekspresji TERT z klasycznymi czynnikami prognostycznymi (tab. I). Nie stwierdzono istotnych statystycznie zależności między ekspresją genu TERT a wiekiem, stopniem zaawansowania klinicznego i zróżnicowania histopatologicznego czy zakresem operacji i obecnością płynu w jamie otrzewnej. Żadnych istotności statystycznych nie stwierdzono także, badając zależności między ekspresją genów i obecnością markerów nowotworowych oraz typem histologicznym guza (tab. II). W żadnej z 8 badanych próbek z tkankami raka jajnika nie znaleziono genu TERT (ryc. 3.), jak również w żadnym z rozcieńczeń (ryc. 4.).

Dyskusja
Celem pracy była ocena wykorzystania telomerazy jako markera molekularnego i jego zastosowania jako czynnika diagnostyczno-prognostycznego w raku jajnika. Ze względu na potencjalną rolę TERT jako wskaźnika zdolności raka do przerzutowania i tworzenia guzów wtórnych, badanie obecności telomerazy w CTC mogłoby mieć większe znaczenie niż innych biomarkerów.
Główny problem, jaki napotykano w trakcie badania ekspresji TERT w CTC, dotyczył obecności we krwi aktywnych limfocytów, w których również stwierdza się ekspresję telomerazy [2, 3]. Aby uniknąć fałszywie dodatnich wyników, a tym samym otrzymać bardziej skuteczną metodę, zastosowano kulki magnetyczne. Modyfikacja ta, po raz pierwszy opisana przez Hardinghama w 1993 r. [17], umożliwiła w relatywnie prosty sposób oddzielenie CTC od jądrzastych komórek krwi, w tym limfocytów. Poza tym celem uzyskania jeszcze większej specyficzności badania, przed izolacją CTC za pomocą kulek immunomagnetycznych, zastosowano wirowanie frakcjonujące z wykorzystaniem Histopaque®/Ficoll. Metoda ta pozwoliła na wyizolowanie frakcji komórek jądrzastych z krwi, w tym CTC, których gęstość zbliżona jest do limfocytów. Wyeliminowano w ten sposób czerwone krwinki, które mogłyby wpływać na interakcje między kulkami immunomagnetycznymi a nabłonkowymi komórkami nowotworowymi, co wg Gauthiera i wsp. w istotny sposób zwiększa swoistość metody [9]. W literaturze światowej znaleziono zaledwie kilka prac, w których komórki raka jajnika krążące we krwi wyizolowane zostały przy użyciu kulek immunomagnetycznych [18, 19]. Na uwagę zasługują prace wskazujące na RT-PCR jako metodę optymalną do oceny ekspresji genów w CTC, dzięki której możliwe jest wykrywanie zaledwie kilku komórek nowotworowych [20]. W przedstawionej pracy udało się wykryć ekspresję genu TERT i zidentyfikować próbki jako pozytywne dla ekspresji tego genu w liczbie 14/33 pacjentki (42,4%) w grupie z guzami złośliwymi jajnika. Pozostałe ponad 27,3% pacjentek (9/33) uznano za negatywne dla ekspresji TERT. Rozpatrując tak dużą częstość braku ekspresji TERT u pacjentek w grupie z rakiem jajnika, należy wziąć pod uwagę niską zawartość lub brak telomerazy w niektórych komórkach nowotworowych. Wniosek ten potwierdzają częściowo badania tkanek nowotworowych na obecność ekspresji TERT, w których wszystkie 8 próbek nie wykazywało obecności telomerazy. Wśród nich było 5 próbek pochodzących od pacjentek, u których uzyskano negatywne wyniki podczas analizy CTC. Negatywny wynik w badaniu tkanek można również tłumaczyć heterogennym składem komórkowym badanego skrawka tkanki, w którym komórki nowotworowe zdolne do nieograniczonej liczby podziałów mogą stanowić niewielki procent populacji. Jednocześnie trzeba zauważyć, że tylko takie komórki mogą być źródłem ognisk przerzutów.
