The activity of N-acetyl-β-D-hexosaminidase in serum and urine of patients with pancreatic cancer

Wstęp
Diagnostyka raka trzustki wykorzystuje metody obrazowe: USG i tomografię komputerową oraz markery białkowe towarzyszące rakowi trzustki: antygen kanceroembrionalny (CEA), antygen nowotworowy przewodu pokarmowego (CA 19-9) i węglowodanowy antygen nowotworowy (CA 50) [1, 2]. Nieliczne są natomiast informacje o przydatności badania aktywności enzymów płynów biologicznych w diagnostyce onkologicznej zmian nowotworowych, w tym raka trzustki. N-acetylo-β-D-heksozoaminidaza [HEX] (EC 3.2.1.52) jest lizosomalną egzoglikozydazą, która odszczepia reszty N-acetyloglukozoaminy lub N-acetylogalaktozoaminy z nieredukcyjnego końca łańcuchów oligosacharydowych glikolipidów, glikoprotein i proteoglikanów [3]. Zmiany aktywności HEX mogą wpływać na katabolizm i organizację komórek oraz istoty międzykomórkowej w chorobie nowotworowej. Choroba nowotworowa cechuje się wzmożoną proliferacją wynikającą z rozkojarzenia mechanizmów regulacyjnych oraz naprawczych, zabezpieczających prawidłowe dojrzewanie i podział komórek oraz różnicowanie, wzrost i odnowę tkanek, migrację komórek zmienionych nowotworowo oraz przebudowę i organizację struktury macierzy międzykomórkowej [4]. Celem naszych badań jest ocena przydatności oznaczania aktywności lizosomalnej egzoglikozydazy (HEX) w surowicy krwi i moczu w diagnostyce chorych z gruczolakorakiem trzustki (adenocarcinoma).
Materiał i metody
Badanie przeprowadzono za zgodą Komisji Bioetycznej Akademii Medycznej w Białymstoku (Nr zgody: R-I-003/153/2005). Krew z żyły łokciowej i mocz ze środkowego strumienia rannej porcji pobierano od 7 pacjentów (2 kobiet i 5 mężczyzn) w wieku od 44 do 74 lat (średnia 61,17±10,42 lat) z rozpoznanym gruczolakorakiem trzustki (adenocarcinoma), niepoddanych chemioterapii ani radioterapii, leczonych operacyjnie w I Klinice Chirurgii Ogólnej i Endokrynologicznej AM w Białymstoku, oraz 8 zdrowych mężczyzn w wieku od 22 do 31 lat (średnia 27,25±2,49 lat). Surowicę (po skrzepnięciu krwi) i mocz wirowano przy 4 000 x g w ciągu 10 min. Płyn nadosadowy przechowywano w temperaturze -20^oC. Aktywność HEX oznaczano metodą Chatterjee i wsp. [5] w modyfikacji Zwierza i wsp. [6]. Do 10 µl surowicy krwi lub moczu dodawano 40 µl 0,1 M buforu fosforanowo-cytrynianowego o pH 4,7 oraz 30 µl 20 mM roztworu substratu (p-nitrofenylo-β-D-N-acetyloglukozoaminopiranozydu, firmy Sigma USA) w 0,1 M buforze fosforanowo-cytrynianowym o pH 4,7. Mieszaninę inkubowano 60 min w temperaturze 37oC. Reakcję przerwano dodając 200 µl 0,2 M buforu boranowego o pH 9,8. Pomiaru p-nitrofenolu uwolnionego z p-nitrofenylo-β-D-N-acetyloglukozoaminopiranozydu dokonywano w 410 nm, za pomocą czytnika płytek EL_X800 i programu komputerowego KC junior firmy BIO-TEK. Białko w surowicy krwi oznaczano metodą biuretową [7]. Do 50 µl surowicy krwi dodawano 2 450 µl odczynnika