Terapia CAR-T w onkologii i w innych dziedzinach medycyny

Wstęp

CAR-T (chimeric antigen receptors T cell therapy) to immunoterapia należąca do ATMP (advanced therapy medicinal products; produkty lecznicze terapii zaawansowanej). Dotychczas jest wykorzystywana w onkologii, ale np. tzw. CAR-T senolityczne mogą znaleźć zastosowanie w diabetologii lub nawet alergologii [1, 2]. Technologia CAR-T, w której litera C pochodzi od słowa chimera, to połączenie dwóch rodzajów odpowiedzi swoistej układu odpornościowego – cytotoksycznej (limfocyty T) i humoralnej (przeciwciała) [3]. Połączenie występuje w sensie dosłownym – fragment zmienny przeciwciała jest połączony kowalencyjnie z częścią podbłonową TCR i białek uczestniczących w transdukcji sygnałów z TCR [4]. Kolejne generacje CAR-T zawierają coraz więcej elementów ze szlaku transdukcji TCR. To chimerowe białko jest kodowane przez sztucznie wytworzony transgen [5]. Biotechnolodzy, współpracując z immunologami i inspirowani cytotoksycznością zależną od przeciwciał, stworzyli chimery: część zmienna przeciwciała wraz z częścią receptora komórki cytotoksycznej i białkami transdukcji sygnału z TCR [6]. Zamysłem było uzyskanie przewagi w walce z nowotworami w stosunku do naturalnych rodzajów odpowiedzi swoistej. Przeciwciała nie docierają do wszystkich fragmentów nowotworu, bo jego utkanie ten proces utrudnia, ale komórki z fragmentami przeciwciał zakotwiczonymi w błonie komórkowej dzięki połączeniu z elementami receptora TCR i białkami, przez które transdukuje on sygnał, umieją dotrzeć wszędzie i zabić komórki nowotworowe [7, 8]. Klasyczne limfocyty nie zawsze mogą rozpoznać antygeny nowotworowe prezentowane na molekułach MHC, bo komórki nowotworowe na różne sposoby zapobiegają temu procesowi lub niwelują jego konsekwencje [9]. Przeciwciała, a raczej ich fragmenty zmienne zakotwiczone w błonie komórek (CAR-T), rozpoznają struktury charakterystyczne dla komórek nowotworowych i nie potrzebują molekuł MHC [10]. Należy jednak wybrać na cel dla CAR-T (dla części zmiennej przeciwciał) te białka (antygeny), których komórki nowotworowe nie mogą ukryć czy tym bardziej zaniechać ich produkcji. Muszą być one bardzo potrzebne do funkcjonowania komórek nowotworowych [11]. Struktury te rozpoznawane są za pośrednictwem części zmiennej przeciwciał przez komórki cytotoksyczne CAR-T. Po takim rozpoznaniu CAR-T niszczą komórki nowotworowe, podobnie jak limfocyty T cytotoksyczne niszczą komórki prezentujące za pomocą MHC klasy I obce antygeny [12]. Inspiracją do tworzenia takiej technologii były, jak wspomniano, analizy tzw. ADCC cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał. Ponadto w tej chwili próbuje się modyfikować również limfocyty, aby wytwarzać komórki korzystające z podobnych receptorów Fc, posługując się mechanizmem bardziej zbliżonym do ADCC. Chodzi w tym przypadku o to, aby tworzyć transgeny, które będą kodowały chimerowe białko immunoglobulina i receptor Fc w obrębie limfocytów T [5, 6, 13]. Również w tym przypadku możliwe jest rozbudowanie białka chimerowego o molekuły ze szlaków transdukcji sygnałów [14]. Kluczowe jest to, że takie pochodne limfocytów, które mają przeciwciała (w CAR-T ich fragmenty), połączone są z receptorami na stałe (nieodwracalnie kowalencyjnie), a nie tak jak w mechanizmie ADCC w sposób odwracalny [12]. Komórki nowotworowe wymykają się każdej z dwóch istniejących oddzielnie w naturze i działających w sposób niezależny swoistych odpowiedzi naszego układu odpornościowego (humoralnej i komórkowej). CAR-T, łącząca dwa sposoby odpowiedzi, to broń, z którą komórki nowotworowe wcześniej się nie zetknęły. W ostatnim czasie próbuje się również tworzyć chimerowe makrofagi (CAR-M) [15]. CAR-T mają też oczywiście ograniczenia. Przykładowo pacjent czeka wiele tygodni na wyprodukowanie jego własnych CAR-T, aby przeszczep był autologiczny. Obecnie trwa wyścig do stworzenia uniwersalnych CAR-T – gotowych dla każdego pacjenta z określonym typem nowotworu. Nazywa się je CAR-T off the shelf – „CAR-T czekające na półce” [16]. Już teraz jednak dzięki CAR-T otrzymywanym indywidualnie dla chorego udaje się wyleczyć niektóre białaczki czy chłoniaki [17]. CAR-T w terapii tzw. guzów litych, czyli raków, mięsaków, guzów mózgu, stanowi trudniejsze wyzwanie [18]. Wykorzystanie CAR-T w alergologii lub chorobach z dysregulacją układu odpornościowego to kolejna trudniejsza część badań nad CAR-T [2, 19].

