The assessment of the argyrophylic nucleolar organizer regions (AgNORs) count in serous ovarian neoplasms

Guzy pochodzące z nabłonka pokrywającego pierwotną jamę ciała stanowią najliczniejszą grupę nowotworów jajnika. Wśród nich znajduje się 80–85% pierwotnych guzów złośliwych tego narządu. Rak jajnika znajduje się na 4. miejscu wśród przyczyn zgonów na nowotwory złośliwe u kobiet. Odsetek 5-letnich przeżyć dla wszystkich stopni klinicznych tego nowotworu wynosi 30–40% i w ciągu ostatnich 30 lat nie uległ znaczącej poprawie. Najczęściej spotykanym typem histologicznym raka jajnika jest gruczolakorak surowiczy [1].
W procesie nowotworzenia ulega załamaniu równowaga między częstością podziałów komórkowych, a śmiercią komórek na korzyść procesów proliferacyjnych. Ukazały się liczne prace, których autorzy umieszczają ocenę proliferacji komórkowej guza wśród niezależnych czynników rokowniczych w chorobie nowotworowej [2, 3, 4, 5]. Wskazuje się m.in. na praktyczne znaczenie analizy ilościowej i morfologicznej srebrzonych stref organizatorów jąderkowych (AgNORs) oraz oceny ekspresji antygenów PCNA oraz Ki-67 w komórkach nowotworu [2, 6, 7, 8]. Dotychczas potwierdzono dużą wartość tych oznaczeń w odniesieniu do licznych nowotworów złośliwych (rak sutka, płuca, przewodu pokarmowego, trzonu i szyjki macicy, gruczołu krokowego, nowotwory ośrodkowego układu nerwowego i in.) [3, 4, 7, 9, 10]. W piśmiennictwie brakuje podobnych badań prowadzonych na reprezentatywnych i histologicznie jednorodnych grupach raków jajnika.


Cel pracy


Celem pracy było określenie przydatności analizy stref organizatorów jąderkowych (AgNORs) w ocenie stopnia złośliwości surowiczych nowotworów nabłonkowych jajnika.


Materiał i metody badań


Badaniem objęto 110 kobiet, operowanych w Instytucie Ginekologii i Położnictwa Uniwersytetu Medycznego w Łodzi od 1.01.1998 r. do 1.10.2002 r. z powodu surowiczych nowotworów nabłonkowych jajnika. W grupie badanej było 29 chorych z gruczolakami, 12 kobiet z guzami granicznymi i 69 chorych na raka jajnika. Stwierdzono 17 surowiczych raków w stopniu G-1 (24,6%), 21 nowotworów G-2 (30,4%) i 31 raków jajnika G-3 (45,0%). Średni wiek chorych z gruczolakiem surowiczym wynosił 46,276±19,701 lat, kobiet z surowiczym guzem granicznym 56,583±10,317 lat, a chorych na raka jajnika: 51,880±16,511 lat.
Każdorazowo wykonano i poddano ocenie histologicznej 2 grupy preparatów tkankowych z guza uzyskanego podczas operacji. Pierwszą grupę skrawków po odparafinowaniu barwiono hematoksyliną i eozyną i badano histopatologicznie. Drugą grupę odparafinowanych skrawków poddawano procedurze srebrzenia, a następnie badano w nich ilość ziarnistości AgNORs w komórkach nowotworu. W każdym preparacie srebrzonym wg Howella i Plotona poddano analizie średnią ilość stref organizatorów jąderkowych w komórkach nowotworu (mAgNOR) oraz odsetek komórek guza zawierających 5 lub więcej NORs (pAgNOR) ze 100 kolejnych jąder komórkowych oglądanych w mikroskopie świetlnym w powiększeniu 400 razy. Otrzymane wyniki opracowano statystycznie przy użyciu programu CSS Statistica (Statsoft Inc., Tulsa, OK., USA).


Wyniki


Oceniono zależność pomiędzy typem histologicznym surowiczego guza jajnika, a średnią ilością stref organizatorów jąderkowych w komórkach nowotworu (mAgNOR) oraz odsetkiem komórek nowotworu zawierających 5 lub więcej NORs (pAgNOR). Wyniki zestawiono w tab. I. oraz II.
Stwierdzono, że istnieją różnice istotne statystycznie w średniej ilości AgNORs (mAgNOR) oraz w odsetkach komórek nowotworu zawierających 5 lub więcej NORs (pAgNOR) pomiędzy gruczolakami, guzami granicznymi i rakami jajnika, a wśród raków pomiędzy guzami G1, G2 i G3 (w każdym przypadku p<0,05) (tab. I., tab. II.). Ustalono też, że występuje silna dodatnia korelacja między wzrostem mAgNOR oraz pAgNOR, a zwiększaniem się stopnia złośliwości surowiczych nowotworów jajnika od guzów łągodnych do raków jajnika. Uzyskane wartości współczynników korelacji r-Spearmana wynosiły odpowiednio: ρ= 0,850 (p<0,001) i ρ= 0,831 (p<0,001).
Stwierdzono występowanie silnej korelacji pomiędzy wartościami mAgNOR i pAgNOR w guzach łagodnych (ρ= 0,610; p<0,001) i w rakach jajnika (ρ= 0,899; p<0,001), natomiast nie uzyskano podobnej zależności w guzach o granicznej złośliwości (ρ= 0,442; ns).