biuretowego. Próby inkubowano przez 30 min w temperaturze pokojowej. Absorbancję powstałego kompleksu o barwie niebiesko-purpurowej mierzono za pomocą spektrofotometru Specol 221 przy długości fali 550 nm. Stężenie białka odczytano z krzywej wzorcowej sporządzonej z 0,05 proc. roztworu liofilizowanej albuminy wołowej (firmy POCH Gliwice, Polska) w 0,1 M buforze fosforanowo-cytrynianowym o pH 4,7. Białko całkowite w moczu oznaczano metodą Lowry [8]. Do 200 µl odpowiednio rozcieńczonego moczu dodawano 1 000 µl odczynnika miedziowego sporządzonego bezpośrednio przed wykonaniem oznaczenia. Po 10 min do mieszaniny dodawano stale mieszając na wytrząsarce 100 µl odczynnika Folina i Ciocalteau. Próby inkubowano przez 30 min w temperaturze pokojowej. Absorbancję powstałego kompleksu o barwie niebiesko-purpurowej mierzono za pomocą spektrofotometru Specol 221 przy długości fali 750 nm. Stężenie białka odczytano z krzywej wzorcowej sporządzonej z 30 mg liofilizowanej albuminy wołowej firmy POCH Gliwice, Polska w 100 ml 0,25 M roztworze sacharozy. Stężenie aktywności HEX w surowicy krwi i moczu wyrażono w pKat/mL, a aktywność specyficzną w pKat/mg białka. Do analizy statystycznej testem Manna-Whitney’a wykorzystano pakiet statystyczny SPSS^®8.0 for Windows PL (SPSS, Chicago, IL, USA). Za poziom istotności statystycznej przyjęto p<0,05.
Wyniki
Stężenie aktywności HEX w surowicy krwi chorych z gruczolakorakiem trzustki wynosiło od 440,81 do 1 725,57 pKat/mL (średnio 845,52±449,51 pKat/mL), a w surowicy krwi zdrowych mężczyzn od 221,49 do 380,44 pKat/mL (średnio 270,78±60,93 pKat/mL) – ryc. 1. Jak wynika z ryc. 1. stężenie aktywności HEX w surowicy chorych na raka trzustki było istotnie wyższe w porównaniu do aktywności HEX w surowicy zdrowych mężczyzn (p<0,02). Nie było istotnych statystycznie różnic (p=0,3947) między stężeniem białka w surowicy krwi chorych z rakiem trzustki (7,30–9,13 mg/mL, średnio 7,8±0,71 mg/mL) i surowicy krwi zdrowych mężczyzn (7,50–9,00, średnio 8,24±0,51 mg/mL) oraz między stężeniem w moczu (p=0,9626) chorych z rakiem trzustki (111,00–206,00 mg/mL, średnio 150,00±32,12 mg/mL) i zdrowych mężczyzn (52,50–218,00 mg/mL, średnio 150,69±57,82 mg/mL) – ryc. 2. Aktywność specyficzna HEX w surowicy krwi chorych z gruczolakorakiem trzustki wynosiła od 48,31 do 214,36 pKat/mg białka (średnio 107,06±56,73 pKat/mg białka), a w surowicy krwi zdrowych mężczyzn od 26,55 do 47,56 pKat/mg białka (średnio 33,08±8,50 pKat/mg białka). Aktywność specyficzna HEX w moczu chorych z gruczolakorakiem trzustki wynosiła od 0,93 do 4,10 pKat/mg białka (średnio 2,55±1,27 pKat/mg białka), a w moczu zdrowych mężczyzn od 0,70 do 1,33 pKat/mg białka (średnio 1,03±0,29 pKat/mg białka) – ryc. 3. Jak wynika z ryc. 3. aktywność specyficzna HEX w surowicy krwi i moczu pacjentów z gruczolakorakiem trzustki jest istotnie wyższa od aktywności specyficznej HEX w surowicy i moczu zdrowych mężczyzn (p<0,02).