Mechanizm działania terapii CAR-T

Mechanizm działania immunoterapii CAR-T jest wyjątkowo interesujący. Terapia ta bazuje na własnych limfocytach T pacjenta onkologicznego. Komórki T zostają genetycznie zmodyfikowane, aby mogły rozpoznawać i eliminować komórki nowotworowe z organizmu. Ponadto usuwanie komórek nowotworu następuje bez wcześniejszego prezentowania antygenów limfocytom T za pośrednictwem białek głównego układu zgodności tkankowej (major histocompatibility complex – MHC) [10, 20]. Początkowy etap immunoterapii CAR-T polega na pobraniu krwi obwodowej pacjenta oraz wyizolowaniu z niej leukocytów (w tym limfocytów T) w procesie nazywanym leukaferezą [21]. Pozyskane w ten sposób limfocyty T są następnie poddawane modyfikacji genetycznej. Najczęściej w procesie transdukcji za pośrednictwem wirusowego wektora do komórek T wprowadzany jest chimeryczny receptor antygenowy (chimeric antigen receptor – CAR), odpowiedzialny za wiązanie specyficznego antygenu na powierzchni komórek nowotworowych. Limfocyt taki ma zdolność eliminacji komórek, na których powierzchni występuje antygen, przeciwko któremu w obrębie CAR występuje część zmienna przeciwciała [20]. Obecnie wyróżnia się trzy generacje CAR. Chimeryczny receptor antygenowy pierwszej generacji jest białkiem fuzyjnym złożonym z wewnątrzkomórkowej domeny sygnałowej zawierającej CD3ζ, domeny transbłonowej oraz zewnątrzkomórkowej domeny zawierającej jednołańcuchowy zmienny fragment (single-chain variable fragment – scFv) przeciwciała wiążący odpowiednie białko w błonie komórek nowotworu. CAR drugiej generacji ma dodatkową cząsteczkę kostymulującą, tj. CD28, CD137, CD134, 4‐1BB lub OX-40, związaną z CD3ζ. W CAR trzeciej generacji fragment sygnałowy związany jest z dwiema odrębnymi domenami kostymulującymi [4, 5, 22].
Z pozoru pozyskiwanie limfocytów CAR-T wiążących i usuwających komórki guza z organizmu pacjenta cierpiącego na chorobę nowotworową wydaje się nieskomplikowane. W praktyce jednak proces ten jest nieco bardziej złożony. Pierwotnie konieczne jest otrzymanie wektora retro- lub lentiwirusowego przenoszącego odpowiedni CAR. W tym celu zakłada się hodowle linii komórkowej o szczególnej skłonności do transfekcji, takie jak linia komórek eukariotycznych HEK-293T, lub analogicznej. Cząsteczki wektora wirusowego generowane są w warunkach in vitro poprzez przejściową transfekcję wskazanej linii komórkowej plazmidami zawierającymi sekwencje poszczególnych genów struktury retro- lub lentiwirusa oraz elementów CAR. Otrzymane wektory wirusowe przenoszące CAR dodawane są następnie do hodowli aktywowanych komórek T pacjenta. W procesie transdukcji do limfocytów T wprowadzany jest CAR, który na koniec pojawi się w błonie limfocytów i docelowo będzie odpowiadać za rozpoznawanie oraz wiązanie antygenów na powierzchni komórek guza [23]. Zmodyfikowane komórki CAR-T są namnażane ex vivo do odpowiedniej liczby, zdolnej do usuwania komórek nowotworowych z organizmu chorego. W tym czasie pacjent otrzymuje chemioterapię limfodeplecyjną (lymphodepleting chemotherapy), składającą się z fludarabiny i cyklofosfamidu, w celu ograniczenia liczby komórek T w jego krwi obwodowej. W końcowej fazie limfocyty CAR-T są ponownie podawane pacjentowi podczas jednokrotnej infuzji dożylnej [24]. W organizmie chorego zmodyfikowane limfocyty powinny proliferować, przez co nierzadko nazywa się je tzw. żywym lekiem [25]. Immunoterapia CAR-T okazuje się niezwykle obiecującą i skuteczną metodą w leczeniu pacjentów z nowotworami hematologicznymi za pomocą ich własnych komórek układu odpornościowego. Ponadto pojawiają się również doniesienia o potencjalnej możliwości walki z guzami litymi za pośrednictwem zmodyfikowanych limfocytów CAR-T pacjentów onkologicznych [26].

CAR-T w białaczkach i chłoniakach

Wysoka specyficzność terapii z wykorzystaniem komórek CAR-T stworzyła nowe możliwości w walce z wieloma nowotworami, ponieważ dzięki nim można skierować leczenie bezpośrednio przeciw komórkom nowotworowym, nie szkodząc komórkom prawidłowym [27]. Obecnie największą efektywność komórek CAR-T obserwuje się u pacjentów z nowotworami hematologicznymi [17]. Amerykańska Agencja Żywności i Leków wyraziła zgodę na wykorzystanie technologii CAR-T między innymi u pacjentów z ostrą białaczką limfoblastyczną (acute lymphoblastic leukemia – ALL) oraz pacjentów z nawrotowym i opornym na leczenie chłoniakiem nieziarniczym wywodzącym się z limfocytów B (non-Hodgkin’s lymphoma – NHL). W przypadku pierwszej grupy dopuszczony preparat nosi nazwę Kymriah i został on również zaakaceptowany do użytku u pacjentów z grupy drugiej. Yescarta to nazwa drugiego dopuszczonego preparatu i znalazł on zastosowanie u dorosłych pacjentów z NHL. Użycie obu preparatów zostało zatwierdzone tylko na terenie Stanów Zjednoczonych [28–30]. Komórki CAR-T stosowane w przypadku obu tych nowotworów wyposażone są w receptory wiążące glikoproteinę CD19, będącą białkiem charakterystycznym zarówno dla dojrzewających, jak i już dojrzałych limfocytów B [31, 32]. W przypadku obu wspomnianych wyżej nowotworów obserwuje się nadmierną proliferację limfocytów B i/lub ich dysfunkcję, dlatego też to właśnie one są celem podczas terapii z wykorzystaniem komórek CAR-T [33, 34]. Należy jednak wziąć pod uwagę, że dostępnych jest aktualnie wiele metod leczenia nowotworów hematologicznych, takich jak chemioterapia, radioterapia oraz przeszczep krwiotwórczych komórek macierzystych, które pozwalają uzyskać zadowalające efekty terapeutyczne [35, 36]. Wciąż jednak istnieje odsetek pacjentów, u których pojawiają się nawroty choroby, charakteryzujące się opornością na dotychczas stosowane leczenie [37–39].
Nadzieją na wyleczenie tych właśnie pacjentów jest przeprowadzenie wspomnianej wyżej transplantacji krwiotwórczych komórek macierzystych wymagającej wystąpienia remisji oraz odpowiedniego dawcy, a także nowoczesne terapie z wykorzystaniem komórek CAR-T [17, 40]. Wyniki dotychczasowych badań pokazują, że komórki CAR-T wyposażone w receptor wiążący antygen CD19 pozwalają na uzyskanie kompletnej remisji nowotworu u blisko 90% pacjentów z nawrotową, oporną na leczenie ostrą białaczką limfoblastyczną (ALL), podczas gdy wartość ta nie przekracza 45% dla klasycznej chemioterapii [41]. W przypadku nawrotowej, opornej na leczenie przewlekłej białaczki limfocytowej (CLL) pozytywny wynik terapii zaobserwowano aż u 57% pacjentów, wśród których doszło do częściowej lub kompletnej remisji nowotworu [42].
W lutym 2021 roku FDA wyraziła zgodę na zastosowanie komórek CAR-T skierowanych przeciwko antygenowi CD19 u dorosłych pacjentów z nawrotowym i opornym na leczenie chłoniakiem nieziarniczym pochodzącym z limfocytów B (Hodgkin’s lymphoma – HL), gdy pierwsza i/lub druga linia terapii nie przynoszą efektów. Dotychczasowe badania pokazują, że efektywność terapii bazującej na komórkach CAR-T sięga ponad 50% [29]. Innym nowotworem hematologicznym wywodzącym się z limfocytów B jest chłoniak Hodgkina. U pacjentów z nawrotową i oporną na leczenie formą tego chłoniaka przeprowadzane są aktualnie badania kliniczne wykorzystujące komórki CAR-T rozpoznające antygen CD30, którego nadekspresja jest charakterystyczna dla komórek chłoniaka Hodgkina. Wyniki I i II fazy badań klinicznych pokazują, że u 59% pacjentów zaobserwowano całkowitą remisję nowotworu, a aż 94% pacjentów przeżyło co najmniej rok od zastosowania terapii [43]. Ponieważ zaprojektowanie odpowiednich komórek CAR-T wymaga znajomości antygenów specyficznych dla danych typów komórek, naukowcy nadal poszukują idealnych celów terapeutycznych np. dla szpiczaka mnogiego (multiple myeloma – MM). Wydawałoby się, że komórki szpiczaka mnogiego, wywodzące się również z limfocytów B, będą podatne na leczenie komórkami CAR-T skierowanymi przeciwko antygenowi CD19. Jednak w przypadku tego nowotworu praktycznie nie dochodzi do ekspresji glikoproteiny CD19, a dotychczasowe badania pokazały, że komórki CAR-T z receptorem przeciwko antygenowi CD19 dają praktycznie nikłe efekty [44]. Antygen specyficzny dla dojrzewających limfocytów B (B cell maturation antygen – BCMA) wydaje się obiecującym celem terapeutycznym w walce ze szpiczakiem mnogim. Aktualnie przeprowadzane badania kliniczne przedstawiają, że pozytywny efekt terapeutyczny uzyskano u 20–64% pacjentów z nawrotową i oporną na leczenie formą szpiczaka mnogiego po zastosowaniu komórek CAR-T specyficznych dla BCMA [45].
W przypadku pozostałych nowotworów hematologicznych, takich jak ostra białaczka szpikowa (acute myeloid leukemia – AML) czy inne chłoniaki nieziarnicze, nadal poszukuje się idealnych celów terapeutycznych oraz próbuje się zastosowania dostępnych już komórek CAR-T (np. anty-CD19) w połączeniu z klasyczną chemioterapią [46, 47]. Niestety pomimo wielu zalet wykorzystanie komórek CAR-T u pacjentów z nowotworami hematologicznymi wiąże się również z występowaniem poważnych skutków ubocznych. Do najczęstszych należy zespół uwalniania cytokin (cytokine release syndrome – CRS) oraz prawdopodobnie wynikająca z niego wysoka neurotoksyczność. Zespół uwalniania cytokin wiąże się z szybkim namnażaniem się modyfikowanych limfocytów T wprowadzonych do krwiobiegu pacjenta i gwałtownym uwolnieniem cytokin [48]. Możliwe jest, że nagły wzrost stężenia cytokin prozapalnych w krwiobiegu i płynie mózgowo-rdzeniowym prowadzi do uszkodzenia bariery krew–mózg. Neuroto­ksyczność obserwowana u pacjentów poddanych terapii komórkami CAR-T objawia się m.in. bólami głowy, zaburzeniami mowy, halucynacjami wzrokowymi [49].
W przypadku komórek CAR-T warto również zwrócić uwagę na to, że antygeny, przeciwko którym skierowane są modyfikowane limfocyty T, mogą pojawiać się nie tylko na komórkach nowotworowych, lecz także w pewnym stopniu na komórkach prawidłowych. Fakt ten niesie ze sobą ryzyko występowania niespecyficzności terapii i może skutkować uszkodzeniem prawidłowych tkanek [50]. Dlatego też tak ważne jest, by precyzyjnie dobrać antygen, który ma być rozpoznawany przez komórki CAR-T [11]. Wykorzystanie komórek CAR-T w onkologii niesie ogromne nadzieje terapeutyczne, zwłaszcza dla pacjentów z nowotworami hematologicznymi. Już dziś dzięki wielu aktualnie prowadzonym badaniom klinicznym obserwuje się wysoką skuteczność terapii z zastosowaniem modyfikowanych limfocytów T. Pozostaje jedynie kwestia eliminacji poważnych skutków ubocznych związanych z gwałtownym uwalnianiem cytokin prozapalnych, które mogą negatywnie wpłynąć na efektywność terapii [51].