Inną przyczyną występowania wyników negatywnych dla ekspresji TERT w komórkach krążących we krwi może być różnorodna ekspresja antygenów na CTC wiążących się z BerEP-4 na powierzchni kulek immunomagnetycznych [19, 21].
Jeszcze innym wytłumaczeniem ujemnych wyników ekspresji TERT jest histologia guza. Jak dowodzili Duggan i wsp., a wcześniej Kyo, śluzowe raki jajnika mogą nie wykazywać ekspresji TERT [5, 7], podobnie jak złośliwe nowotwory jasnokomórkowe [22]. W prezentowanej pracy ekspresji TERT nie wykazano w 5 próbkach krwi pacjentek ze śluzowym rakiem jajnika i 1 z 2 uzyskanych od kobiet z guzem jasnokomórkowym. Wyniki te mogą częściowo potwierdzać przypuszczenia Duggana i Kyo, równocześnie wykluczając telomerazę jako molekularny marker dla tego typu histologicznego raków jajnika. Poza tym wyniki ujemne mogą być związane także ze stopniem zaawansowania klinicznego. We wcześniejszych stadiach choroby komórki nowotworowe mogą być niewykrywalne we krwi obwodowej, a rozprzestrzeniać się tylko drogą układu limfatycznego [13, 19]. Wnioski te są zbliżone do wyników uzyskanych w pracy, gdzie 3/9 pacjentek (33,3%) z FIGO I lub II wykazywało negatywną ekspresję TERT, natomiast wśród pacjentek z FIGO III lub IV tylko 5/24 (20,8%). Niestety, różnice te, podobnie jak i wspomniane wcześniej wyniki dotyczące typu histologicznego guzów, nie były istotne statystycznie.
Prezentowana praca na postawie uzyskanych istotnych statystycznie różnic między obecnością ekspresji TERT w próbkach uzyskanych od pacjentek z rakami jajnika (42,4%) i pacjentek z grupy kontrolnej (35%) wskazuje na możliwość wykorzystania telomerazy jako markera molekularnego w diagnostyce raka jajnika. Dalszych badań wymaga jednak stwierdzenie wyników pozytywnych dla ekspresji TERT także w guzach łagodnych (5/24 = 20,8%), których liczba, choć mniejsza niż w grupie chorych na raka jajnika (14/33 = 42,4%), nie różniła się w sposób istotny statystycznie. Kyo i wsp. tłumaczą obecność telomerazy w guzach łagodnych i granicznych (w przedstawionym badaniu oba z guzów granicznych wykazywały ekspresję TERT) jako jeden z czynników biorących udział w ich progresji [5]. Zmiany te mają wykazywać słabą ekspresję TERT ze względu na obecność populacji nieśmiertelnych komórek z obecną w nich telomerazą. Pojawianie się takiej słabej ekspresji telomerazy wyjaśniane było przez Kyo udziałem tego enzymu w początkowych przemianach procesu kancerogenezy, a jej istnienie w zmianach łagodnych lub guzach granicznych jako prawdopodobieństwo ich przemiany w guzy złośliwe.
Niestety, prawdopodobna pozostaje także obecność aktywnych limfocytów T i B, które mimo prób wyizolowania z krwi badanej mogły pozostać w próbkach, dając fałszywie dodatnie wyniki ekspresji TERT [2, 23]. Paterlini-Brechot i Benali opisują ponadto, że kulki immunomagnetyczne mogą łączyć się z makrofagami, komórkami plazmatycznymi i jądrzastymi prekursorami komórek hematopoetycznych, które albo same wykazują obecność telomerazy, albo dają pozytywną jej ekspresję po fagocytozie komórek nowotworowych krążących we krwi [24]. Poza tym we krwi występować może szereg nabłonkowych komórek nienowotworowych [25], związanych z łagodnymi chorobami proliferacyjnymi, zmianami zapalnymi (zwłaszcza wątroby), urazami i drobnymi interwencjami chirurgicznymi [26–28]. Taka interpretacja obecności fałszywie dodatnich wyników dla ekspresji TERT wykluczałaby telomerazę jako marker uniwersalny i specyficzny, gdyż może występować u pacjentek z infekcjami i licznymi łagodnymi chorobami towarzyszącymi rakowi jajnika.