Omówienie wyników
Aktywność HEX stwierdzono w: nerce [9], wątrobie [10], błonie śluzowej żołądka i jelit [11], łożysku [12], a także w płynach biologicznych: surowicy krwi, moczu [9], płynie mózgowo-rdzeniowym [13] oraz płynie stawowym [14]. Podwyższoną aktywność HEX w surowicy krwi zaobserwowano u chorych z rakiem nerki [9]. Nasze wstępne badania wskazały na podwyższenie aktywności HEX w surowicy krwi chorych z gruczolakorakiem trzustki, w porównaniu do aktywności HEX w surowicy krwi osób zdrowych [15]. Potwierdzeniem poprzednio uzyskanych wyników są dane zamieszczone na ryc. 1. i 3., w których obok istotnie (p<0,02) wyższych stężeń aktywności i aktywności specyficznej HEX w surowicy krwi chorych na raka trzustki w porównaniu do zdrowych mężczyzn, stwierdzono istotny wzrost (p<0,02) aktywności specyficznej HEX w moczu w porównaniu do zdrowych mężczyzn. Jak wynika z ryc. 1. i 3., stężenie aktywności oraz aktywność specyficzna HEX w surowicy krwi chorych na raka trzustki są ponad 3 razy wyższe od stężenia aktywności oraz aktywności specyficznej HEX w surowicy krwi osób zdrowych. Aktywność specyficzna HEX w moczu chorych na raka trzustki jest ponad 2 razy wyższa od aktywności tego enzymu w moczu osób zdrowych. Stężenia aktywności HEX w surowicy krwi wskazują na wyraźną linię odcięcia między wartością liczbową najniższą (minimalną) chorych z rakiem trzustki – stężenie aktywności HEX=440,81 pKat/mL i aktywność specyficzna HEX=48,31 pKat/mg białka, a wartością liczbową najwyższą (maksymalną) zdrowych mężczyzn – stężenie aktywności HEX=380,44 pKat/mL i aktywność specyficzna HEX=47,56 pKat/mg białka. Podobnej zależności nie zaobserwowano w badaniu aktywności specyficznej HEX w moczu. Wykazanie obniżonej aktywności HEX w tkankach i surowicy krwi decyduje o rozpoznaniu genetycznych chorób Tay-Sachsa i Sandhoffa [3]. Oznaczanie aktywności HEX w moczu znalazło zastosowanie w monitorowaniu nefrotoksyczności leków [18, 19], stanu czynnościowego nerki po transplantacji [20] i monitorowaniu stanu zdrowia pacjentów z nowotworami nerek [9]. Wykazano, że na aktywność HEX nie wpływają wahania dobowe ilości wydalanego moczu, kwaśne pH, czy obecność elementów morfotycznych [16, 17]. Reasumując – łatwość oraz niskie koszty oznaczenia HEX w surowicy i moczu predestynują do zastosowania HEX w rozpoznaniu, różnicowaniu i monitorowaniu leczenia nowotworów złośliwych, w tym gruczolakoraka trzustki.
Wnioski
Oznaczenie aktywności HEX w surowicy krwi i moczu może być wykorzystane w diagnostyce gruczolakoraka trzustki.