Główne mechanizmy niepowodzenia terapii ADOPTYWNEJ limfocytami CAR-T

Na podstawie dotychczas opublikowanych danych z badań klinicznych oraz oceny skuteczności CAR-T w białaczkach i chłoniakach nieziarniczych cel, jaki należy wyznaczyć w dalszej pracy nad rozwojem terapii CAR-T, to optymalizacja podejścia oparta przede wszystkim na przezwyciężeniu głównych problemów związanych ze skutecznością terapii CAR-T u niektórych pacjentów. Wraz z rozpowszechnieniem stosowania terapii adoptywnej limfocytami CAR-T naukowcy dostrzegają problemy związane z opornością i nawrotami. Pomimo niezwykle obiecujących wyników, jak również pozytywnej odpowiedzi na terapię także u pacjentów z opornymi, nawracającymi nowotworami, nadal pozostaje pewna grupa chorych, u których nie obserwuje się odpowiedzi na zastosowaną terapię [52]. Wyniki badań klinicznych wskazują również, że u części pacjentów dochodzi do nawrotu choroby, po wcześniejszej pozytywnej odpowiedzi na podanie komórek CAR-T [53]. Terapia CAR-T często skutecznie wywołuje czasową remisję, jednak uniknięcie nawrotu choroby stanowi u wielu pacjentów wyzwanie.
Do nawrotu choroby najczęściej może dochodzić z powodu utraty antygenu na komórce nowotworowej (7–33% chorych na ostrą białaczkę limfoblastyczną) [54, 55]. Jako mechanizm utraty antygenu wskazuje się obecnie kilka zjawisk. Jednym z nich jest alternatywny splicing, w wyniku którego dochodzi do powstawania takich wariantów antygenów, które nie zawierają epitopu wcześniej rozpoznawanego przez komórkę CAR-T [56]. Innym zbadanym i niezwykle ciekawym zjawiskiem jest tzw. cell lineage switch, gdy po zastosowaniu terapii CAR-T anty-CD19 u pacjentów z ALL CD19+ następuje nawrót choroby w postaci ostrej białaczki szpikowej (AML CD19–) wraz z obserwowaną zmianą fenotypu białaczkowego z limfoidalnego na szpikowy [57]. Kolejnym z często występujących zjawisk odpowiedzialnych za brak skuteczności CAR-T jest obniżenie ekspresji antygenu w takim stopniu, który uniemożliwia zainicjowanie funkcji litycznej przez limfocyt CAR-T. Mackall i wsp. wykazali, że niska ekspresja CD30 na hematopoetycznych komórkach progenitorowych (HPC) jest niewystarczająca, aby wywołać cytolizę, w przeciwieństwie do wysokiej ekspresji, obecnej w komórkach chłoniaka. Co interesujące, działanie CAR-T jest regulowane nie tylko przez gęstość antygenu na docelowych komórkach nowotworowych, lecz także przez samą gęstość CAR na zmodyfikowanych limfocytach T [58]. Ten sam zespół udokumentował także, że nawroty obserwowane u pacjentów leczonych CAR-T anty-CD22 bezpośrednio korelują ze zmniejszonym poziomem CD22 na komórkach B-ALL [59]. Badacze posunęli się dalej, aby wykazać w badaniach na zwierzętach, że różne poziomy CD22 na komórkach białaczkowych mogą mieć krytyczny wpływ na skuteczność przeciwnowotworową. Wyniki te mają implikacje nie tylko dla stosowania terapii CAR-T w nowotworach hematologicznych, lecz także w związku z dużym postępem w zakresie możliwości wykorzystania komórek CAR-T w guzach litych.
Wyniki badań klinicznych wskazują, że zjawisko utraty antygenu CD19 to główne niepowodzenie w terapii (nawet do 60% nawrotów białaczek po terapii komórkami CAR-T anty-CD19) [60]. Podkreśla to potrzebę zastosowania innego systemu łączącego różne cele terapeutyczne. Obecnie optymalnym rozwiązaniem przeciwdziałającym nawrotom w wyniku utraty antygenu komórki nowotworowej są terapie wykorzystujące CAR-T skierowane przeciw więcej niż jednemu antygenowi. Takie podejście osiągane jest albo poprzez jednoczes­ne lub sekwencyjne podawanie różnych komórek CAR-T skierowanych przeciw różnym antygenom (koadministracja) lub też skonstruowanie bispecyficznych lub tandemowych CAR-T (jedna komórka T ma dwie lub więcej cząsteczki CAR skierowane przeciw różnym antygenom) [61]. Możliwa jest również kotransdukcja, czyli transdukowanie komórek T dwoma wektorami kodującymi różne CAR, w wyniku czego otrzymuje się komórki pozytywne dla jednego pojedynczego CAR (antygen 1), komórki pozytywne dla drugiego pojedynczego CAR (antygen 2) oraz pozytywne dla obu CAR.
Za podejściem w terapii CAR-T do celowania w więcej niż jeden antygen przemawia dużo zalet, niemniej pozostaje wiele krytycznych zagadnień, takich jak ocena bezpieczeństwa zastosowania, szczególnie pod kątem zwiększenia toksyczności, które wymagają dalszych badań. Wiedza na temat profilu bezpieczeństwa i aktywności in vivo komórek CAR-T ukierunkowanych na więcej niż jeden antygen jest niepełna. Możliwe jest, że celowanie w więcej niż jeden antygen może prowadzić do bardziej rozległego efektu cytotoksycznego związanego z uwalnianiem cytokin, tzw. burzy cytokinowej. Nie jest również jasne, czy aktywność cytotoksyczna obserwowana in vivo jest spowodowana preferencyjnym wyborem jednego antygenu ponad inny oraz czy w warunkach, w których podawany jest więcej niż jeden produkt CAR-T (koadministracja), nastąpi równomierna dystrybucja zmodyfikowanych komórek [62]. Do oceny skuteczności podejść opartych na zastosowaniu CAR-T przeciw dwóm antygenom konieczne będą długoterminowe obserwacje. Obecnie realizowanych jest już wiele badań klinicznych pod tym kątem, ale trwałość remisji po takiej terapii jest krytycznym pytaniem bez odpowiedzi z uwagi na wczesne fazy realizacji tych badań [61]. We wczesnych fazach badania pokazują bezpieczeństwo i techniczną wykonalność podwójnego CAR-T. Zaobserwowano niską toksyczność z zależnym od dawki wysokim odsetkiem całkowitej odpowiedzi (complete response – CR) [63]. W badaniach przedklinicznych CAR-T z konstruktem tandemowym skutecznie wyeliminowało komórki linii komórkowej Raji zarówno in vitro, jak i in vivo [64]. W modelu zwierzęcym limfocyty CAR-T z układem tandemowym zapewniały lepszą skuteczność przeciw komórkom białaczkowym w porównaniu z odpowiedzią indukowaną przez pojedyncze komórki anty-CD19 lub anty-CD20 CAR-T lub ich mieszaninę [65], a wyniki z fazy przedklinicznej zostały przełożone na I fazę badań klinicznych – pierwsze ludzkie bispecyficzne CAR-T z tandemowym receptorem anty-CD19/anty-CD20 [66]. Wczesne wyniki tego badania wykazały CR lub odpowiedź częściową (partial response – PR) u 3 z 6 wstępnie leczonych pacjentów z nawracającą NHL komórek B (terapia komórkami CAR-20.19-T). U 3 pacjentów, u których nastąpił postęp lub nawrót choroby, stwierdzono obecność CD19 lub CD20 podczas kolejnej biopsji, co sugerowałoby jednak mechanizmy inne niż utrata antygenu jako etiologię niepowodzenia terapii.