Dyskusja


Strefy organizatorów jąderkowych to segmenty metafazowych chromosomów, wokół których podczas telofazy podziału komórkowego tworzą się jąderka. NORs (nucleolar organizer regions) zlokalizowane są w okolicach przewężeń wtórnych chromosomów akrocentrycznych, czyli chromosomów 13., 14., 15., 21. i 22. pary. W ich skład wchodzi DNA kodujące rybosomalny RNA, związane z niehistonowymi białkami, które odpowiadają liczbie i wielkości stref organizatorów jąderkowych i mogą być uwidocznione za pomocą srebrzenia. W mikroskopie świetlnym są one wtedy widoczne jako czarne lub ciemnobrązowe ziarnistości w obrębie jądra komórkowego. Uważa się, że metafazowe ziarnistości AgNORs są znacznikami aktywnych stref organizatorów jąderkowych, a więc odpowiadają tym genom rybosomalnym, które ulegają ekspresji podczas interfazy. Ilość stref organizatorów jąderkowych jest wyraźnie związana z fazą cyklu komórkowego, a zwiększone ich ilości wskazują, że większość komórek jest w fazie S-G2, a tylko niewielka ich część znajduje się w fazie G1. Jest to cecha charakterystyczna dla komórek szybko dzielących się. Do takich komórek należą komórki nowotworowe [11, 12, 13, 24].
Metoda AgNORs, czyli jednostopniowe srebrzenie koloidowe regionów organizatorów jąderkowych jest jedną z najczęściej stosowanych metod w celu oceny proliferacji komórkowej. Pierwsze doniesienia dotyczące jej zastosowania w diagnostyce nowotworów pochodzą z lat 80. [11, 12]. Od tego czasu obserwuje się stały wzrost zainteresowania tą tanią i prostą, a jednocześnie bardzo użyteczną metodą. W praktyce stosuje się dwie metody oceny AgNORs. Pierwsza z nich polega na ocenie średniej ilości stref organizatorów jąderkowych w komórkach nowotworu (mAgNOR), w drugiej natomiast oblicza się odsetek komórek nowotworu zawierających 5 lub więcej NORs (pAgNOR). Uważa się, że mAgNOR odpowiada ocenie ploidii nowotworu, natomiast pAgNOR odzwierciedla aktywność proliferacyjną guza [6]. W przeprowadzonym badaniu zaobserwowano duże podobieństwo pomiędzy zachowaniem się obu tych parametrów.
Metoda srebrzenia stref organizatorów jąderkowych znalazła już także zastosowanie w onkologii ginekologicznej. Uważa się, że wzbogacenie diagnostyki mikroskopowej zmian w szyjce macicy o srebrzenie skrawków wg metody AgNOR może mieć dużą wartość w ocenie transformacji nowotworowej zmian przedrakowych oraz w prognozowaniu klinicznego przebiegu choroby nowotworowej [14, 15]. Pojawiły się także doniesienia o istnieniu zależności pomiędzy parametrami ziarnistości AgNORs, a odpowiedzią raka szyjki macicy na radioterapię. W odniesieniu do raka trzonu macicy zaobserwowano, że może to być czynnik pomocny w ustalaniu przynależności chorych na ten nowotwór do grup wysokiego i niskiego ryzyka [7, 9, 1].
W piśmiennictwie pojawiły się również publikacje, mówiące o zastosowaniu oceny stref organizatorów jąderkowych w diagnostyce i monitorowaniu leczenia nowotworów jajnika [1, 6, 8, 10, 17, 18, 19]. Uważa się, że zarówno ilość zgrupowań ziarnistości, jak i pojedynczych AgNORs, wreszcie łączna liczba tych ziarnistości wykazują istotny wzrost od zmian łagodnych przez guzy graniczne do nowotworów złośliwych jajnika, co potwierdziło przeprowadzone przez nas badanie. Stwierdzenie, że ilość ziarnistości AgNORs, podobnie jak dla raków o innym niż jajnik umiejscowieniu, rośnie ze wzrostem stopnia zróżnicowania komórkowego nowotworu również znalazło potwierdzenie w naszym materiale [6, 17]. Wg większości autorów najsilniej wyrażone są powyższe zależności właśnie w surowiczych nowotworach jajnika [8, 10, 17].


