The A/G (–5) polymorphism in the promoter region of the metallothionein 2A gene and breast ductal carcinoma

Wstęp
Metalotioneiny (ang. metallothionein – MT) to grupa białek wewnątrzkomórkowych charakteryzujących się niską masą cząsteczkową (6–7 kDa), wysoką zawartością reszt cysteiny, które stanowią ok. 30% wszystkich aminokwasów, oraz brakiem aminokwasów aromatycznych [1–4]. Metalotioneiny mają zdolność do wiązania różnych metali, w tym cynku, kadmu, rtęci, miedzi i bizmutu [5]. Białka te odpowiadają za homeostazę jonów cynku i miedzi, detoksykację metali ciężkich (zwłaszcza Cd i Hg) oraz ochronę przed uszkodzeniami oksydacyjnymi i apoptozą [5–7]. Podział MT na rodziny, podrodziny, podgrupy i izoformy jest związany z podobieństwem sekwencji i pokrewieństwem filogenetycznym. Metalotioneiny w komórkach człowieka kodowane są przez rodzinę 10 genów [2, 5]. W przypadku nowotworów piersi ekspresja MT zachodzi zarówno w komórkach mioepitelialnych, jak i nabłonkowych. W procesie uzłośliwiania się nowotworu piersi dochodzi do zaniku komórek mioepitelialnych, co może ułatwić progresję raka przewodowego [8, 9]. W przypadku nieobecności komórek mioepitelialnych w guzie może dochodzić do kompensowania braku wydzielanych przez nie czynników wzrostu i MT w wyniku wielu zmian zachodzących w komórkach epitelialnych. Zalicza się do nich nadekspresję receptora dla TGF-a (ang. transforming growth factor a) i receptora dla bFGF (ang. basic fibroblast growth factor) oraz ektopowe wydzielanie bFGF i ekspresję genów metalotionein. Procesy te powodują przyspieszenie rozwoju nowotworu [9]. Metalotioneina MT-2A osiąga największe stężenie spośród wszystkich izoform MT ulegających ekspresji w nowotworach piersi [2, 10]. Poziom ekspresji MT-2 jest pozytywnie skorelowany z aktywnością proliferacyjną komórek. Wykazano, że nadekspresja MT-2A powoduje 2-krotny wzrost liczby podziałów komórkowych, podczas gdy w przypadku nadekspresji MT-1E i MT-3 nie obserwowano takiego efektu [2]. Potwierdzeniem związku MT-2A z proliferacją komórek jest korelacja między poziomem ekspresji tej izoformy metalotionein i ekspresją Ki-67, białka będącego markerem proliferacji. Zarówno stężenie MT-2A, jak i mRNA dla tej izoformy jest wyższe w nowotworach bardziej zaawansowanych niż w nowotworach w niższych stadiach. Silna korelacja między ekspresją MT-2A a aktywnością proliferacyjną nowotworów piersi wskazuje na potencjalne znaczenie tej izoformy w nowotworzeniu. Dane literaturowe wskazują, że zamiana adeniny na guaninę w pozycji (–5) w obszarze promotorowym genu metalotioneiny 2A może w istotny sposób wpływać na oddziaływanie promotora z czynnikami transkrypcyjnymi i tym samym na ekspresję genu MT-2A [11]. Celem pracy była analiza rozkładu genotypów i częstości alleli A/G (–5) regionu promotorowego genu metalotioneiny 2A w raku przewodowym piersi kobiet.
Materiał i metody
Materiał do badań stanowiła krew obwodowa pobrana od 75 pacjentek ze zdiagnozowanym rakiem przewodowym piersi (średnia wieku 53; przedział wiekowy 41–73 lata). Wszystkie nowotwory poddano ocenie histopatologicznej oraz klasyfikacji wg Blooma-Richardsona. Stwierdzono 18 przypadków raka w stopniu I, 48 w stopniu II i 9 w stopniu III. Materiałem kontrolnym do analiz były wymazy nabłonków pobrane z jamy ustnej 100 zdrowych ochotniczek z ujemnym wywiadem rodzinnym w kierunku choroby nowotworowej. Średnia wieku w grupie kontrolnej wynosiła 28 lat.