Drugim z najczęściej wymienianych mechanizmów odpowiedzialnych za nieskuteczność terapii CAR-T jest tzw. wyczerpanie limfocytów T. Pojęcie „wyczerpania” (T-cells exhaustion) odnosi się do stanu dysfunkcji charakteryzującego się ograniczeniem funkcji efektorowej w postaci utraty funkcji cytotoksycznych i szczególnie zwiększoną ekspresją receptorów hamujących odpowiedź immunologiczną, tzw. immunologicznych punktów kontrolnych. Wyczerpanie po przewlekłej ekspozycji na antygen zwykle wywołane jest przez przewlekłą stymulację, np. w nowotworach [67]. Cechą charakterystyczną takich „wyczerpanych” limfocytów jest ich upośledzona zdolność do proliferacji po zetknięciu się z antygenem. Schuster i wsp. wykazali, że w DLBCL wysoki odsetek limfocytów T LAG3+, biomarkera wyczerpania limfocytów T, jest skorelowany z ograniczoną odpowiedzią na terapię limfocytami CAR-T anty-CD19 [68]. Wśród mechanizmów odpowiedzialnych za (lub ogólniej ujmując – związanych z) ograniczoną proliferację zmodyfikowanych limfocytów CAR-T wymienia się aktywację komórkowego starzenia się (senescencji) [69–72]. Nie wiadomo natomiast obecnie, czy wyczerpanie limfocytów wynika bezpośrednio z senescencji, czy też są jednocześ­nie obserwowane niezależne zjawiska, na co mogłaby wskazywać np. odmienna ekspresja określonych receptorów. Przykładowo senescentne limfocyty T charakteryzują się niską ekspresją CD28 i wysoką receptorów NK, podczas gdy limfocyty o cechach wyczerpania mają zwiększoną ekspresję PD-1 i CTLA-4 [73]. Mechanizmy wyczerpania komórek CAR-T nie są dobrze poznane. Jedno z badań sugerowało, że receptory CAR na limfocytach T mogą się spontanicznie gromadzić, niezależnie od antygenu, generując toniczną sygnalizację CAR-CD3ζ, która z kolei może indukować wyczerpanie limfocytów CAR-T [74]. Innym mechanizmem odpowiedzialnym za indukcję wyczerpania w limfocytach CAR-T może być endogenny sygnał TCR w obecności specyficznego antygenu [75].
Niezwykle istotne pod tym względem są prace dotyczące szczególnie CAR-T czwartej generacji i roli znaczenia receptora programowanej śmierci 1 oraz jego ligandów (PD-1 i PD-L1). CAR-T czwartej generacji mogą zawierać regiony kodujące inhibitory punktów kontrol­nych układu odpornościowego (np. anty-PD1, anty-CTLA-4 lub anty-PD-L1). CAR-T wydzielające te inhibitory zapobiegają wyczerpaniu komórek T, kilkukrotnie zmniejszają wzrost i masę guza w przypadku nowotworów litych w porównaniu z działaniem parental CAR-T, zwiększają poziom wydzielanego granzymu B. Podsumowując – zwiększają one aktywność przeciwnowotworową komórek CAR-T i zwiększają ich przeżywalność in vivo [76]. Wśród podejść do zahamowania aktywności PD-1 rozpatruje się terapię CAR-T skojarzoną z przeciwciałami przeciw PD-1 (np. niwolumab) lub innymi działającymi na tej samej zasadzie inhibitorami PD-1 i PD-L1, np. ipilimimab (bloker CTLA-4, PD-L1), pembrolizumab, atezolizumab, awelumab, durwalumab, cemiplimab, spartalizumab [77]. Alternatywnym podejściem jest zastosowanie wewnętrznej blokady (intrinistic blockade) polegającej na modyfikacji uzyskanych komórek CAR-T w taki sposób, by wyciszyć ekspresję PD-1, np. przy użyciu systemu CRISPR/Cas9 [78]. Niemniej najnowsze doniesienia wskazują, że całkowite zablokowanie ekspresji PD-1 również może negatywnie wpływać na potencjał przeciwnowotworowy komórek CAR-T, hamując aktywność proliferacyjną komórek T i przyspieszając wczesne różnicowanie komórek T [79, 80]. Co ciekawe, lokalna blokada PD-1 (w komórkach nowotworowych) może zwiększyć aktywność przeciwnowotworową komórek CAR-T, unikając jednocześnie toksyczności związanej z ogólnoustrojową blokadą PD-1 [81].
Aktualnie najgroźniejszym działaniem niepożądanym terapii CAR-T jest zespół uwalniania cytokin (cytokine release syndrome – CRS), który w różnym stopniu nasilenia wystąpił u prawie wszystkich pacjentów po zastosowaniu produktu Yescarta. Możliwe jest ponadto, że celowanie w więcej niż jeden antygen może prowadzić do bardziej rozległego efektu cytotoksycznego związanego z uwalnianiem cytokin, co uniemożliwi podawanie takich CAR-T, pomimo że ich skuteczność byłaby większa. Ostatnio wykazano istotny, precyzyjny wpływ na regulację toksyczności podobnej do zespołu uwalniania cytokin po zastosowaniu limfocytów CAR-T przy użyciu adapterów o niskiej masie cząsteczkowej [82]. Strategia ta oparta jest na dostosowywaniu dawki niskocząsteczkowego adaptera, który by zapoczątkować eradykację guza, musi połączyć CAR-T na limfocycie z antygenem na komórce nowotworowej. Alternatywnym podejściem do kontrolowanej aktywności i zwiększonego bezpieczeństwa klinicznego w zakresie ograniczenia możliwości wystąpienia CRS jest opracowanie indukowanych komórek T według modelu regulacji ekspresji genów przez antybiotyki z grupy tetracyklin, tzw. system Tet-On/Tet-Off, w którym ekspresja transgenu zależy od doksycykliny [83–86]. Stwierdzono jednak, że zastosowanie w sekwencji kodującej CAR systemów regulacyjnych opartych na rozwiązaniach znanych z systemów prokariotycznych lub wirusowych może zwiększać immunogenność transgenu [83].