Wnioski


1. Stwierdza się wzrost średniej ilości stref organizatorów jąderkowych w komórkach nowotworów (mAgNOR) i podobny wzrost odsetka komórek nowotworów zawierających 5 lub więcej NORs (pAgNOR) począwszy od gruczolaków, przez guzy o złośliwości granicznej do raków jajnika.
2. Ilość stref organizatorów jąderkowych jest jednym z czułych wykładników stopnia złośliwości surowiczych nowotworów nabłonkowych jajnika.
3. Występowanie powyższych zależności w połączeniu z prostą metodyką i niską ceną badania czynią z oceny AgNORs potencjalnie przydatną metodę dodatkową w diagnostyce surowiczych nowotworów nabłonkowych jajnika.


Piśmiennictwo

1. Markowska J. Rak jajnika. Springer PWN, Warszawa 1997: 9-10.
2. Ceccarelli C, Trere D, Santini D, et al. AgNORs in breast tumours. Micron 2000; 31 (2): 143-9.
3. Chiusa L, Galliano D, Formiconi A, et al. High and low risk prostate carcinoma determined by histologic grade and proliferative activity. Cancer 1997; 79 (10): 1956-63.
4. Costa Ad, de Araujo NS, Pinto Dd, et al. PCNA/AgNOR and Ki-67/AgNOR double staining in oral squamous cell carcinoma. J Oral Parhol Med 1999; 28 (10): 438-41.
5. Miller B, Umpierre S, Tornos C, et al. Histologic characterization of uterine papillary serous adenocarcinoma. Gynecol Oncol 1995; 56 (3): 425-9.
6. Ghazizadeh M, Sasaki Y, Araki T, et al. Prognostic value of proliferative activity of ovarian carcinoma as revealed by PCNA and AgNOR analyses. Am J Clin Pathol 1997; 107 (4): 451-8.
7. Howell WM, Black DA. Controlled silver-staining of nucleolus organizer regions with a protective colloidal developer: a 1-step method. Experimentia 1980; 36: 1014-5.
8. Terlikowski S, Lenczewski A, Sulkowska M, et al. Heterogenność nowotworów nabłonkowych jajnika w analizie ekspresji białek regionów organizatorów jąderkowych. Gin Pol 2000; 71 (9): 1194-7.
9. Miller B, Flax S, Dockter M, et al. Nucleolar organizer regions in adenocarcinoma of the uterine cervix. Cancer 1994. 15; 74 (12): 3142-5.
10. Sirri V, Roussel P, Hernandez-Verdun D. The AgNOR proteins: qualitative and quantitative changes during the cell cycle. Micron. 2000; 31 (2): 121-6.
11. Gryczyński M, Niewiadomska H, Kobos J, et al. Ekspresja wybranych wskaźników apoptozy, proliferacji i przerzutowości w ocenie dynamiki rozrostu raka krtani. Otolaryngol Pol 2000; 54 (6): 615-9.
12. Nakae S, Nakamura T, Ikegawa R, et al. Evaluation of argyrophilic nucleolar organizer region and proliferating cell nuclear antigen in colorectal cancer. J Surg Oncol 1998; 69 (1): 28-35.
13. Ploton D, Menager M, Jeannesson P, et al. Improvement in the staining and in the visualization of the argyrophilic proteins of the Nucleolar Organizer Regions at the optical level. Histochem J 1986; 18: 5-14.
14. Wierzchniewska A. Przydatność ilościowej oceny stref organizatorów jąderkowych (AgNORs) oraz niektórych parametrów morfometrycznych jądra komórkowego w diagnostyce różnicowej wybranych zmian patologicznych szyjki macicy. Praca doktorska. AM Łódź 1997.
15. Mauri FA, Scampini S, Aldovini D, et al. AgNOR distribution in serous tumours of the ovary. Pathologica 1990; 82 (1081): 487-92.
16. Miller B, Morris M, Silva E. Nucleolar organizer regions: a potential prognostic factor in adenocarcinoma of the endometrium. Gynecol Oncol 1994; 54 (2): 137-41.
17. Criscuolo M, Martinelli AM, Migaldi M, et al. Prognostic significance of nucleolar organizer regions in ovarian epithelial tumors. Int J Gynecol Pathol 1993; 12 (3): 259-63.
18. Kędzia W, Rutkowski R, Jankowska A, et al. Markery proliferacji oraz parametry morfoimmunologiczne w ocenie czynników rokowniczych w rakach błony śluzowej macicy. Gin Pol 1997; 68 (4): 199-205.
19. Terlikowski S, Sulkowski S, Lenczewski A, et al. Study of borderline and invasive mucinous ovarian tumors using Ki-67 (MIB 1) antibodies and nucleolar organizer region (NOR) staining. Arch Gynecol Obstet 1999; 263 (1-2): 29-33.


Adres do korespondencji

prof. dr hab. med. Jacek Suzin
I Klinika Ginekologii i Onkologii Ginekologicznej
Instytutu Ginekologii i Położnictwa
Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
ul. Wileńska 37
94-029 Łódź