Izolowanie genomowego DNA
DNA izolowano z krwi obwodowej pobranej na EDTA (1,5 mg/ml) od chorych na raka przewodowego piersi oraz z wymazów zawierających nabłonki z jamy ustnej pobranych od kobiet zdrowych. Do ekstrakcji DNA zastosowano odpowiednio DNAzol (Life Technologies) oraz zestaw Sherlock AX (A & A Biotechnology). Czystość otrzymanych preparatów DNA określano metodą spektrofotometryczną, analizując widma absorbancji próbek w zakresie długości fali 230–300 nm. Przyjętym kryterium czystości DNA była wartość A260/A280 mieszcząca się w granicach 1,8–2,0.
Amplifikacja DNA i detekcja alleli
Reakcje PCR przeprowadzano w mieszaninie reakcyjnej o objętości 7,5 ml zawierającej 100 ng genomowego DNA, 0,06 ml polimerazy AmpliTaq Gold™ DNA (Applied Biosystems); 0,75 ml 1 × GeneAmp® PCR buforu (Applied Biosystems); 0,75 ml mieszaniny GeneAmp dNTP (Applied Biosystems), 0,75 ml chlorku magnezu (Applied Biosystems), 0,8 ml każdego ze starterów (stężenie 5 pM). Polimorfizm został określony przy zastosowaniu następujących starterów: 5’-AAGACCTTCTAGCACCACCG-3’; 5’ TGGGCATCCCCAGCCTCTTA 3’. Jeden ze starterów użyty do reakcji amplifikacji wyznakowano znacznikiem fluorescencyjnym FAM. Analizy jakościowej fragmentów amplifikacji dokonano z zastosowaniem programu komputerowego GeneScan Analysis Software wer. 3.7 (Applied Biosystems). Jako kontrolę poprawności oznaczeń użyto CEPH control DNA 1347–02 (Applied Biosystems).
Reakcja sekwencjonowania
Sekwencjonowaniu poddano próbki z wybranymi allelami różniące się pomiędzy sobą wielkościami fragmentów. Każdy badany allel oddzielnie poddano ponownej amplifikacji. Do sekwencjonowania wykorzystano zestaw ABI Prism BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems), zgodnie z instrukcją producenta. Produkty sekwencjonowania oczyszczano przez wytrącanie 95-procentowym etanolem w obecności 3 M octanu sodu. Po 20 min inkubacji w temperaturze pokojowej próbki wirowano przy 14 tys. rpm przez 20 min. Usuwano supernatanty, a produkty przemywano 70-procentowym etanolem. Po usunięciu etanolu i wysuszeniu produkty zawieszano w 12 ml dejonizowanego formamidu i denaturowano przez 2 min w 95°C, a następnie schładzano w lodzie. Tak przygotowane produkty rozdzielano w automatycznym sekwenatorze DNA ABI PRISM 377 (Applied Biosystems) i analizowano przy zastosowaniu programu komputerowego DNA Sequencing Analysis Software v. 3.4.1. (Applied Biosystems).
Wyniki
Analizowano rozkład genotypów oraz częstość alleli A/G (–5) regionu promotorowego genu metalotioneiny 2A w grupie pacjentek ze zdiagnozowanym rakiem przewodowym piersi oraz kobiet zdrowych stanowiących grupę kontrolną (tab. I). Nie wykazano istotnej statystycznie różnicy w rozkładzie genotypów i częstości alleli między grupą badaną i kontrolną. Wartości ilorazu szans (OR) również wskazują na brak związku między badanym polimorfizmem A/G (–5) genu metalotioneiny 2A i występowaniem przewodowego raka piersi. Ponadto przeprowadzono analizę rozkładu genotypów oraz częstości występowania alleli w grupach pacjentek o różnym stopniu zaawansowania nowotworu. Grupę chorych na nowotwory w stopniu I, II oraz III porównano między sobą (tab. II, III). Nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic pomiędzy rozkładami genotypów w grupach o różnym stopniu zaawansowania nowotworu a rozkładem przewidywanym przez prawo Hardy’ego-Weinberga (p>0,05). Nie stwierdzono różnic w częstościach występowania alleli A i G pomiędzy badanymi grupami (p>0,05).