Wyzwania i strategie w stosowaniu adoptywnej immunoterapii CAR-T w guzach litych

Rozwój technologii wykorzystujących zmodyfikowane limfocyty T następuje bardzo szybko. Taka intensywność prowadzonych badań daje możliwości terapeutyczne, jakich nie dawały w pewnych rodzajach nowotworów chemio- czy radioterapia. Nie ma wątpliwości, że immunoterapia adoptywna limfocytami CAR-T to przełomowe i wysoce efektywne narzędzie do walki z nowotworami krwi. Jednocześnie podejście to jest coraz częściej rozpatrywane i badane w przypadku występowania guzów litych. Niemniej należy zauważyć, że doświadczenia kliniczne z terapią komórkami CAR-T w guzach litych i guzach mózgu są mniej zachęcające, ponieważ obecnie tylko kilku pacjentów uzyskało pełną odpowiedź na terapię [26]. To co należy zaznaczyć, to fakt, że w przeciwieństwie do nowotworów pochodzenia hematologicznego, w przypadku guzów litych aktualnie nie ma zarejestrowanej terapii opartej na CAR-T. Realizowanych jest natomiast bardzo dużo badań przedklinicznych i klinicznych, w trakcie których zidentyfikowano wiele przeszkód w skutecznym wprowadzeniu takiej terapii do praktyki klinicznej, takich jak ograniczony zestaw unikalnych antygenów, w które można wycelować cząsteczki CAR; wysoka heterogenność komórek guza pod względem ekspresji antygenów; ograniczona funkcja efektorowa i przeżycie komórek T, zanim dotrą one do miejsc zmienionych nowotworowo; niezdolność komórek T do skutecznego dotarcia do guza i przenikania przez fizyczne bariery i wyraźnie immunosupresyjne mikrośrodowisko guza [26]. Do najczęściej rozważanych w terapii antygenów zewnątrzpowierzchniowych zalicza się antygen błonowy gruczołu krokowego (PSMA). W grudniu 2020 roku ogłoszono rozpoczęcie badania fazy IA z kandydatem na lek w przypadku guzów litych, uniwersalnym CAR-T (UniCAR) z funkcją switch dla pacjentów w późnych stadiach nawrotowych nowotworów litych wykazujących ekspresję antygenu błonowego gruczołu krokowego PSMA (UniCAR-T-PSMA) [87]. Innym, praktycznie jedynym dobrze poznanym neoantygenem powierzchniowym jest zmutowany receptor dla naskórkowego czynnika wzrostu (EGFRvIII), charakteryzujący się brakiem rozległej części domeny zewnątrzkomórkowej. Pod tym względem EGFRvIII jawi się jako unikalny cel dla CAR-T, występujący na powierzchni komórek nowotworowych, szczególnie często w glejakach wielopostaciowych (20–30% glioblastoma, IDH1 wild type). Warto także wymienić GD2, glikoproteinę, której nadekspresja obserwowana jest w siatkówczaku, glejaku, guzach Ewinga i innych guzach litych, zarówno wieku dziecięcego, jak i u dorosłych pacjentów onkologicznych [88]. W przypadku antygenów niewystępujących bezpośrednio na powierzchni komórek guzów litych badania kliniczne prowadzone są nad zastosowaniem CAR-T przeciw HER2 [89–94], antygenowi karcynoebrionalnemu CEA [95–99], IL-13R czy IL13Rα [100–104].
W przeciwieństwie do nowotworów hematologicznych, w przypadku guzów litych zarówno przemieszczanie się limfocytów T w okolice guza, jak i naciekanie są często silnie ograniczone przez mikrośrodowisko immunosupresyjne [105]. Wydzielane przez komórki guza hemokiny, takie jak CXCL1, CXCL12 czy CXCL5, zapobiegają zarówno przemieszczaniu się komórek T w kierunku zmian nowotworowych, jak i ich infiltracji [106–108]. Jednym ze sposobów przezwyciężenia tych trudności jest modyfikacja limfocytów T polegająca na uzyskaniu na ich powierzchni ekspresji receptora określonych chemokin [106]. Guzy lite uwalniają bardzo wiele różnych cząsteczek w celu stłumienia układu odpornościowego i ochrony przed atakiem komórek T. Interleukina 12 jest cytokiną przeciwdziałającą immunosupresyjnemu środowisku nowotworu, silnie indukującą odpowiedź komórek wrodzonej i nabytej odporności. Skonstruowanie komórek CAR-T wytwarzających własną IL-12 może być bezpieczniejszym sposobem na pokonanie barier hamujących działanie przeciwnowotworowe [109]. Opracowywane są także limfocyty CAR-T anty-CD19 lub anty-MUC16 wydzielające IL-18, które wydają się regulować mikrośrodowisko zarówno nowotworów hematologicznych, jak i guzów litych oraz pomagają wzmocnić endogenne odpowiedzi przeciwnowotworowe komórek T [110]. Ponadto immunosupresyjne mikrośrodowisko guza charakteryzuje się m.in. dużą gęstością naczyń krwionośnych, rozległym przeciekiem naczyniowym, słabą integralnością struktury tkankowej, a zmiany te z kolei skutkują niedotlenieniem, niskim pH czy właśnie większą liczbą cytokin pochodzących z guza [111–113]. U pacjentów z guzami litymi terapia CAR-T osiągnęła najbardziej satysfakcjonujące wyniki w przypadku glejaków [114–117]. Jednak nawet tu pozostaje do przezwyciężenia wiele problemów, takich jak utrata antygenu na przykładzie EGFRvIII [118]. Obecnie prowadzone są już badania przedkliniczne i kliniczne nad zastosowaniem w przypadku glejaka m.in. bispecyficznych CAR-T przeciw HER2 i L-13Rα2 [119].