W przeprowadzonych przez autorów opracowania badaniach ekspresja TERT była pozytywna w 33,3% przypadków w grupie chorych z mniejszym stopniem zaawansowania klinicznego oraz w 45,8% w grupie chorych z większym stopniem zaawansowania klinicznego. Zbliżone, niewielkie różnice i także nieistotne pod względem statystycznym, występowały pomiędzy liczbą wyników pozytywnych u pacjentek z większym stopniem zróżnicowania (25%) a chorymi z guzami o mniejszym stopniu zróżnicowania (48%). W świetle tych wyników telomeraza nie nadaje się na marker różnicujący guzy jajnika pod względem stopnia zróżnicowania histopatologicznego czy zaawansowania klinicznego, a co za tym idzie – nie jest związana z potencjalną złośliwością guza. Sprzeczne jest to z tezami wysuniętymi przez Hiyamę, a potwierdza wstępne obserwacje Kyo [2, 5]. Ponadto pozostałe czynniki prognostyczne nie wykazywały korelacji istotnej pod względem statystycznym z obecnością pozytywnej ekspresji TERT, co potwierdzają wcześniejsze badania Sakamoto, z których wynika, że telomeraza nie zawsze wykazuje korelacje z czynnikami kliniczno-patologicznymi raka jajnika i nie może być traktowana jako indywidualny lub skorelowany czynnik prognostyczny dla tego nowotworu [22].
Podsumowując, na podstawie badań przeprowadzonych na uzyskanym materiale stwierdzić można, że telomeraza nie może być traktowana jako wystarczająco czuły i swoisty marker molekularny wykrywania komórek nowotworowych we krwi w raku jajnika do celów klinicznych i badawczych z wykorzystaniem przedstawionej metody.

Wnioski
1. Badanie ekspresji genu TERT w komórkach nowotworowych krążących we krwi obwodowej za pomocą przedstawionej metody jest niedostatecznie czułe i swoiste, aby mogło być przydatne w diagnostyce obecności CTC.
2. Telomeraza nie może być wykorzystana jako marker molekularny w diagnostyce raka jajnika za pomocą przedstawionej metody.
3. Nie znaleziono istotnych statystycznie zależności między obecnością ekspresji TERT a znanymi czynnikami prognostycznymi dla raka jajnika (wiek, zaawansowanie kliniczne, zaawansowanie histopatologiczne, obecność płynu w jamie otrzewnej, zakres operacji).
4. Znaczenie diagnostyczne wykrywania CTC z zastosowaniem detekcji ekspresji markerów molekularnych wymaga dalszych badań z udziałem większej grupy pacjentek.

Praca finansowana przez UM w Łodzi z pracy własnej nr 502-11-438.

Piśmiennictwo
1. Wright WE, Piatyszek MA, Rainey WE, et al. Telomerase activity in human germline and embryonic tissues and cells. Dev Genet 1996; 18: 173-9.
2. Hiyama K, Hirai Y, Kyoizumi S, et al. Activation of telomerase in human lymphocytes and hematopoietic progenitor cells. J Immunol 1995; 155: 3711-5.
3. Norrback KF, Roos G. Telomeres and telomerase in normal and malignant haematopoietic cells. Eur J Cancer 1997; 33: 774-80.
4. Shay JW, Gazdar AF. Telomerase activity in the early detection of cancer. J Clin Pathol 1997; 50: 106-9.
5. Kyo S, Kanaya T, Ishikawa H, et al. Telomerase activity in gynecological tumors. Clin Cancer Res 1996; 2: 2023-8.
6. Kim NW. Clinical implications in telomerase in cancer. Eur J Cancer 1997; 5: 781-6.
7. Duggan BD, Wan M, Yu MC, et al. Detection of ovarian cancer cells: comparison of a telomerase assay and cytologic examination. J Natl Cancer Inst 1998; 90: 238-42.