Dyskusja
Metalotioneiny stymulują proliferację komórek nowotworowych i hamują apoptozę poprzez aktywację czynnika NF-kB, obniżenie aktywności białka p53 i ekspresję efektorowego białka apoptozy Bax [12, 13]. Niski stopień zaawansowania raka piersi wiąże się z niższą ekspresją MT. Ekspresja MT w komórkach inwazyjnego przewodowego raka piersi jest charakterystyczna dla bardziej agresywnej postaci tego nowotworu. Nadekspresja MT w wielu nowotworach, w tym w nowotworach piersi, wiąże się ze złymi rokowaniami dla pacjentów [14]. Białka te mogą również odgrywać rolę w oporności na terapię przeciwnowotworową [8, 15]. Jednym z prawdopodobnych mechanizmów, na drodze którego MT uczestniczą w oporności na leki przeciwnowotworowe, jest hamowanie przez MT apoptozy [15]. Metalotioneina MT-2 jest główną izoformą, która wydaje się związana z proliferacją komórek przewodowego raka piersi [10, 15]. Poziom ekspresji MT-2 jest pozytywnie skorelowany z aktywnością proliferacyjną komórek. Wykazano, że nadekspresja MT-2A powoduje 2-krotny wzrost liczby podziałów komórkowych, podczas gdy w przypadku nadekspresji MT-1E i MT-3 nie obserwowano takiego efektu [2]. Potwierdzeniem wpływu MT-2A na proliferację komórek jest korelacja między poziomem ekspresji tej izoformy metalotionein a ekspresją Ki-67, białka będącego markerem proliferacji. Zarówno stężenie MT-2A, jak i mRNA dla tej izoformy jest wyższe w nowotworach bardziej zaawansowanych niż w nowotworach o niższym stadium zaawansowania. Korelacja między ekspresją MT-2A a aktywnością proliferacyjną nowotworów piersi wskazuje na potencjalne znaczenie tej izoformy w nowotworzeniu. Rdzeń promotora genu MT-2 zawiera sekwencję TATA oraz regiony inicjatorowe, do których przyłącza się czynnik transkrypcyjny IID (ang. transcription factor IID – TFIID) będący częścią kompleksu preinicjacyjnego transkrypcji [5]. W regionie promotorowym znajdują się sekwencje odpowiedzi na glukokortykoidy (ang. glucocorticoid responsive element – GRE), odpowiedzi na stres oksydacyjny (ang. antioxidant responsive element – ARE) oraz sekwencja aktywowana przez czynnik transkrypcyjny STAT (ang. signal transducers and activator of transcription) [4, 5, 11]. W regionie promotorowym wszystkich genów MT znajduje się motyw bogaty w pary GC (GGGGCGGGG), z którym łączą się czynniki transkrypcyjne z rodziny Sp, w tym białko Sp1 (ang. specificity protein 1) [5]. W regulacji ekspresji genu MT-2 przez metale ciężkie biorą udział sekwencje MRE (ang. metal responsie element), które są również konieczne do transkrypcji tych genów na poziomie podstawowym. Sekwencje MRE (CTNTGC(G/A)CNCGGCCC) obecne są w wielu kopiach w regionach promotorowych genów MT u ssaków. W regionie promotorowym genu MT-2 stwierdzono występowanie 6 takich sekwencji. Z sekwencjami MRE oddziałuje zależny od cynku czynnik transkrypcyjny MTF-1 (ang. metal responsive transcription factor 1) [5, 11]. Jest on uznawany za główny czynnik transkrypcyjny regulujący ekspresję genu MT-2A [11, 16]. Analizowana w niniejszej pracy substytucja A®G mająca miejsce w pozycji (–5) w obszarze rdzenia promotora genu MT-2A jest jednocześnie miejscem zlokalizowanym w centrum sekwencji o najwyższej zgodności TGC(G/A)CNC, do której może przyłączać się czynnik transkrypcyjny MTF-1 [11]. Jak wykazały badania Kita i wsp. [11] polimorfizm A/G (–5) może mieć wpływ nie tylko na oddziaływanie MTF-1 z promotorem genu MT-2A, ale także obniżać aktywność transkrypcyjną tego genu i tym samym hamować syntezę MT-2A w odpowiedzi na stymulację obecnością metali ciężkich. Autorzy wykazali występowanie polimorfizmu A/G w pozycji (–5) promotora genu MT-2A u 18% spośród 119 przebadanych kobiet. Uzyskane przez autorów niniejszej pracy wyniki wskazują, że polimorfizm A/G (–5) genu MT-2A najprawdopodobniej nie jest związany ze zwiększonym ryzykiem zachorowania na przewodowego raka piersi kobiet ani też z progresją tej choroby. Przypuszczenia te wymagają jednak przeprowadzenia dalszych badań z udziałem większej populacji. Pracę wykonano przy udziale środków z grantu Prezydenta Miasta Łodzi (2007).