EGFRvIII i CAR-T

Doskonałym celem dla CAR-T wydaje się EGFRvIII. Stwierdzono, że jest on bardzo potrzebny komórkom nowotworowym jako konstytutywnie aktywny receptor [120]. Ponadto jest to mutant EGFR, który ma charakterystyczny epitop. Epitop ten znajduje się w części nadbłonowej tego mutanta i udało się otrzymać przeciwciała rozpoznające go bardzo specyficznie [121, 122]. Niestety kolejne badania sugerują, że EGFRvIII może być mocno problematycznym celem dla CAR-T. Badania EGFRvIII trwają od wielu lat. Początkowo wydawało się, że jest to klasyczny onkogen, który jest aktywny pod nieobecność liganda (EGF, TGF-α). W tym przypadku sugerowano, że EGFRvIII dimeryzuje z łatwością i dochodzi do trans­dukcji sygnału [123]. Ponadto odkryto, że dimeryzacja ta jest kowalencyjna dzięki temu, że po mutacji każdy z monomerów ma wolną cysteinę [124]. Kolejne badania znacznie skomplikowały ten obraz. Część wyników sugeruje, że dochodzi nie do homodimeryzacji, ale heterodimeryzacji EGFRvIII z EGFR aktywowanym przez EGF [125]. Zauważono, że aktywność kinazy tyrozynowej EGFRvIII jest na tyle niska, że sugeruje się powolny wpływ na komórki polegający na ich stopniowym epigenetycznym reprogramowaniu [126]. Ponieważ EGFRvIII ma niską aktywność kinazy, poszukiwano nawet jego wpływu jako kofaktora dla czynników transkrypcyjnych działających w jądrze komórkowym. Wiadomo zresztą, że o podobne wpływy podejrzewa się również sam EGFR [127]. Inne badania wskazały, że EGFRvIII może nawet aktywować HGFR za pomocą platformy białek zależnych od FAK [128]. Wszystkie te badania wskazują jednak, że aktywność EGFRvIII jest ciągle enigmatyczna, a to może oznaczać również, że w niektórych komórkach iluzoryczna. Trudności w wykryciu wyraźnej funkcji EGFRvIII powodują, że zaczynają pojawiać się wątpliwości na temat tego, czy jest to białko, które wpływa w sposób zdecydowany na biologię komórki nowotworowej na wszystkich etapach nowotworzenia [129]. Wątpliwości te potęguje to, że EGFRvIII ulega ekspresji tylko w niektórych komórkach nowotworu, który jako taki wykazuje jego ekspresję. Można dojść do wniosku, że rola EGFRvIII jest bardzo znikoma [130]. Z genetycznego punktu widzenia łatwo wytłumaczyć, dlaczego EGFRvIII jest obecny tylko w części komórek. EGFRvIII stwierdza się tylko w części komórek nowotworowych, ponieważ jego obecność wynika z amplifikacji ekstrachromosomalnej. Powoduje to, że amplikony takie ma tylko część komórek danego nowotworu [131]. W tej sytuacji pojawia się pytanie, co się stanie, jeśli CAR-T doprowadzi do eliminacji tych części komórek guza, które wykazują ekspresję EGFRvIII. Wraca w tym miejscu również kwestia tego, czy EGFRvIII jako białko ma silną aktywność biologiczną czy nie. Niski odsetek komórek z EGFRvIII i słaba aktywność tego receptora wydają się stanowić element spójny w hipotezie mówiącej, że jego rola jest znikoma i być może przejściowa, np. tylko na wczesnym etapie powstawania nowotworu [132]. Tymczasem warunkiem doboru celu dla CAR-T jest poważna rola tego antygenu i to, że komórki nowotworowe nie mogą funkcjonować pod jego nieobecność. Hipotetycznie EGFRvIII może występować na nowotworowych komórkach macierzystych [133]. Jeśli to prawda, to wtedy niski odsetek komórek EGFRvIII nie stanowi wady, ale nawet zaletę. Po terapii CAR-T dochodziłoby początkowo do zaniku tylko niewielkiego procentu komórek nowotworowych. Co jest korzystne, bo masywna liza w obrębie ośrodkowego układu nerwowego (OUN) może być bardzo niebezpieczna. Następnie po eliminacji komórek macierzystych, w domyśle EGFRvIII-pozytywnych, dochodziłoby do stopniowego zaniku całego nowotworu [134]. Pojęcie nowotworowej komórki macierzystej ostatnio ewoluuje lub nawet jest uznawane za nieprzystające do realiów biologii nowotworów [135]. Dodatkowo jest ono komplikowane właśnie przez takie procesy, jak amplifikacja ekstrachromosomalna, ponieważ plastyczność genetyczna komórek wynikająca z tego typu amplifikacji jest znacznie zwiększona [136]. Można obserwować różną liczbę kopii jakiegoś genu w obrębie amplikonów, następnie różną liczbę amplikonów w komórce nowotworowej i co najważniejsze – różne zestawy amplikonów, z różnymi onkogenami w różnych komórkach [137]. Amplikony mogą być wytracane. Dzieje się tak chociażby dlatego, że ich rozdział w czasie mitozy nie jest regulowany tak jak chromosomów, ale losowy [138]. Prawdopodobnie mogą być również nawet nabywane przez komórki, które ich nie mają za pośrednictwem pęcherzyków komórkowych – „infekowanie amplikonami” [136]. Amplikony EGFRvIII faktycznie wpisują się w taki scenariusz, jednak w porównaniu z wątpliwościami co do jego aktywności jako receptora jest to dość ryzykowna koncepcja [129]. Ponadto istnieją również przesłanki przeciwko tej hipotezie. Przykładowo wznowy glejaków wielopostaciowych, których zmiany pierwotne wykazywały ekspresję EGFRvIII, w około 30% nie mają tego mutanta [132]. Co gorsza w nowotworach innych niż glejaki odsetek komórek EGFRvIII-pozytywnych jest bardzo znikomy. Stanowi to przesłankę dla hipotezy, że EGFRvIII jest ważny na wczesnym etapie tumorogenezy [129]. Niestety sukcesem nie zakończyły się również badania nad szczepionką terapeutyczną przeciwko glioblastoma, w której wykorzystano epitop EGFRvIII [139]. Podsumowując, EGFRvIII może być dobrym celem dla CAR-T, pod warunkiem że ma konkretną rolę biologiczną i że komórki, które wykazują jego ekspresję, to nowotworowe komórki macierzyste albo ogólnie komórki, od których nowotwór jest zależny. Istnieją poważne wątpliwości, czy tak jest.