Piśmiennictwo
1. Ozkan H, Kaya M, Cengiz A. Comparison of tumor marker CA 242 with CA 19-9 and carcinoembryonic antigen (CEA) in pancreatic cancer. Hepatogastroenterology 2003; 50: 1669-74. 2. Lygidakis NJ, Jain S, Sacchi M, Vrachnos P. Adenocarcinoma of the pancreas-past, present and future. Hepatogastroenterology 2005; 52: 1281-92. 3. Zwierz K, Juszkiewicz J, Arciuch L, Gindzieński A. N-acetylo-β-D-heksozoaminidaza – enzym chorób Tay-Sachsa i Sandhoffa. Post Bioch 1992; 38: 127-31. 4. Rubin E, Farber JL. Neoplasia. In: Rubin E, Farber JL (eds). Pathology. JB Lippincott Company, Philadelphia 1994. 5. Chatterjee S, Vellcer LL, Sweeley CC. Glycosphingolipid glycosylhydrolases and glycosidases of synchronized human KB cells. J Biol Chem 1975; 250: 4972-9. 6. Zwierz K, Gindzieński A, Głowacka D, Porowski T. The degradation of glycoconjugates in the human gastric mucous membrane. Acta Med Acad Hung 1981; 38: 145-52. 7. Dawson RMC, Elliott WH, Jones KM. Data of Biochemical Research. Oxford University Press, New York and Oxford 1969; second edition s. 618. 8. Kokot F. Metody badań laboratoryjnych stosowanych w klinice. PZWL, Warszawa 1969; s. 130. 9. Borzym-Kluczyk M, Darewicz B, Knaś M, Szajda SD, Sulik M, Olszewska E, Zwierz K. The activity of N-acetyl-b-glucosaminidase and its isoenzymes in the renal tissue, serum and urine of patients with renal cancer. Współcz Onkol 2005; 9: 287-90. 10. Elsafi ME, Hultberg B, Isaksson A, Hägerstrand J, Prytz H, Sternam U. Lysosomes and human liver diseases: a biochemical and immunohistochemical study of b-hexosaminidase. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1994; 32: 669-73. 11. Zwierz K, Zalewska A, Zoch-Zwierz W. Isoenzymes of N-acetyl-β-hexosaminidase. Acta Biochem Pol 1999; 46: 739-51. 12. Arciuch L, Bielecki D, Borzym M, Południewski G, Arciszewski K, Rózański A, Zwierz K. Isoenzymes of N-acetyl-b-hexosaminidase in complicated pregnancy. Acta Biochim Polon 1999; 46: 977-83. 13. Tucker SM, Pierce RJ, Price RG. Characterisation of human N-acetyl-beta-D-glucosaminidase isoenzymes as an indicator of tissue damage in disease. Clin Chim Acta 1980; 102: 29-40. 14. Popko J, Zalewska A, Sierakowski S, Macias T, Knaś M, Zwierz K, Średzińska K. Aktywność N-acetylo-beta-D-heksozoaminidazy w płynie stawowym i surowicy krwi chorych z reumatoidalnym zapaleniem stawów i artrozą. Przegl Lek 2005; 62: 650-2. 15. Szajda SD, Snarska J, Knaś M, Kamiński F, Siedlecka K, Raczkowski K, Kowalewska A, Zwierz K. Aktywność N-acetylo-β-D-glukozoaminidazy w surowicy krwi chorych z rakiem trzustki. 62. Zjazd Towarzystwa Chirurgów Polskich, 14-17 września 2005 r., Białystok, s. 142. 16. Chew SL, Lins RL, Daelemans R, Nuyts GD, De Broe ME. Urinary enzymes in acute renal failure. Nephrol Dial Transplant 1993; 8: 507-11. 17. Costigan MG, Rustom R, Bone JM, Shenkin A. Origin and significance of urinary N-acetyl-beta-D-glucosaminidase (NAG) in renal patients with proteinuria. Clin Chim Acta 1996; 133: 133-44. 18. Gibey R, Dupond JL, Alber D, Floris RL, Henry JCh. Predictive value of urinary N-acetyl-β-D-glucosaminidase (NAG), alanine-aminopeptidase (AAP) and beta-2-microglobulin (B2 M) in evaluating nephrotoxicity of gentamycin. Clin Chim Acta 1981; 116: 25-34. 19. Gouyon JB, Aujard Y, Abisror A, Laudignon N, d’Athis P, Jacqz E. Urinary excretion of N-acetyl-glucosaminidase and beta-2-microglobulin as early markers of gentamycin nephrotoxicity in neonates. Dev Pharmacol Ther 1987; 10: 145-52. 20. Yuen CT, Corbett CR, Kind PR, Thompson AE, Price RG. Isoenzymes of urinary N-acetyl-β-D-glucosaminidase (NAG) in patients with renal transplants. Clin Chim Acta 1987; 164: 339-50.
Adres do korespondencji
dr n. med. Sławomir D. Szajda Zakład Biochemii Farmaceutycznej Akademia Medyczna ul. Mickiewicza 2A, 15-230 Białystok 8 tel. +48 85 748 56 90, +48 85 748 56 91 e-mail: spoak@amb.edu.pl