Piśmiennictwo
1. Cai L, Satoh M, Tohyama C, Cherian MG. Metallothionen in radiation exposure: its induction and protective role. Toxicology 1999; 132: 85-98. 2. Jin R, Huang J, Tan PH, Bay BH. Clinicopathological significance of metallothioneins in breast cancer. Pathol Oncol Res 2004; 10: 74-9. 3. Rigby KE, Stillman MJ. Structural studies of metal-free metallothionein. Biochem Biophys Res Commun 2004; 325:1271-8. 4. Sato M, Kondoh M; Recent studies on metallothionein: protection against toxicity of heavy metals and oxygen free radicals. Tohoku J Exp Med 2002; 196: 9-22. 5. Haq F, Mahoney M, Koropatnick J. Signaling events for metallothionein induction. Mutat Res 2003; 533: 211-26. 6. Himeno S. Application of metallothionein null cells to investigation of cadmium transport. J Inorg Biochem 2002; 88: 207-12. 7. Vašák M. Advances in metallothionein structure and functions. J Trace Elem Med Biol 2005; 19:13-7. 8. Gallicchio LM, Flaws JA, Fowler BA, Ioffe OB. Metallothionein expression in invasive and in situ breast carcinomas. Cancer Detect Prev 2005; 29: 332-7. 9. Jin R, Bay BH, Chow VT, et al. Significance of metallothionein expression in breast myoepithelial cells. Cell Tissue Res 2001; 303: 221-6. 10. Theocharis SE, Margeli AP, Klijanienko JT, Kouraklis GP. Metallothionein expression in human neoplasia. Histopathology 2004; 45: 103-18. 11. Kita K, Miura N, Yoshida M, et al. Potential effect on cellular response to cadmium of a single-nucleotide A®G polymorphism in the promoter of the human gene for metallothionein IIA. Hum Genet 2006; 120: 553-60. 12. Barnes NL, Ackland ML, Cornish EJ. Metallothionein isoform expression by breast cancer cells. Int J Biochem Cell Biol 2000; 32: 895-903. 13. Gruber BM. Czynnik transkrypcyjny NF-kB – nowa perspektywa w leczeniu nowotworów. Postępy Biochem 2004; 50: 118-30. 14. Douglas-Jones AG, Schmid KW, Bier B, Horgan K, Lyons K, Dallimore ND, Moneypenny IJ, Jasani B. Metallothionein expression in duct carcinoma in situ of the breast. Hum. Pathol 1995; 26: 217-22. 15. Cherian MG, Jayasurya A, Bay BH. Metallothioneins in human tumors and potential roles in carcinogenesis. Mutat Res 2003; 533: 201-9. 16. Westin G, Schaffner W. A zinc-responsive factor interacts with a metal regulated enhancer element (MRE) of the mouse metallothionein-I gene. EMBO J 1988; 7: 3763-70.