Zastosowanie CAR-T w chorobach nienowotworowych

Terapia komórkami cytotoksycznymi CAR-T cechuje się imponującą skutecznością w leczeniu nowotworów, zwłaszcza układu krwionośnego, jednak mogą one znaleźć zastosowanie także w leczeniu chorób nienowotworowych, takich jak choroby infekcyjne, alergiczne czy astma. Choroby alergiczne i astma Choroby alergiczne, a także astma, cechują się przewagą odpowiedzi immunologicznej typu Th2, która może być modulowana przez limfocyty T regulatorowe CD4+ – Treg [140]. Limfocyty B także odgrywają ważną rolę w patogenezie chorób alergicznych poprzez wytwarzanie immunoglobulin typu E, co czyni je atrakcyjnym celem dla komórek CAR-T. Głównym czynnikiem odpowiedzialnym za wszczęcie reakcji alergicznych jest wiązanie IgE z odpowiednim receptorem IgE. U ludzi istnieją trzy różne receptory IgE: receptor IgE o niskim powinowactwie – FcεRII (CD23), galektyna 3 o niskim powinowactwie lub białko wiążące epsilon (eBP) oraz receptor o wysokim powinowactwie do IgE – FcεRI [2]. Receptor FcεRI jest obecny na komórkach tucznych, eozynofilach i bazofilach, które odpowiadają za uwalnianie mediatorów stanu zapalnego i degranulację, co powoduje reakcje nadwrażliwości typu I i objawy alergiczne [141]. Wykazano, że celem dla komórek CAR-T mogą być komórki, które wykazują ekspresję IgE, zwłaszcza jego transbłonowej formy (mIgE). Takimi komórkami są komórki B ośrodka rozmnażania (germinal center B cells – GCB), plazmoblasty, komórki plazmatyczne lub limfocyty pamięci. Na potwierdzenie tej teorii zaprojektowano i przebadano in vitro komórki CAR, zawierające zewnątrzkomórkową domenę łańcucha α FcεRI (FcεRIα) skierowaną przeciwko mIgE [141]. Krążące w płynach biologicznych i tkankach IgE mogą wiązać CAR i blokować ich interakcje z mIgE w tkankach docelowych. W celu rozwiązania tego problemu można zastosować mutanty FcεRIα o niskim powinowactwie. Udowodniono także, że oparte na FcεRIα CD8+ komórki CAR-T o niskim powinowactwie są zdolne do pośredniczenia w silnych odpowiedziach pierwotnych komórek T na komórki docelowe wykazujące obecność mIgE [141].
Rozpuszczalny CD23 (sCD23), który pochodzi z CD23 związanego z błoną limfocytów B, zwiększa produkcję IgE i nasilenie astmy. Dlatego zastosowanie CAR-T w celu zmniejszenia poziomu sCD23 może mieć znaczenie terapeutyczne u pacjentów z chorobami alergicznymi, w tym astmą [142]. Patogeneza astmy alergicznej wiąże się ze zbyt małą liczbą Treg i zmniejszoną aktywnością immunosupresyjną, a także z nadmiernymi odpowiedziami na alergeny zdominowanymi przez komórki Th2, prowadzącymi do zapalenia dróg oddechowych, nadreaktywności dróg oddechowych (airway hyper responsiveness – AHR) i odwracalnej niedrożności [143]. Leki rozszerzające oskrzela i leki przeciwzapalne mogą łagodzić objawy u większości pacjentów, ale nie mogą całkowicie wyleczyć astmy. Podjęto próbę przekierowania Treg do płuc i zainicjowania ich aktywacji przez CAR, który rozpoznaje glikoproteinę obecną na powierzchni nabłonka adenozyny – carcinoembryonic antigen (CEA) w płucach i przewodzie pokarmowym. Anty-CEA CAR-Treg testowano in vitro oraz na mysim transgenicznym modelu astmy CEA. Wyniki wykazały zmniejszone AHR i zmniejszone eozynofilowe zapalenie dróg oddechowych. Komórki CAR-Treg zapobiegały ponadto nadmiernemu wytwarzaniu śluzu w płucach, a także wzrostowi poziomu cytokin swoistych dla alergenu IgE i Th2 u narażonych zwierząt [143]. W tym samym badaniu wykazano, że CAR-Treg były skuteczniejsze niż niemodyfikowane Treg w kontrolowaniu ciężkiej astmy alergicznej. Ciężka astma wynikająca z nadwrażliwości na grzyby i alergiczna aspergiloza oskrzelowo-płucna (AAOP) obejmują dwie podgrupy pacjentów z ciężką astmą alergiczną, których przyczyną są grzyby z rodzaju Aspergillus [144]. Komórki CAR-T zdolne do rozpoznawania antygenu – epitopów węglowodanowych na powierzchni grzyba Aspergillus – można otrzymać przy zastosowaniu zewnątrzkomórkowej domeny receptora rozpoznającego wzorce (PRR) – dektyny-1 (D-CART). Na podstawie wyników eksperymentów in vitro i in vivo stwierdzono, że komórki D-CAR-T mogą bezpośrednio blokować wzrost strzępek grzybni Aspergillus. Dodatkowo, aby zwiększyć tolerancję organizmu na modyfikowane komórki w leczeniu niegrzybiczych chorób alergicznych można stosować CAR-Treg razem z przeciwgrzybiczymi komórkami CAR-T [145]. W innym badaniu oceniano terapeutyczną rolę pierwszej i drugiej (CD137/CD3ζ) generacji komórek CAR-T ukierunkowanych na IL13Rα u pacjentów z glejakiem i glejakiem złośliwym [146]. Ze względu na rolę IL-13 w patogenezie astmy alergicznej receptor IL-13 może być dobrym celem do budowy komórek CAR-T do leczenia astmy. Wybór odpowiedniego antygenu docelowego, który pomógłby w przekierowaniu komórek Treg do dróg oddechowych w astmie, wymaga jednak dalszych badań [147].