8. Bednarek AK, Sahin A, Brenner AJ, et al. Analysis of telomerase activity levels in breast cancer: positive detection at the in situ breast carcinoma stage. Clin Cancer Res 1997; 3: 11-6.
9. Gauthier LR, Granotier C, Soria JC, et al. Detection of circulating carcinoma cells by telomerase activity. Br J Cancer 2001; 84: 631-5.
10. Faraoni I, Turriziani M, Masci G, et al. Decline in telomerase activity as a measure of tumor cell killing by antineoplastic agents in vitro. Clin Cancer Res 1997; 3: 579-85.
11. Benedet JL, Bender H, Jones H 3rd, et al. FIGO staging classifications and clinical practice guidelines in the management of gynecologic cancers. FIGO Committee on Gynecologic Oncology. Int J Gynaecol Obstet 2000; 70: 209-62.
12. Bast RC Jr, Brewer M, Zou C, et al. Prevention and early detection of ovarian cancer: mission impossible? Recent Results Cancer Res 2007; 174: 91-100.
13. Ginekologia onkologiczna. Markowska J (red.). T. 1–2, wyd. 2. Elsevier Urban & Partner, Wrocław 2006.
14. Kyo S, Takakura M, Tanaka M, et al. Quantitative differences in telomerase activity among malignant, premalignant, and benign ovarian lesions. Clin Cancer Res 1998; 4: 399-405.
15. Kyo S, Kanaya T, Takakura M, et al. Expression of human telomerase subunits in ovarian malignant, borderline and benign tumors. Int J Cancer 1999; 80: 804-9. 16. von Schlippe M, Rustin GJ. Circulating tumour markers in ovarian tumours. Forum (Genova) 2000; 10: 383-92.
17. Hardingham JE, Kotasek D, Farmer B, et al. Immunobead-PCR: a technique for the detection of circulating tumor cells using immunomagnetic beads and the polymerase chain reaction. Cancer Res 1993; 53: 3455-8.
18. Stimpfl M, Schmid BC, Obermair A, et al. Comparison of flow cytometry and RT-PCR for the detection of ovarian cancer cells in peripheral blood. Oncol Res 1999; 11: 367-73.
19. Sapi E, Okpokwasili NI, Rutherford T. Detection of telomerase-positive circulating epithelial cells in ovarian cancer patients. Cancer Detect Prev 2002; 26: 158-67.
20. Ring AE, Zabaglo L, Ormerod MG, et al. Detection of circulating epithelial cells in the blood of patients with breast cancer: comparison of three techniques. Br J Cancer 2005; 92: 906-12.
21. Soria JC, Gauthier LR, Raymond E, et al. Molecular detection of telomerase-positive circulating epithelial cells in metastatic breast cancer patients. Clin Cancer Res 1999; 5: 971-5.
22. Sakamoto M, Toyoizumi T, Kikuchi Y, et al. Telomerase activity in gynecological tumors. Oncol Rep 2000; 7: 1003-9.
23. Weng NP, Levine BL, June CH, Hodes RJ. Regulated expression of telomerase activity in human T lymphocyte development and activation. J Exp Med 1996; 183: 2471-9.
24. Paterlini-Brechot P, Benali NL. Circulating tumor cells (CTC) detection: clinical impact and future directions. Cancer Lett 2007; 253: 180-204.
25. Fehm T, Solomayer E, Meng S, et al. Methods for isolating circulating epithelial cells and criteria for their classification as carcinoma cells. Cytotherapy 2005; 7: 171-85.
26. Tahara H, Nakanishi T, Kitamoto M, et al. Telomerase activity in human liver tissues: comparison between chronic liver disease and hepatocellular carcinomas. Cancer Res 1995; 55: 2734-6.
27. Goeminne JC, Guillaume T, Symann M. Pitfalls in the detection of disseminated non-hematological tumor cells. Ann Oncol 2000; 11: 785-92.
28. Crisan D, Ruark DS, Decker DA, et al. Detection of circulating epithelial cells after surgery for benign breast disease. Mol Diagn 2000; 5: 33-8.