Choroby zakaźne

Atrakcyjnymi komórkami CAR w terapii chorób zakaźnych są limfocyty T CD8+, których głównym zadaniem jest eliminowanie zainfekowanych komórek [148]. Ich zastosowanie może być użyteczne u pacjentów z przewlekłym wirusowym zapaleniem wątroby typu B (WZW typu B), spowodowanym przez wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV), którzy zwykle nie rozwijają wystarczająco silnej odpowiedzi immunologicznej, co może prowadzić do rozwoju raka wątroby [149]. Białka otoczki – S, M i L – razem tworzą antygen na powierzchni komórek HBV (HBsAg), który jest eksponowany na powierzchni zainfekowanych komórek. Stworzono i zbadano komórki CAR-T z receptorem domeny S (S-CAR) dla wszystkich 3 białek otoczki. Zauważono, że liczba hepatocytów, które w cytoplazmie wykazywały ekspresję białka rdzeniowego HBV, liczba wirionów krążących we krwi oraz replikacyjnych form DNA HBV zmniejszyły się u myszy po wprowadzeniu do ich organizmu komórek S-CAR. Po pewnym czasie odnotowano jednak wyczerpanie komórek S-CAR-T oraz wzrost aktywności wirusa poprzez wywołanie odpowiedzi immunologicznej przeciwko ludzkim domenom S-CAR. Trwały efekt przeciwwirusowy uzyskano dopiero w przypadku wprowadzenia S-CAR do specjalnie immunokompetentnych myszy, które tolerowały alogeniczne domeny CAR [150]. W innym badaniu zaprojektowano CAR specyficzny dla HBsAg, a następnie oceniono jego zdolność do rozpoznawania komórek HBV-pozytywnych i cząstek HBsAg in vitro, badając skuteczność przeciwko hepatocytom zakażonym HBV w chimerycznym mysim modelu ludzkiej wątroby [151]. Wykazano, że komórki CAR-T anty-HBs-G4m rozpoznają cząsteczki HBsAg i komórki HBV+ in vitro i skutecznie obniżają poziomy HBV-DNA i HBsAg in vivo, ale nie zabijają ich poprzez działanie cytotoksyczne. Inną chorobą zakaźną, w której zastosowanie mogą znaleźć komórki CAR jest przewlekłe zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV). U pacjentów w końcowym stadium przewlekłego zakażenia, którzy nie reagują na obecnie dostępne terapie, lekarze zalecają przeszczep wątroby. W wielu przypadkach występuje wysokie ryzyko ponownej infekcji po zakończonym leczeniu WZW typu C, co oznacza potrzebę opracowania alternatywnych metod terapeutycznych [152]. Opracowano komórki CAR-T rozpoznające glikoproteinę HCV E2 (HCV/E2), która jest jednym z najbardziej zmiennych białek wirusowych eksponowanych na powierzchni zakażonych komórek, a także głównym celem odpowiedzi immunologicznej gospodarza [153]. Komórki anty-HCV/E2 CAR-T wykazały znaczną aktywność cytotoksyczną w stosunku do komórek zakażonych HCV. Także wirus grypy A, który był przyczyną zarówno ptasiej, jak i świńskiej grypy, przebadano pod kątem potencjalnego zastosowania terapeutycznego dla komórek CAR-T [154]. Celem dla tych komórek może być konserwatywny region białka M2, który wykazywał ekspresję na powierzchni zakażonych komórek zarówno w doświadczeniach in vitro, jak i in vivo, czego skutkiem było zmniejszenie miana wirusa w płucach myszy po wprowadzeniu do ich organizmu komórek CAR-T.

COVID-19

Możliwość wykorzystania modyfikowanych komórek odpornościowych przeciwko komórkom zainfekowanym przez wirusa wzbudza ostatnio zainteresowanie wśród naukowców w kontekście leczenia choroby COVID-19. Obiecujące rozwiązanie opiera się na limfocytach efektorowych wrodzonej odporności – komórkach naturalnych zabójców (NK), których głównym zadaniem jest unicestwianie komórek nowotworowych oraz zakażonych wirusem. Komórki NK działają poprzez bezpośrednie rozpoznawanie białek wirusowych lub hamowanie sygnalizacji receptora NK w przypadku obniżonej ilości MHC klasy I na powierzchni zakażonej komórki [155]. Próby modyfikacji komórek NK polegały na ich ukierunkowaniu przeciwko białku wypustowemu (białku S) SARS-CoV-2 poprzez domenę CR3022 scFv, która jest silnym przeciwciałem neutralizującym dla SARS-CoV-1 i SARS-CoV-2 [156]. Dowiedziono, że komórki CR3022-CAR-NK były w stanie wyeliminować komórki zakażone SARS-CoV-2 in vitro. Obecnie istnieje tylko jedno badanie kliniczne (NCT04324996) oceniające bispecyficzne komórki NKG2D-ACE2 CAR-NK jako obiecującą terapię COVID-19. NKG2D to uniwersalny aktywujący receptor komórek NK, który rozpoznaje zakażone komórki, podczas gdy ACE2 jest receptorem wiążącym białko S wirusa SARS-CoV-2.

Zwłóknienie serca

Zwłóknienie jest procesem patologicznym związanym najczęściej z nadmiernym odkładaniem macierzy zewnątrzkomórkowej w mięśniu sercowym, a także hiper­aktywacją i ekspansją fibroblastów, co powoduje zgrubienie zastawek serca. Przerost zastawek oraz utrata elastyczności mogą skutkować zawałem mięśnia sercowego, co może prowadzić do dalszego zwłóknienia i pogłębić jego niewydolność. Obecnie nadal nie istnieje dostępna terapia celowana w leczeniu włóknienia mięśnia sercowego. Opracowano CAR-T, które celują w aktywowane fibroblasty serca poprzez rozpoznanie białka aktywacji fibroblastów (FAP) u myszy z indukowanym nadciśnieniem uszkodzeniem serca i zwłóknieniem [157, 158]. Okazało się, że komórki anty-FAP CAR-T powodują znaczne zmniejszenie lub nawet całkowitą eliminację włóknienia mięśnia sercowego, a nawet mogą wywołać częściowe przywrócenie skurczowej i rozkurczowej funkcji serca bez żadnych skutków ubocznych.

Podziękowanie

Publikacja finansowana ze środków Agencji Badań Medycznych w ramach projektu Polish Chimeric Antigen Receptor T-cell Network, numer 2020/ABM/04/00002.

Konflikt interesów

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Piśmiennictwo